Данные палеонтологии свидетельствуют о том, что самыми древними бобовыми культурами, имевшими клубеньки, были некоторые растения, принадлежащие к группе Eucaesalpinioideae.
У современных видов бобовых растений клубеньки обнаружены на корнях многих представителей семейства Рарilijоnасеае.
Филогенетически более примитивные представители таких семейств, как Caesalpiniaceae Mimosaceae, в большинстве случаев клубеньков не образуют.
Из 13 000 видов (550 родов) бобовых растений наличие клубеньков выявлено пока только приблизительно у 1300 видов (243 рода). Сюда в первую очередь относятся виды растений, использующиеся в сельском хозяйстве (более 200).
Сформировав клубеньки, бобовые растения приобретают способность усваивать атмосферный азот. Однако они способны питаться и связанными формами азота - солями аммония и азотной кислоты. Лишь одно растение - копеечник (Hedysarum coronarium) - ассимилирует только молекулярный азот. Поэтому без клубеньков в природе это растение не встречается.
Клубеньковые бактерии снабжают бобовое растение азотом, который фиксируют из воздуха. Растения же, в свою очередь, поставляют бактериям продукты углеводного обмена и минеральные соли, необходимые им для роста и развития.
В 1866 г. известный ботаник и почвовед М.С. Воронин увидел в клубеньках на корнях бобовых растений мельчайшие «тельца». Воронин выдвинул смелые для того времени предположения: он связал образование клубеньков с деятельностью бактерий, а усиленное деление клеток ткани корня с реакцией растения на проникшие в корень бактерии.
20 лет спустя голландский ученый Бейеринк выделил из клубеньков гороха, вики, чины, фасоли, сераделлы и лядвенца бактерии и изучал их свойства, проверив способность заражать растения и вызывать образование клубеньков. Он назвал эти микроорганизмы Bacillus radicicola. Поскольку к роду Bacillus относятся бактерии, образующие споры, а клубеньковые бактерии лишены этой способности, А. Пражмовский переименовал их в Bacterium radicicola. Б. Франк предложил более удачное родовое название клубеньковых бактерий - Rhizobium (от греч. rhizo - корень, bio - жизнь; жизнь на корнях). Это название привилось и используется в литературе до сих пор.
Для обозначения вида клубеньковых бактерий принято к родовому названию Rhizobium добавлять термин, соответствующий латинскому названию того вида растения, из клубеньков которого они выделены и на котором могут образовывать клубеньки. Например, Rhizobium trifolii - клубеньковые бактерии клевера, Rhizobium lupini - клубеньковые бактерии люпина и т.д. В тех случаях, если клубеньковые бактерии способны образовывать клубеньки на корнях разных видов бобовых растений, т. е. вызывать так называемое перекрестное заражение, видовое название является как бы собирательным - в нем отражена именно эта «перекрестно заражающая» способность. Например, Rhizobium leguminosarum - клубеньковые бактерии гороха (Pisum), чечевицы (Lens), чины (Lathyrus).
Морфология и физиология клубеньковых бактерий-для клубеньковых бактерий характерно поразительное разнообразие форм - полиморфность. На это обращали внимание многие исследователи, изучая клубеньковые бактерии в чистой культуре в лабораторных условиях и почве. Клубеньковые бактерии могут быть палочковидными и овальными. Среди этих бактерий встречаются также фильтрующиеся формы, L-формы, кокковидные неподвижные и подвижные организмы.
Молодые клубеньковые бактерии в чистой культуре на питательных средах обычно имеют палочковидную форму, размер палочек примерно 0,5-0,9 X 1,2-3,0 мкм, подвижные, размножаются делением. У палочковидных клеток клубеньковых бактерий клевера наблюдается деление перешнуровыванием. С возрастом палочковидные клетки могут переходить к почкованию. По Граму клетки окрашиваются отрицательно, ультратонкая структура их типична для грамотрицательных бактерий.
При старении клубеньковые бактерии теряют подвижность и переходят в состояние так называемых опоясанных палочек. Такое название они получили вследствие чередования в клетках плотных и неплотных участков протоплазмы. Полосатость клеток хорошо выявляется при просмотре в световом микроскопе после обработки клеток анилиновыми красителями. Плотные участки протоплазмы (пояски) прокрашиваются хуже, чем промежутки между ними. В люминесцентном микроскопе пояски светло-зеленые, промежутки между ними не светятся и выглядят темными.Пояски могут располагаться в середине клетки или на концах. Опоясан-ность клеток видна и на электроннограммах, если препарат перед просмотром не обрабатывать контрастирующими веществами. Вероятно, с возрастом бактериальная клетка наполняется жировыми включениями, не воспринимающими окраску и вследствие этого обусловливающими исчерченность клетки. Стадия «опоясанных палочек» предшествует стадии формирования бактероидов - клеток неправильной формы: утолщенных, разветвленных, сферических, грушевидных и колбовидных.Термин «бактероиды» ввел в литературу Дж. Брунхорст в 1885 г., применив его к необычным по форме образованиям, значительно более крупным, чем палочковидные клетки бактерий, встречающимся в тканях клубеньков.
Бактероиды содержат большее количество волютиновых гранул и характеризуются более высоким содержанием гликогена и жира, чем палочковидные клетки. Бактероиды, выращенные в искусственных питательных средах и образовавшиеся в тканях клубенька, физиологически однотипны. Есть мнение, что бактероиды - это формы бактерий с незавершенным процессом деления. При незавершенном делении клеток клубеньковых бактерий возникают дихотомически ветвящиеся формы бактероидов. Количество бактероидов увеличивается при старении культуры; их появлению способствуют истощение питательной среды, накопление продуктов обмена, внесение в среду алкалоидов.
Рис. 3
В старых (двухмесячных) культурах клубеньковых бактерий с помощью электронного микроскопа можно выявить во многих клетках четко очерченные образования сферической формы - артроспоры. Их количество в клетках варьирует от 1 до 5.
Рис. 4
На питательных средах клубеньковые бактерии различных видов бобовых растений растут с разной скоростью. К быстрорастущим относятся клубеньковые бактерии гороха, клевера, люцерны, кормовых бобов, вики, чечевицы, чины, донника, пажитника, фасоли, нута, лядвенца; к медленнорастущим - клубеньковые бактерии люпина, сои, арахиса, сераделлы, маша, вигны, эспарцета, дрока. Вполне сформировавшиеся колонии быстрорастущих культур можно получить на 3 - 4-е сутки инкубации, колонии медленнорастущих - на 7 - 8-е.
Для быстрорастущих клубеньковых бактерий характерно перитрихиальное расположение жгутиков, для медленнорастущих - монотрихиальное.
Кроме жгутиков, у клеток клубеньковых бактерий при выращивании на жидких средах образуются нитевидные и четковидные выросты.Длина их достигает 8 -10 мкм. Они обычно располагаются на поверхности клетки перитрихиально, содержится их от 4 до 10 и больше на одну клетку.
Колонии быстрорастущих клубеньковых бактерий имеют цвет топленого молока, часто полупрозрачные, слизистые, с ровными краями, умеренно выпуклые, со временем разрастаются на поверхности агаризованной среды. Колонии медленнорастущих бактерий более выпуклые, мелкие, сухие, плотные и, как правило, не разрастающиеся на поверхности среды. Слизь, вырабатываемая клубеньковыми бактериями, представляет собой комплексное соединение полисахаридного типа, в состав которого входят гексозы, пентозы и уроновые кислоты.
Клубеньковые бактерии - микроаэрофилы (развиваются при незначительных количествах кислорода в среде), предпочитающие, однако, аэробные условия.
В качестве источника углерода в питательных средах клубеньковые бактерии используют углеводы и органические кислоты, в качестве источника азота - разнообразные минеральные и органические азотсодержащие соединения. При культивировании на средах с высоким содержанием азотсодержащих веществ клубеньковые бактерии могут утратить способность проникать в растение и образовывать клубеньки. Поэтому обычно клубеньковые бактерии выращивают на растительных экстрактах (фасолевом, гороховом отваре) или почвенных вытяжках. Необходимый для развития фосфор клубеньковые бактерии могут получать из минеральных и органических фосфорсодержащих соединений; источником кальция, калия и других минеральных элементов могут служить минеральные соединения.
Для подавления посторонней сапрофитной микрофлоры при выделении клубеньковых бактерий из клубеньков или непосредственно из почвы рекомендуются питательные среды с добавлением кристаллического фиолетового, танина или антибиотиков.
Для развития большинства культур клубеньковых бактерий требуется оптимальная температура в пределах 24-26°. При 0° и 37 °С рост приостанавливается. Обычно культуры клубеньковых бактерий в условиях лаборатории хранят при пониженных температурах (2-4 °С).
Многие виды клубеньковых бактерий способны синтезировать витамины группы В, а также ростовые вещества типа гетероауксина (бета-индолилуксусная кислота).
Все клубеньковые бактерии приблизительно одинаково устойчивы к щелочной реакции среды (рН = 8,0), но неодинаково чувствительны к кислой.
Специфичность, вирулентность, конкурентоспособность и активность клубеньковых бактерий-понятие специфичности клубеньковых бактерий - собирательное. Оно характеризует способность бактерий образовывать клубеньки у растений. Если говорить о клубеньковых бактериях вообще, то для них образование клубеньков только у группы бобовых растений уже само по себе специфично - они обладают избирательностью к бобовым растениям.
Однако если рассматривать отдельные культуры клубеньковых бактерий, то оказывается, что среди них есть такие, которые способны заражать лишь определенную, иногда большую, иногда меньшую, группу бобовых растений, и в этом смысле специфичность клубеньковых бактерий - это избирательная способность в отношении растения-хозяина. Специфичность клубеньковых бактерий может быть узкой (клубеньковые бактерии клевера заражают только группу клеверов - видовая специфичность, а клубеньковые бактерии люпина могут характеризоваться даже сортовой специфичностью - заражать только алкалоидные или безалкалоидные сорта люпина). При широкой специфичности клубеньковые бактерии гороха могут заражать растения гороха, чины, бобов, а клубеньковые бактерии чины и бобов могут заражать растения гороха, т. е. все они характеризуются способностью «перекрестного заражения». Специфичность клубеньковых бактерий лежит в основе их классификации.
Специфичность клубеньковых бактерий возникла в результате их длительного приспособления к одному растению или к группе их и генетической передачи этого свойства. В связи с этим различная приспособленность клубеньковых бактерий к растениям имеется и в пределах группы перекрестного заражения. Так, клубеньковые бактерии люцерны могут образовать клубеньки у донника. Но тем не менее они более приспособлены к люцерне, а бактерии донника - к доннику.
В процессе инфекции корневой системы бобовых растений клубеньковыми бактериями большое значение имеет вирулентность микроорганизмов. Если специфичностью определяется спектр действия бактерий, то вирулентность клубеньковых бактерий характеризует активность их действия в пределах данного спектра. Под вирулентностью подразумевается способность клубеньковых бактерий проникать в ткань корня, размножаться там и вызывать образование клубеньков.
Большую роль играет не только сама способность проникать в корни растения, но и скорость этого проникновения.
Для определения вирулентности штамма клубеньковых бактерий необходимо установить его способность вызывать образование клубеньков. Критерием вирулентности любого штамма может служить то минимальное количество бактерий, которое обеспечивает более энергичное инфицирование корней по сравнению с другими штаммами, завершающееся формированием клубеньков.
Рис. 5
В почве в присутствии других штаммов не всегда более вирулентный штамм будет инфицировать растение первым. В этом случае следует учитывать его конкурентную способность, которая нередко маскирует свойство вирулентности в природных условиях.
Необходимо, чтобы вирулентные штаммы обладали и конкурентоспособностью, т. е. могли успешно конкурировать не только с представителями местной сапрофитной микрофлоры, но и с другими штаммами клубеньковых бактерий. Показателем конкурентоспособности штамма служит количество образованных им клубеньков в процентах от общего числа клубеньков на корнях растений.
Важным свойством клубеньковых бактерий является их активность (эффективность), т.е. способность в симбиозе с бобовыми растениями ассимилировать молекулярный азот и удовлетворять в нем потребности растения-хозяина. В зависимости от того, в какой степени клубеньковые бактерии способствуют повышению урожайности бобовых культур, их принято делить на активные (эффективные), малоактивные (малоэффективные) и неактивные (неэффективные).
Неактивный для одного растения-хозяина штамм бактерий в симбиозе с другим видом бобового растения может быть вполне эффективным. Поэтому при характеристике штамма с точки зрения его эффективности следует всегда указывать, в отношении какого вида растения-хозяина проявляется его действие.
Активность клубеньковых бактерий не является их постоянным свойством. Нередко в лабораторной практике наблюдается потеря активности у культур клубеньковых бактерий. При этом или теряется активность у всей культуры, или появляются отдельные клетки с малой активностью. Снижение степени активности клубеньковых бактерий происходит в присутствии некоторых антибиотиков, аминокислот. Одной из причин утраты активности клубеньковых бактерий может быть влияние фага. Пассированием, т. е. неоднократным проведением бактерий через растение-хозяина (адаптацией к определенному виду растения), можно получить эффективные штаммы из неэффективных.
Рис. 6 - Слой гранулированного вещества на поверхности корневого волоска (1) при электронно-микроскопическом исследовании (по П. Дарту, Ф. Мерсеру, увел. X 30 000) и слизистый зооглейный слой (2), в который погружены корневые волоски клевера, под световым микроскопом (увел. X 80)
Воздействие гамма-лучами дает возможность получать штаммы с усиленной эффективностью. Известны случаи возникновения высокоактивных радиомутантов клубеньковых бактерий люцерны из неактивного штамма. Применение ионизирующих излучений, оказывающих непосредственное влияние на изменение генетических особенностей клетки, по всей вероятности, может явиться перспективным приемом при селекции высокоактивных штаммов клубеньковых бактерий.
Инфицирование бобового растения клубеньковыми бактериями-для обеспечения нормального процесса инфицирования корневой системы клубеньковыми бактериями необходимо наличие довольно большого количества жизнеспособных клеток бактерий в прикорневой зоне.
При развитии корневой системы бобового растения размножение клубеньковых бактерий на поверхности корня стимулируется выделениями корня. Продукты разрушения корневых чехликов и волосков играют также немаловажную роль в обеспечении клубеньковых бактерий подходящим субстратом.
На поверхности корня имеется слой слизистого вещества (матрица), образующийся независимо от наличия в ризосфере бактерий. Этот слой хорошо виден при исследовании в светооптическом микроскопе. Клубеньковые бактерии после инокуляции обычно устремляются к этому слою и скапливаются в нем вследствие стимуля-ционного эффекта корня, проявляющегося даже на расстоянии до 30 мм.
О механизме проникновения клубеньковых бактерий в корень растения существует ряд гипотез. Наиболее интересные из них следующие. Авторы одной из гипотез утверждают, что клубеньковые бактерии проникают в корень через повреждения эпидер-мальной и коровой ткани (особенно в местах ответвления боковых корней). Эта гипотеза была выдвинута на основании исследований Бриля (1888), вызвавшего образование клубеньков у бобовых растений путем прокалывания корней иглой, погруженной предварительно в суспензию клубеньковых бактерий. Как частный случай такой путь внедрения вполне реален. Например, у арахиса клубеньки преимущественно располагаются в пазухах ответвлений корней, что наводит на мысль о проникновении клубеньковых бактерий в корень через разрывы при прорастании боковых корней.
Интересна и не лишена оснований гипотеза о проникновении клубеньковых бактерий в ткань корня через корневые волоски. Путь прохождения клубеньковых бактерий через корневые волоски признает большинство исследователей.
Не исключено, что клубеньковые бактерии могут проникать в корень через эпидермальные клетки молодых верхушек корня. По мнению Пражмовского (1889), бактерии могут проникать в корень только через молодую клеточную оболочку (корневых волосков или эпи-дермальных клеток) и совершенно не способны преодолевать химически измененный или оп-робковевший слой коры. Этим можно объяснить, что клубеньки обычно развиваются на молодых участках главного корня и появляющихся боковых корнях.
В последнее время большую популярность получила ауксинная гипотеза. Авторы этой гипотезы считают, что клубеньковые бактерии проникают в корень благодаря стимуляции синтеза р-индолилуксусной кислоты (гете-роауксина) из триптофана, имеющегося всегда в корневых выделениях растений. С наличием гетероауксина связывается искривление корневых волосков, которое обычно наблюдается при инфицировании корневой системы клубеньковыми бактериями.
Рис. 7
Источником бета-индолилуксусной кислоты в момент инфицирования растения, очевидно, служат не только растения, выделяющие через корневую систему триптофан, который многие виды бактерий, в том числе и клубеньковые, могут переводить в бета-индолилуксусную кислоту. Сами клубеньковые бактерии, а возможно, и другие виды почвенных микроорганизмов, живущие в зоне корня, также могут участвовать в синтезе гетероауксина.
Действие гетероауксина неспецифично и вызывает искривление корневых волосков у разных видов растений, а не только бобовых. В то же время клубеньковые бактерии вызывают искривление корневых волосков лишь у бобовых растений, проявляя при этом довольно значительную избирательность. Если бы рассматриваемый эффект определялся только (З-индолилуксусной кислотой, то такой специфики не было бы. Кроме того, характер изменений корневых волосков под влиянием клубеньковых бактерий несколько иной, чем под влиянием гетероауксина.
Следует также отметить, что в отдельных случаях инфицированию подвергаются неискривленные корневые волоски. Наблюдения показывают, что у люцерны и гороха искривляются и закручиваются 60-70% корневых волосков, а у клевера - около 50%. У некоторых видов клевера эта реакция отмечается не более чем у 1/4 части заражаемых волосков. В реакции искривления, очевидно, имеет большое значение состояние корневого волоска. Растущие корневые волоски наиболее чувствительны к действию веществ, вырабатываемых бактериями.
Рис. 8
клубеньковый азотистый бактерия бобовый
Следует отметить еще одну гипотезу, по которой клубеньковые бактерии попадают в корень при образовании пальцевидного впячивания поверхности корневого волоска. На электрон-нограмме среза корневого волоска, подтверждающей эту гипотезу, виден изогнутый в виде ручки зонтика корневой волосок, в изгибе которого находится скопление клубеньковых бактерий. Клубеньковые бактерии как бы втягиваются (проглатываются) корневым волоском (подобно пиноцитозу).
Рис. 9 - Искривление корневых волосков бобовых растений в присутствии клубеньковых бактерий: 1,2 - увел, х 120; 3 - ультратонкий срез через корневой волосок. Увел. X 10 000 (по К. Сальману и Г. Фэреусу)
Процесс внедрения клубеньковых бактерий в ткань корня одинаков у всех видов бобовых растений и состоит из двух фаз. В первую фазу происходит инфицирование корневых волосков. Во вторую фазу интенсивно идет процесс образования клубеньков. Продолжительность фаз различна у разных видов растений: у Trifolium fragiferum первая фаза продолжается 6 дней, у Trifolium nigrescens - 3 дня. В некоторых случаях очень трудно обнаружить границы между фазами. Наиболее интенсивное внедрение клубеньковых бактерий в корневые волоски происходит на ранних этапах развития растения. Вторая фаза заканчивается в период массового образования клубеньков. Нередко внедрение клубеньковых бактерий в корневые волоски продолжается уже и после того, как клубеньки сформировались на корнях. Эта так называемая избыточная или дополнительная инфекция происходит потому, что инфицирование волосков не прекращается длительное время. В более поздние сроки заражения клубеньки обычно размещаются ниже по корню.
Проникнув в корень (через корневой волосок, эпидермальную клетку, места повреждений корня), клубеньковые бактерии далее перемещаются в ткани корня растения. Наиболее легко бактерии проходят через межклеточные пространства.
Внедриться в ткань корня может или одиночная клетка, или группа клеток бактерий. Если внедрилась отдельная клетка, она и в дальнейшем может перемещаться по ткани как одиночка. Путь инфицирования корня одиночными клетками свойствен растениям люпина.
Однако в большинстве случаев внедрившаяся клетка, активно размножаясь, образует так называемые инфекционные нити (или инфекционные тджи) и уже в виде таких нитей перемещается в ткани растения.
Термин «инфекционная нить» возник на основе изучения процесса инфицирования в световом микроскопе. Начиная с работ Бейеринка, инфекционная нить стала рассматриваться как слизистая гифообразная масса с заключенными в нее
По способу образования клубеньки бобовых растений подразделяются на два типа: 1-й тип - клубеньки возникают при делении клеток перицикла (кор-неродного слоя), обычно расположенных против протоксилемы (первых по времени образования сосудов) - эндогенный тип образования клубеньков; 2-й тип - клубеньки происходят из коры корня в результате внедрения возбудителя в паренхимные клетки коры и эндодермы (внутреннего слоя первичной коры) - экзогенный тип образования клубеньков.
Рис. 10 - Срезы через клубеньковую ткань бобовых растений: 1 - поперечный срез через клубенек гороха. Начало дифференциации сосудистой ткани в клубеньке (по Г. Бонду); г - продольный срез через клубенек чины. Увел. X 90
В природе преобладает последний тип. Ткани центрального цилиндра корня принимают участие только в образовании сосудистой системы клубеньков как эндогенного, так и экзогенного типа.
Различие в характере возникновения клубеньков и боковых корней особенно четко наблюдается у сераделлы, поскольку коровая ткань главного корня этого растения - место возникновения первых клубеньков - состоит из относительно небольшого слоя клеток и клубеньки становятся видимыми очень быстро после инфицирования корня бактериями. Они образуют сначала выступы уплощенной формы на корне, что позволяет отличить их от конических выступов боковых корней. Клубеньки отличаются от боковых корней и рядом анатомических признаков: отсутствием центрального цилиндра, корневых чехликов и эпидермиса, наличием значительного слоя коры, покрывающей клубенек.
Рис. 11 - Интерцеллюлярные инфекционные нити в виде кармана (справа) и факела (слева) с клубеньковыми бактериями. Стрелкой показана клетка бактерий, приготовившаяся к выходу в цитоплазму растительной клетки. Увел. X 20 000
Формирование клубеньков бобовых растений происходит в период, когда корень имеет еще первичную структуру. Оно начинается с деления коровых клеток, расположенных на расстоянии 2-3 слоев от концов инфекционных нитей. Слои коры, пронизанные инфекционными нитями, остаются без изменения. В то же время у сераделлы деление коровых клеток возникает непосредственно под инфицированным корневым волоском, а у гороха деление клеток отмечается только в предпоследнем слое коры.
Деление с образованием радиальной структуры ткани продолжается до внутренних коровых клеток. Происходит оно без определенного направления, беспорядочно, и в результате этого возникает меристема (система образовательных тканей) клубенька, состоящая из мелких зернистых клеток.
Разделившиеся клетки коры изменяются: ядра округляются и увеличиваются в размерах, особенно увеличиваются ядрышки. После митоза ядра расходятся и, не принимая первоначальной формы, вновь начинают делиться.
Возникает вторичная меристема. Вскоре в эндодерме и перицикле появляются признаки начинающегося деления, которое в прежних внешних клетках происходит главным образом тангентальными перегородками. Это деление распространяется, наконец, на общий меристе-матический комплекс, мелкие клетки которого вытягиваются, вакуоли исчезают, ядро заполняет большую часть клетки. Образуется так называемый первичный клубенек, в плазме клеток которого клубеньковые бактерии отсутствуют, поскольку они на данной стадии еще находятся внутри инфекционных нитей. В то время как образуется первичный клубенек, инфекционные нити многократно разветвляются и могут проходить или между клетками - интерцеллюлярно, или сквозь клетки - интрацеллюлярно - и вносить бактерии.
Рис. 12 - Интрацеллюлярные инфекционные нити с клубеньковыми бактериями: 1 - продольный разрез (по Д. Гудчильду и Ф. Бергерсену), 2 - поперечный срез. Увел, х 35000
Межклеточные инфекционные нити вследствие активного размножения в них клубеньковых бактерий нередко приобретают причудливую форму - формируются в виде карманов (дивертикулов) или факелов.
Процесс передвижения инфекционных нитей из клетки в клетку не совсем ясен. По-видимому, инфекционные нити, как полагает канадский микробиолог Д. Джордан, блуждают в виде голых слизистых тяжей в межклеточных промежутках растительной ткани до тех пор, пока вследствие каких-то еще необъяснимых причин не начинают инвагинировать в цитоплазму примыкающих клеток.
В некоторых случаях инвагинация инфекционной нити происходит в одну, в некоторых случаях - в каждую соседнюю клетку. По этим инвагинированным трубчатым полостям (дивертикулам) перетекает заключенное в слизь содержимое нити. Наиболее активный рост инфекционных нитей происходит обычно вблизи ядра растительной клетки. Проникновение нити сопровождается перемещением ядра, которое продвигается к месту инфекции, увеличивается, меняет форму и дегенерирует. Подобная картина наблюдается при грибной инфекции, когда ядро нередко устремляется навстречу внедрившимся гифам, притягивается к повреждению как к месту наибольшей физиологической активности, вплотную придвигается к нити, разбухает и разрушается. По-видимому, это характерно для ответной реакции растения на инфекцию.
У однолетних растений инфекционные нити возникают обычно в первый период инфицирования корня, у многолетних - в течение длительного периода развития.
Рис. 13
Бактерии могут высвобождаться из инфекционной нити в разное время и разными способами. Выход бактерий, как правило, весьма длительный процесс, особенно у многолетних растений. Обычно выход бактерий из инфекционной нити в цитоплазму растения-хозяина связывают с внутренним давлением, возникающим вследствие интенсивного размножения бактерий в нити и экскреции ими слизи. Иногда бактерии выскальзывают из нити группами, окруженными слизью инфекционной нити. в виде везикул (пузыревидных образований). Поскольку везикулы не имеют оболочек, выход из них бактерий очень прост. В клетки растений клубеньковые бактерии могут попадать и поодиночке из межклеточных пространств.
Клубеньковые бактерии, вышедшие из инфекционной нити, продолжают размножаться в ткани хозяина. Размножение их в этот период происходит делением перетяжкой. Основная масса бактерий размножается в цитоплазме клетки, а не в инфекционной нити. Зараженные клетки дают начало будущей бактероидной ткани.
Наполняющиеся быстро размножающимися клетками клубеньковых бактерий растительные клетки начинают усиленно делиться. В момент митотического деления зараженных клеток клубеньковые бактерии могут скапливаться на двух противоположных полюсах материнской клетки и пассивно попадать в дочерние клетки. Каждая из незараженных клеток находится при этом под сильным стимулирующим воздействием клубеньковых бактерий и вследствие этого также делится. Благодаря такому энергично протекающему митотическому делению меристематических клеток осуществляется распространение клубеньковых бактерий в ткани клубенька и увеличение объема бактероидной области.
Инфицированная ткань, состоящая из плотно лежащих и активно делящихся клеток, имеет сначала форму усеченного конуса. В дальнейшем вследствие постепенного роста этого конуса и одновременного деления и развития меристематических клеток ткань клубенька разрастается, утрачивая конусовидность.
Таким образом, клубенек увеличивается сначала в результате радиального и тангентального деления коровых клеток, а затем за счет увеличения их размера и одновременного деления. После того как растительные клетки полностью заполнятся бактериями, митоз прекращается. Однако клетки продолжают увеличиваться в размере и часто сильно вытягиваются. Размер их в несколько раз больше, чем у неинфицированных растительных клеток, которые расположены между ними в бактероидной зоне клубенька.
Связь молодого клубенька с корнем бобового растения осуществляется благодаря сосудисто-волокнистым пучкам. Впервые сосудисто-волокнистые пучки наблюдал М.С. Воронин (1866). Время возникновения сосудистой системы в клубеньках различных видов бобовых растений различно. Так, у клубеньков сои начало развития сосудистых пучков совпадает с моментом проникновения клубеньковых бактерий в два слоя коровой паренхимы. С ростом клубенька проводящая система разрастается, разветвляется и окружает бактероидную область.
Параллельно с процессом дифференциации сосудистой системы идет формирование клубеньковой эндодермы из внешнего слоя первичного клубенька. Затем клубенек округляется, его периферийный клеточный слой окружается клубеньковой корой.
Корневой эпидермис разрывается, а клубенек продолжает развиваться и увеличиваться в размерах.
С помощью светового микроскопа на продольных срезах зрелых клубеньков обычно четко выделяются 4 характерные зоны тканевой дифференциации: кора, меристема, бактероидная зона и сосудистая система. Все ткани клубенька дифференцируются в акропетальной последовательности, так как новые клетки закладываются меристемой.
Рис. 14
Клубеньковая кора - оболочка клубенька, выполняющая защитную функцию. Кора состоит из нескольких рядов незараженных паренхимных клеток, величина и особенности которых различны у разных бобовых культур. Чаще всего клетки коры имеют вытянутую форму и крупнее по сравнению с другими клетками клубенька.
Рис. 15
В коре клубеньков многолетних деревянистых видов часто встречаются клетки с опробковевшими оболочками, содержащие смолы, танин, дубильные вещества.
Клубеньковая меристема расположена под клетками коры и представляет собой зону интенсивно делящихся также незараженных клеток. Для меристемы клубенька характерны плотно расположенные, без межклетников, мелкие тонкостенные клетки неправильной формы. Клетки меристемы клубенька подобны клеткам других типов меристематической ткани (верхушки корня, верхушки стебля). Клетки клубеньковой меристемы содержат плотную, тонко гранулированную цитоплазму с рибосомами, телами Гольджи, протопластидами, митохондриями и другими структурами. Встречаются небольшие вакуоли. В центре цитоплазмы расположено крупное ядро с ядерной мембраной, порами и четко выраженным ядрышком. Функции меристематических клеток заключаются в формировании клеток клубеньковой коры, бактероидной области и сосудистой системы. В зависимости от расположения меристемы клубеньки имеют разнообразную форму: шаровидную (горох, фасоль, сераделла, арахис) или цилиндрическую (люцерна, вика, чина, акация, клевер). Меристема, расположенная отдельными участками по периферии клубенька, приводит к образованию муфтооб-разных клубеньков у люпина.
Клубеньковая меристема функционирует долго, даже во время некроза клубеньков, когда они уже наполнены лизирующейся бактероидной массой и разрушенными растительными клетками.
Бактероидная зона клубенька занимает его центральную часть и составляет от 16 до 50% от общей сухой массы клубеньков. В первый период формирования клубенька она, по существу, является бактериальной зоной, так как заполнена клетками бактерий, находящихся в бактериальной, а не бактероидной стадии развития. Тем не менее принято, когда идет речь о зоне клубеньковой ткани, содержащей бактерии, называть ее бактероидной.
Бактероидная область клубенька состоит в основном из инфицированных клубеньковыми бактериями клеток и частично из смежных с ними неинфицированных клеток, заполненных пигментами, дубильными веществами, а к осени - крахмалом.
Рис. 16 - Форма клубеньков у бобовых растений: 1, 2 - гороха; 3, 6 (справа) - люпина; 4 - арахиса (по Е. Швингхамеру); 5 - чины, клевера, вики, 6 (слева) - люцерны (по Я. Дэйту); 7 - разных видов дикорастущих бобовых растений (по А.Р. Вернеру, Н.Я. Гордиенко)
В клубеньках, образованных эффективными штаммами клубеньковых бактерий, средний относительный объем бактероидной зоны выше, чем в клубеньках, сформировавшихся при внедрении неэффективных штаммов.
В некоторых случаях объем бактероидной области достигает максимума в ранний период жизни клубенька и впоследствии остается относительно постоянным. Бактероидная зона пронизана густой сетью инфекционных нитей, а по периферии окружена сосудисто-волокнистыми пучками.
Форма бактероидов в клубеньках разных видов бобовых культур может быть разнообразной. Так, у вики, чины и гороха они двухветвистые или вильчатые. Для клевера и эспарцета преобладающая форма бактероидов шаровидная, грушеобразная, вздутая, яйцевидная, для нута округлая. Форма бактероидов фасоли, сераделлы, лядвенца и люпина практически палочковидная.
Бактероиды заполняют большую часть растительной клетки, за исключением центральной зоны ядра и вакуолей. Так, процент бактероидов в бактероидной зоне окрашенного в розовый цвет клубенька составляет 94,2 к общему числу клубеньковых бактерий. Клетки бактероидов в 3-5 раз больше клеток бактерий.
Рис. 17
Бактероиды клубеньковых бактерий представляют особый интерес в связи с тем, что они являются чуть ли не единственными обитателями клубеньков бобовых растений в период интенсивного связывания ими атмосферного азота. Отдельные исследователи считают бактероиды патологическими дегенеративными формами и не связывают процесс азотфиксации с бактероидной формой клубеньковых бактерий. Большинство исследователей находят, что бактероиды являются самыми жизнеспособными и активными формами клубеньковых бактерий и что фиксация азота атмосферы бобовыми растениями осуществляется только при их участии.
Рис. 18
Сосудистая система клубенька обеспечивает связь между бактериями и растением-хозяином. По сосудистым пучкам транспортируются питательные вещества и продукты обмена. Сосудистая система развивается рано и функционирует длительное время.
Вполне сформировавшиеся сосуды имеют определенное строение: состоят из трахеид ксилемы, волокон флоэмы, ситовидных трубок и сопровождающих клеток.
В зависимости от вида бобовых культур связь клубецька осуществляется посредством одного или нескольких сосудистых пучков. Например, у гороха в основании клубенька имеется два дифференцированных сосудистых узла. Каждый из них обычно дважды дихотомически разветвляется, и в результате сквозь клубенек от места второго дихотомического разветвления проходит 8 пучков. Многие растения имеют лишь один пучок, в то же время у одного клубенька Sesbania grandiflora в возрасте одного года их удалось насчитать до 126. Довольно часто сосудистая система клубенька отделяется с внешней стороны от его коры слоем частично или полностью опробковевших клеток, получивших название клубеньковой эндодермы, соединенных с эндодермой корня. Клубеньковая эндодерма представляет собой внешний слой неинфицированной коровой паренхимы, расположенной между клубеньковой тканью и корневой корой.
У большей части видов растений клубеньки образуются по описанному типу. Следовательно, образование клубеньков - результат сложных явлений, начинающихся вне корня. Вслед за начальными фазами инфекции индуцируется образование клубенька, затем происходит распространение бактерий в зоне клубеньковой ткани и фиксация азота.
Все стадии развития клубеньковых бактерий, по данным чешского микробиолога В. Каша (1928), можно проследить на срезах клубеньков. Так, в верхней части клубенька, например, люцерны содержатся в основном мелкие делящиеся палочковидные клетки, в небольшом количестве молодые бактероиды, число которых возрастает постепенно по мере развития клубенька. В средней, окрашенной в розовый цвет части клубенька обнаруживаются преимущественно бактероидные клетки и реже мелкие палочковидные. В основании клубенька на ранних стадиях вегетации растения-хозяина бактероиды такие же, как и в средней его части, а к концу вегетации более раздутые и раньше дегенерирующие.
Сроки появления первых видимых клубеньков на корнях различных видов бобовых растений различны. Появление их у большинства бобовых культур чаще всего происходит во время развития первых настоящих листьев. Так, образование первых клубеньков люцерны посевной наблюдается между 4-м и 5-м днями после прорастания, а на 7 - 8-й день этот процесс происходит у всех растений. Клубеньки у люцерны серповидной появляются через 10 дней.
В период функционирования клубеньки обычно плотные. Клубеньки, образованные активными культурами бактерий, в молодом возрасте имеют беловатую окраску. К моменту проявления оптимальной активности они становятся розовыми. Клубеньки, возникшие при инфекции неактивными культурами бактерий, зеленоватого тона. Нередко их структура практически не отличается от структуры клубеньков, образованных при участии активных штаммов клубеньковых бактерий, но они преждевременно разрушаются.
В некоторых случаях строение клубеньков, образуемых неактивными бактериями, отклоняется от нормы. Это выражается в дезорганизации клубеньковой ткани, утрачивающей обычно четко выраженную зональную дифференциацию.
Розовая окраска определяется наличием в клубеньках пигмента, по химическому составу близкого гемоглобину крови. В связи с этим пигмент называется леггемоглобином (легоглобином) - гемоглобином Leguminosae. Легоглобин содержится лишь в тех клетках клубеньков, в которых имеются бактероиды. Он локализован в пространстве между бактероидами и окружающей их мембраной.
Количество его колеблется от 1 до 3 мг на 1 г клубенька, в зависимости от вида бобового растения.
Рис. 19
У однолетних бобовых растений к концу вегетационного периода, когда заканчивается процесс азотфиксации, красный пигмент переходит в зеленый. Изменение цвета начинается у основания клубенька, позднее зеленеет его вершина. У многолетних бобовых растений позеленения клубеньков не происходит или оно наблюдается только у основания клубенька. У разных видов бобовых растений переход красного пигмента в зеленый происходит с разной степенью интенсивности и разной скоростью.
Клубеньки однолетних растений функционируют сравнительно недолго. У большинства бобовых культур некроз клубенька начинается в период цветения растения-хозяина и протекает обычно в направлении от центра к периферии клубенька. Один из первых признаков разрушения - образование слоя клеток с мощными стенками у основания клубенька. Этот слой клеток, расположенный перпендикулярно к главному сосуду корня, разъединяет его с клубеньком и задерживает обмен питательными веществами между растением-хозяином и тканями клубенька.
В клетках дегенерирующей ткани клубенька появляются многочисленные вакуоли, ядра теряют способность окрашиваться, часть клеток клубеньковых бактерий лизируется, часть мигрирует в окружающую среду в виде мелких кокковидных клеток-артроспор.
Старые клубеньки темные, дряблые, мягкие. При надрезе из них выступает водянистая слизь. Процессу разрушения клубенька, начинающегося с опробковения клеток сосудистой системы, способствуют понижение фотосинтетической активности растения, сухость или чрезмерная влажность среды.
В разрушенном, ослизненном клубеньке обнаруживаются часто простейшие, грибы, бациллы и мелкие палочковидные клубеньковые бактерии.
Состояние растения-хозяина оказывает влияние на длительность функционирования клубенька. Так, по данным Ф. Ф. Юхимчука (1957), кастрируя или удаляя цветы люпина, можно продлить период его вегетации и вместе с тем время активной деятельности клубеньковых бактерий.
Клубеньки многолетних растений, в отличие от клубеньков однолетних, могут функционировать в течение многих лет. Так, например, карагана имеет многолетние клубеньки, в которых процесс старения клеток идет одновременно с образованием новых. У вистерии (глицинии китайской) также функционируют многолетние клубеньки, образуя на корнях хозяина шаровидные вздутия. К концу вегетационного периода бактероидная ткань многолетних клубеньков деградирует, но весь клубенек не отмирает. На следующий год он вновь начинает функционировать.
Факторы, определяющие симбиотические взаимоотношения клубеньковых бактерий с бобовыми растениями-для симбиоза, обеспечивающего хорошее развитие растений, необходим определенный комплекс условий среды. Если условия окружающей среды будут неблагоприятными, то, даже несмотря на высокую вирулентность, конкурентную способность и активность микросимбионта, эффективность симбиоза будет низкой.
Рис. 20
Для развития клубеньков оптимальная влажность 60-70% от полной влагоемкости почвы. Минимальная влажность почвы, при которой еще возможно развитие клубеньковых бактерий в почве, приблизительно равна 16% от полной влагоемкости. При влажности ниже этого предела клубеньковые бактерии обычно уже не размножаются, но тем не менее они не погибают и могут длительное время сохраняться в неактивном состоянии. Недостаток влаги приводит и к отмиранию уже сформировавшихся клубеньков.
Избыточная влажность, как и ее недостаток, также неблагоприятна для симбиоза - из-за снижения степени аэрации в зоне корней ухудшается снабжение корневой системы растения кислородом. Недостаточная аэрация отрицательно влияет и на живущие в почве клубеньковые бактерии, которые, как известно, лучше размножаются при доступе кислорода. Тем не менее высокая аэрация в зоне корней приводит к тому, что кислород начинают связывать восстановители молекулярного азота, снижая степень азотфиксации клубеньков.
Важную роль во взаимоотношениях клубеньковых бактерий и бобовых растений играет температурный фактор. Температурные характеристики разных видов бобовых растений различны. Также и разные штаммы клубеньковых бактерий имеют свои определенные температурные оптимумы развития и активной фиксации азота. Следует отметить, что оптимальные температуры развития бобовых растений, образования клубеньков и азотфиксации не совпадают. Так, в природных условиях образование клубеньков может наблюдаться при температурах несколько выше 0°С, азот-фиксация при таких условиях практически не происходит. Возможно, лишь арктические симбиозирующие бобовые растения связывают азот при очень низких температурах. Обычно же этот процесс происходит лишь при 10°С и выше. Максимальная азотфиксация ряда бобовых растений наблюдается при 20-25°С. Температура выше 30°С отрицательно влияет на процесс азотонакопления.
Большое влияние на жизнедеятельность клубеньковых бактерий и образование клубеньков оказывает реакция почвы. Для разных видов и даже штаммов клубеньковых бактерий значение рН среды обитания несколько различно. Так, например, клубеньковые бактерии клевера более устойчивы к низким значениям рН, чем клубеньковые бактерии люцерны. Очевидно, здесь также сказывается адаптация мпкро-ерганизмов к среде обитания. Клевер растет на более кислых почвах, чем люцерна. Реакция почвы как экологический фактор оказывает влияние на активность и вирулентность клубеньковых бактерий. Наиболее активные штаммы, как правило, легче выделить из почв с нейтральными значениями рН. В кислых почвах чаще встречаются неактивные и слабовирулентные штаммы. Кислая среда (рН 4,0 - 4,5) оказывает непосредственное влияние и на растения, в частности нарушая синтетические процессы обмена веществ растений и нормальное развитие корневых волосков. В кислой среде у инокулированных растений резко сокращается срок функционирования бакте-роидной ткани, что ведет к снижению степени азотфиксации.
В кислых почвах, как отмечает А.В. Петербургский, в почвенный раствор переходят соли алюминия и марганца, неблагоприятно действующие на развитие корневой системы растений и процесс азотоусвоения, а также снижается содержание усвояемых форм фосфора, кальция, молибдена и углекислоты. Неблагоприятную реакцию почвы лучше всего устраняет известкование.
Для клубеньковых бактерий ткань хозяина представляет такую питательную среду, которая может удовлетворить даже самый требовательный штамм вследствие содержания в ткани всех типов питательных веществ. Тем не менее после внедрения клубеньковых бактерий в ткань растения-хозяина их развитие определяется не только внутренними процессами, но и в значительной степени зависит от действия внешних факторов, оказывающих влияние на весь ход инфекционного процесса. Содержание или отсутствие того или иного питательного вещества в окружающей среде может быть определяющим моментом для проявления симбиотической азотфиксации.
Степень обеспеченности бобовых растений доступными формами минеральных соединений азота определяет эффективность симбиоза. На основании многочисленных лабораторных и вегетационных опытов известно, что чем больше азотсодержащих соединений в окружающей среде, тем с большим трудом внедряются бактерии в корень.
Большое значение в активации усвоения азота бобовыми растениями имеет фосфорное питание. При низком содержании фосфора в среде проникновение бактерий в корень происходит, но клубеньки при этом не образуются. Бобовым растениям присущи некоторые особенности в обмене фосфорсодержащих соединений. Семена бобовых отличаются повышенным содержанием фосфора. Запасной фосфор при прорастании семян используется не так, как у других культур, - сравнительно равномерно для формирования всех органов, а в большей степени сосредоточиваясь в корнях. Поэтому в ранние сроки развития бобовые растения, в отличие от злаковых, в большей степени удовлетворяют свои потребности в фосфоре за счет семядолей, а не запасов почвы. Чем крупнее семена, тем меньше бобовые растения зависят от фосфора почвы. Однако при симбиотическом способе существования потребность бобовых растений в фосфоре выше, чем при автотроф-ном. Поэтому при недостатке фосфора в среде у инокулированных растений ухудшается снабжение растений азотом.
Для симбиотической азотфиксации необходимы также магний, сера и железо. При недостатке магния тормозится размножение клубеньковых бактерий, снижается их жизнедеятельность, подавляется симбиотическая азот-фиксация. Сера и железо оказывают также благоприятное влияние на образование клубеньков и процесс азотфиксации, в частности играя несомненную роль в синтезе леггемоглобина.
Из микроэлементов особо отметим роль молибдена и бора. При недостатке молибдена клубеньки плохо образуются, в них нарушается синтез свободных аминокислот и подавляется синтез леггемоглобина. Молибден вместе с другими элементами с переменной валентностью (Fe, Co, Си) служит посредником при переносе электронов в окислительно-восстановительных ферментных реакциях. При дефиците бора в клубеньках не формируются сосудистые пучки, и вследствие этого нарушается развитие бактероидной ткани.
На формирование клубеньков у бобовых растений большое влияние оказывает углеводный обмен растений, определяемый рядом факторов: фотосинтезом, наличием в среде углекислого газа, физиологическими особенностями растений. Улучшение углеводного питания благоприятно сказывается на инокуляционном процессе и азотонакоплении. С практической точки зрения большой интерес представляет использование соломы и соломистого свежего навоза для удобрения бобовых растений как источника углеводов. Но в первый год после внесения соломы в почву при ее разложении накапливаются токсические вещества. Следует отметить, что не все виды бобовых растений чувствительны к токсическим продуктам распада соломы; горох, например, не реагирует на них.