Propiedades de las enzimas
1. Dependencia de la velocidad de reacción de la temperatura.
Se describe la dependencia de la actividad enzimática (velocidad de reacción) de la temperatura. curva de campana con velocidad máxima en valores temperatura óptima para una enzima determinada. Un aumento en la velocidad de reacción a medida que se acerca a la temperatura óptima se explica por un aumento en la energía cinética de las moléculas que reaccionan.
Dependencia de la velocidad de reacción de la temperatura.
La ley de aumentar la velocidad de reacción de 2 a 4 veces con un aumento de temperatura de 10°C también es válida para reacciones enzimáticas, pero sólo dentro del rango de 55-60°C, es decir. hasta temperaturas desnaturalización proteínas. A medida que baja la temperatura, la actividad enzimática disminuye, pero no desaparece por completo.
Como excepción, existen enzimas de algunos microorganismos que existen en el agua de fuentes termales y géiseres cuya temperatura óptima se acerca al punto de ebullición del agua; Un ejemplo de actividad débil a bajas temperaturas es la hibernación de algunos animales (tuzas, erizos), cuya temperatura corporal desciende a 3-5°C. Esta propiedad de las enzimas también se utiliza en la práctica quirúrgica durante las operaciones en la cavidad torácica, cuando el paciente se enfría a 22°C.
Las enzimas pueden ser muy sensibles a los cambios de temperatura:
- Los gatos siameses tienen el hocico, las puntas de las orejas, la cola y las patas de color negro. En estas zonas la temperatura es sólo 0,5°C más baja que en las regiones centrales del cuerpo. Pero esto permite que funcione la enzima que forma el pigmento en los folículos pilosos; al menor aumento de temperatura, la enzima se inactiva;
- el caso opuesto: cuando la temperatura ambiente desciende en la liebre blanca, la enzima formadora de pigmentos se inactiva y la liebre adquiere una bata blanca,
- proteína antiviral interferón comienza a sintetizarse en las células sólo cuando la temperatura corporal alcanza los 38°C,
También hay situaciones únicas:
- Para la mayoría de las personas, un aumento de la temperatura corporal de 5°C (hasta 42°C) es incompatible con la vida debido a un desequilibrio en la velocidad de las reacciones enzimáticas. Al mismo tiempo, se descubrió que algunos atletas tenían una temperatura corporal de aproximadamente 40°C durante la carrera de maratón, siendo la temperatura corporal máxima registrada de 44°C.
2. Dependencia de la velocidad de reacción del pH.
La dependencia también se describe curva de campana con velocidad máxima en óptimo para una enzima dada Valor de pH.
Esta característica de las enzimas es esencial para que el cuerpo se adapte a las condiciones externas e internas cambiantes. Los cambios en el pH dentro y fuera de la célula desempeñan un papel en la patogénesis de las enfermedades, cambiando la actividad de las enzimas en diversas vías metabólicas.
Para cada enzima, existe un cierto rango estrecho de pH ambiental, que es óptimo para la manifestación de su máxima actividad. Por ejemplo, los valores de pH óptimos para la pepsina son 1,5-2,5, tripsina 8,0-8,5, amilasa salival 7,2, arginasa 9,7, fosfatasa ácida 4,5-5,0, succinato deshidrogenasa 9,0.
Dependencia de la velocidad de reacción del valor del pH.
La dependencia de la actividad de la acidez del medio se explica por la presencia de aminoácidos en la estructura de la enzima, cuya carga cambia con el cambio de pH (glutamato, aspartato, lisina, arginina, histidina). Un cambio en la carga de los radicales de estos aminoácidos conduce a un cambio en su interacción iónica durante la formación de la estructura terciaria de la proteína, un cambio en su carga y la aparición de una configuración diferente del centro activo y, por tanto, , el sustrato se une o no al centro activo.
Los cambios en la actividad enzimática con un cambio de pH también pueden causar adaptado funciones. Por ejemplo, en el hígado, las enzimas gluconeogénesis requieren un pH más bajo que las enzimas glicolíticas, lo que se combina con éxito con la acidificación de los fluidos corporales durante el ayuno o la actividad física.
Para la mayoría de las personas, los cambios en el pH de la sangre más allá de 6,8-7,8 (siendo la norma 7,35-7,45) son incompatibles con la vida debido a un desequilibrio en la velocidad de las reacciones enzimáticas. Al mismo tiempo, algunos corredores de maratón mostraron una disminución del pH sanguíneo al final de la distancia a 6,8-7,0. ¡Y aún así siguieron funcionando!
3. Dependencia de la cantidad de enzima
A medida que aumenta el número de moléculas de enzima, la velocidad de reacción aumenta continuamente y es directamente proporcional a la cantidad de enzima, porque más moléculas de enzima producen más moléculas de producto.
CINÉTICA DE REACCIÓN ENZIMATIVA
estudia los patrones de paso de reacciones enzimáticas a lo largo del tiempo, así como su mecanismo; capítulo cinética química.
Catalítico El ciclo de conversión de la sustancia S (sustrato) en el producto P bajo la acción de la enzima E procede con la formación de intermedios. conexión. incógnita i:
Dónde ki- constantes de velocidad de etapas elementales individuales,
formación del complejo enzima-sustrato X 1 (ES, complejo de Michaelis).
A una temperatura determinada, la velocidad de la reacción depende de las concentraciones de la enzima, el sustrato y la composición del medio. Existen cinéticas estacionarias, preestacionarias y de relajación de reacciones enzimáticas.
Cinética estacionaria. En estado estacionario mediante conexiones intermedias. (dX i/dt= 0, yo = 1, ..., norte) y con exceso de sustrato, donde [S] 0 y [E] 0 son las concentraciones iniciales, respectivamente. sustrato y enzima, la cinética del proceso se caracteriza por un nivel de concentraciones constante e invariante en el tiempo. conn., y la expresión para la velocidad del proceso v 0, llamado velocidad estacionaria inicial, tiene la forma (ecuación de Michaelis-Menten):
(1)
donde los valores de k cat y K·m -> funciones de constantes de velocidad de etapas elementales y están dadas por las ecuaciones:
El valor de k gato.
llamado catalítico eficaz constante de velocidad de proceso, parámetro K·m -> Michael es constante. valor k cat
determinado por cantidades máx. etapas lentas de catalizador distritos y a veces llamados número de revoluciones de la enzima (sistema enzimático); k gato
caracteriza el número de catalizadores Ciclos realizados por el sistema enzimático por unidad de tiempo. Naib. común, que tiene el valor k cat. para especifico sustratos en el rango de 10 2 -10 3 s -1. Los valores típicos de la constante de Michaelis se encuentran en el rango 10 -3 - 10 -4 M.
A altas concentraciones del sustrato, cuando, es decir, la velocidad de la reacción no depende de la concentración del sustrato y alcanza un valor constante, llamado. Máx. velocidad. Gráficamente, la ecuación de Michaelis-Menten es una hipérbole. Se puede linealizar utilizando el método de los recíprocos dobles (método de Linewere-Burk), es decir, construyendo la dependencia 1/v a partir de 1/[S] 0, u otros métodos. La forma lineal de la ecuación (1) tiene la forma:
(2)
Permite determinar gráficamente los valores. km yv máx (Fig. 1).
Arroz. 1. Gráfica de transformación lineal de la ecuación de Michaelis - Menten en recíprocos dobles (según Lineweaver - Burke).
Magnitud K·m > es numéricamente igual a la concentración del sustrato, a la que la velocidad de circulación es igual, por lo tanto km A menudo sirve como medida de la afinidad del sustrato y la enzima, pero esto sólo es válido si
Cantidades K·m > Y varían dependiendo de los valores de pH. Esto se debe a la capacidad de los grupos de moléculas enzimáticas implicadas en la catálisis para cambiar su estado de ionización y, por tanto, su actividad catalítica. eficiencia. En el caso más simple, un cambio de pH da como resultado la protonación o desprotonación de al menos dos grupos ionizables de la enzima implicada en la catálisis. Si en este caso sólo una forma del complejo enzima-sustrato (por ejemplo, ESH) de tres formas posibles (ES, ESH y ESH 2) es capaz de convertirse en un producto de la solución, entonces la dependencia de la tasa de pH se describe mediante la fórmula:
Dónde f = 1 + / Y F" = 1 +
+K" b />-T. llamado Funciones de pH de Michaelis y K un, K b Y K" a, K" b -> Constantes de ionización de los grupos a y bresp. gratis enzima y complejo enzima-sustrato. En coordenadas lg - pH esta dependencia se presenta en la Fig. 2, y las tangentes de los ángulos de pendiente de las tangentes a las ramas ascendente, independiente del pH y descendente de la curva deben ser iguales a +1, 0 y -1, respectivamente. A partir de dicho gráfico se pueden determinar los valores. pk un Grupos implicados en la catálisis.
Arroz. 2. Dependencia del catalizador. constantes desde pH hasta logarítmicas. coordenadas
La velocidad de la reacción enzimática no siempre obedece a la ecuación (1). Uno de los casos más comunes es la participación del alostérico en la reacción. enzimas (ver Reguladores enzimáticos), para lo cual la dependencia del grado de saturación de la enzima de [S] 0 no es hiperbólica. personaje (Fig. 3). Este fenómeno se debe a la cooperatividad de unión del sustrato, es decir, cuando la unión de un sustrato en uno de los sitios de la macromolécula enzimática aumenta (cooperatividad positiva) o disminuye (cooperatividad negativa) la afinidad por el sustrato de otro sitio.
Arroz. H Dependencia del grado de saturación de la enzima con el sustrato de la concentración del sustrato con cooperatividad positiva (I) y negativa (II), así como en su ausencia (III).
Cinética previa al estado estacionario. Con una mezcla rápida de soluciones de enzima y sustrato en el intervalo de tiempo de 10 -6 -10 -1 s, se pueden observar procesos transitorios que preceden a la formación de un estado estacionario estable. En este modo preestacionario, cuando se utiliza un gran exceso de sustrato, se activa el sistema diferencial. La ecuación que describe la cinética de los procesos es lineal. La solución de este tipo de sistema diferencial lineal. La ecuación viene dada por la suma de los términos exponenciales. Entonces, para cinética En el esquema presentado anteriormente, la cinética de acumulación de producto tiene la forma:
donde A yo ->, b y n -> funciones de constantes de velocidad elementales; -raíces de la característica correspondiente. nivel.
La cantidad recíproca se llama característica tiempo de proceso:
Para un río que fluye con la participación de nintervalos. conexión, puede obtener características. veces
El estudio de la cinética de una reacción enzimática en modo preestacionario nos permite hacernos una idea del mecanismo detallado de las reacciones catalíticas. ciclo y determine las constantes de velocidad de las etapas elementales del proceso.
Experimentalmente, la cinética de una reacción enzimática en modo preestacionario se estudia utilizando el método del chorro detenido (ver. Métodos cinéticos de chorro), permitiendo la mezcla de los componentes de la solución en 1 ms.
Cinética de relajación. Con un efecto perturbador rápido en el sistema (cambio de temperatura, presión, campo eléctrico), el tiempo necesario para que el sistema alcance un nuevo equilibrio o estado estacionario depende de la velocidad de los procesos que determinan la reacción catalítica. ciclo enzimático.
El sistema de ecuaciones que describe la cinética del proceso es lineal si el desplazamiento desde la posición de equilibrio es pequeño. La solución del sistema conduce a la dependencia de las concentraciones de los componentes, dec. etapas del proceso en forma de suma de términos exponenciales, cuyos exponentes tienen el carácter de tiempos de relajación. El resultado del estudio es un espectro de tiempos de relajación correspondiente al número de intervalos. conexiones que participan en el proceso. Los tiempos de relajación dependen de las constantes de velocidad de las etapas elementales de los procesos.
Técnicas de relajación La cinética permite determinar las constantes de velocidad de las etapas elementales individuales de transformación de productos intermedios. Los métodos para estudiar la cinética de relajación varían. resolución: absorción de ultrasonidos - 10 -6 -10 -10
s, salto de temperatura - 1O -4 -10 -6 s, método eléctrico. impulso - 10 -4 -10 -6 s, salto de presión - 10 -2 s. Al estudiar la cinética de reacciones enzimáticas, se utilizó el método del salto de temperatura.
Macrocinética de procesos enzimáticos. Desarrollo de métodos para producir catalizadores heterogéneos mediante la inmovilización de enzimas en descomposición. medios (ver Enzimas inmovilizadas) requirió el análisis de la cinética de los procesos teniendo en cuenta la transferencia de masa del sustrato. La cinética de las reacciones se ha estudiado teórica y experimentalmente, teniendo en cuenta los efectos de la capa de difusión y para sistemas con dificultades de intradifusión durante la distribución de la enzima dentro del portador.
En condiciones donde la cinética del proceso se ve afectada por la transferencia por difusión del sustrato, catalítico. la eficiencia del sistema disminuye. El factor de eficiencia es igual a la relación entre la densidad del flujo del producto en condiciones de flujo enzimático con una concentración de sustrato reducida de manera difusa y el flujo que podría realizarse en ausencia de restricciones de difusión. En la región puramente de difusión, cuando la velocidad del proceso está determinada por la transferencia de masa del sustrato, el factor de eficiencia para sistemas con inhibición de difusión externa es inversamente proporcional al módulo de difusión:
Dónde
espesor de la capa de difusión, D - coeficiente. difusión del sustrato.
Para sistemas con inhibición de intradifusión en regiones de primer orden
donde Ф t- módulo adimensional (módulo de Thiele).
Al analizar la cinética Los patrones en los reactores enzimáticos son ampliamente teóricos. y experimentar. Se han desarrollado modelos de reactores “ideales”: reactor de flujo (reactor de flujo con mezcla ideal), reactor de flujo con desplazamiento ideal y reactor de membrana.
Cinética de procesos multienzimáticos. En el cuerpo (célula), las enzimas no actúan de forma aislada, sino que catalizan cadenas de transformación de moléculas. R-ciones en sistemas multienzimáticos con cinética. puntos de vista pueden considerarse consistentes. procesos, específicos Una característica de la cual son las enzimas de cada una de las etapas:
Dónde ,
resp. máx, velocidad de proceso y constante de Michaelis i octava etapa del distrito, respectivamente.
Una característica importante del proceso es la posibilidad de formar un estado estacionario estable. La condición para que ocurra puede ser la desigualdad. > v 0 , donde v 0 es la velocidad de la etapa límite, caracterizada por la constante de velocidad más pequeña y, por lo tanto, determina la velocidad de todo lo que sigue. proceso. En el estado estacionario, las concentraciones de metabolitos después de la etapa limitante son menores que la constante de Michaelis de la enzima correspondiente.
Específico el grupo de sistemas multienzimáticos está formado por sistemas que realizan oxidación-reducción. r-ciones con la participación de portadores de electrones de proteínas. Los transportistas forman estructuras, complejos con una secuencia determinista de transferencia de electrones. Cinético. la descripción de este tipo de sistemas considera el estado de los circuitos con descomposición como una variable independiente. grado de población de electrones.
Solicitud. F.r. K. se utilizan ampliamente en la práctica de la investigación para estudiar los mecanismos de acción de las enzimas y los sistemas enzimáticos. Un área prácticamente importante de la ciencia de las enzimas es enzimología de ingeniería, opera con los conceptos de F. r. para la optimización de la biotecnología. procesos.
Iluminado.: Poltorak O. M., Chukhrai E. S., Fundamentos fisicoquímicos de la catálisis enzimática, M., 1971; Berezin I.V., Martinek K., Fundamentos de química física de catálisis enzimática, M., 1977; Varfolomeev S. D., Zaitsev S. V., Métodos cinéticos en la investigación bioquímica, M.. 1982. S. D. Varfolomeev.
Enciclopedia química. - M.: Enciclopedia soviética. Ed. I. L. Knunyants. 1988 .
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Conferencia No. 6
Conceptos básicos de la catálisis enzimática.
Una breve historia del estudio de la cinética de reacciones enzimáticas. Dependencia de la velocidad de la reacción enzimática de la temperatura, el pH, la concentración de enzima y la concentración de sustrato. Derivación de la ecuación de Michaelis-Menten. Actividad enzimática. La constante catalítica es el número de revoluciones de la enzima. Velocidad máxima de reacción enzimática (V max). Constante de disociación del complejo enzima-sustrato (K s). Constante de Michaelis-Menten (K m).
Una breve historia del estudio de la cinética de reacciones enzimáticas.
La cinética enzimática estudia los patrones de influencia de la naturaleza química de las sustancias que reaccionan (enzimas, sustratos) y las condiciones de su interacción (concentración, pH, temperatura, presencia de activadores o inhibidores) sobre la velocidad de las reacciones enzimáticas. El objetivo principal del estudio de la cinética de reacciones enzimáticas es obtener información que pueda ayudar a dilucidar el mecanismo molecular de acción de las enzimas.
Los principios generales de la cinética de reacciones químicas también se aplican a las reacciones enzimáticas.
El primer intento de describir matemáticamente las reacciones enzimáticas lo realizó Duclos en 1898. Brown (1902) y, independientemente de él, Henri (1903) fueron los primeros en plantear la hipótesis de la formación de un complejo enzima-sustrato durante la reacción. Esta suposición se basó en tres hechos experimentales:
1. la papaína forma un compuesto insoluble con fibrina (Wurtz, 1880);
2. la sacarosa protege a la enzima invertasa de la desnaturalización térmica (O'Sullivan y Thompson, 1890);
3. Fischer en 1898-1899 demostró que las enzimas son catalizadores estereoquímicamente específicos.
MICHAELIS, Leonor
Leonor Michaelis es una bioquímica y química orgánica alemana, fundadora de la cinética de los procesos enzimáticos. Los principales trabajos están dedicados al estudio de reacciones enzimáticas. En 1913, introdujo una constante (constante de Michaelis) en la ecuación de la dependencia de la velocidad de una reacción enzimática de la concentración del sustrato en estado estacionario (ecuación de Michaelis-Menten).
Dependencia de la velocidad de la reacción enzimática de la temperatura, el pH, la concentración de enzima y la concentración de sustrato.
Los experimentos preliminares para estudiar la cinética de reacciones enzimáticas mostraron que la velocidad de la reacción E + S E + P, contrariamente a las expectativas teóricas, no depende de la concentración de la enzima y el sustrato como en el caso de una reacción convencional de segundo orden.
Al mismo tiempo, a las enzimas se les aplican tres criterios principales, que también son característicos de los catalizadores inorgánicos, a saber:
1. Permanecen sin cambios después de la reacción, es decir. cuando se liberan, pueden reaccionar nuevamente con nuevas moléculas de sustrato (aunque no se pueden descartar efectos secundarios de las condiciones ambientales sobre la actividad de la enzima).
2. Las enzimas pueden actuar en concentraciones insignificantes (por ejemplo, una molécula de la enzima renina, contenida en la mucosa del estómago de un ternero, cuaja alrededor de 10 6 moléculas de caseinógeno lácteo en 10 minutos a una temperatura de 37 ° C). La presencia o ausencia de una enzima o cualquier otro catalizador no afecta el valor de la constante de equilibrio y la energía libre (ΔG).
3. Los catalizadores sólo aumentan la velocidad a la que el sistema se acerca al equilibrio termodinámico, sin desplazar el punto de equilibrio.
La actividad de la enzima está influenciada por todos aquellos factores que pueden provocar un cambio en su estructura, es decir, dichos factores incluyen:
3. Fuerzas que actúan en medios fluidos (fuerzas hidrodinámicas, presión hidrostática y tensión superficial)
4. Agentes químicos (alcohol, urea o peróxido de hidrógeno, etc.)
5. Irradiación (luz, sonido, radiación ionizante)
6. Varios compuestos químicos que se unen a enzimas pueden cambiar la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas.
A veces, una disminución de la actividad catalítica, provocada, por ejemplo, por un cambio de pH, es reversible. En tales casos, el retorno a las condiciones iniciales va acompañado de la restauración de la actividad enzimática. También es posible un cambio irreversible en la actividad enzimática.
Consideremos la influencia de varios factores en la velocidad de una reacción enzimática.
Efecto de la temperatura
Una de las ecuaciones básicas de la cinética química es la ecuación de Arrhenius, que expresa la dependencia de la constante de velocidad de reacción de la temperatura:
Sin embargo, el rango de temperatura de las reacciones enzimáticas para las cuales es aplicable la ecuación de Arrhenius es muy estrecho para la mayoría de las enzimas. ¿Qué sucede si intentamos forzar a la enzima a catalizar el proceso aún más rápido elevando la temperatura por encima de la fisiológicamente aceptable? A altas temperaturas, cuando comienza a dominar el proceso de inactivación térmica de la enzima, se viola la dependencia de la velocidad de reacción con la temperatura, descrita por la ecuación de Arrhenius, es decir, después de un cierto máximo de temperatura, la velocidad de reacción cae rápidamente a cero. . Por otro lado, cuando la temperatura cae por debajo de 0°C, la velocidad de reacción también cae a cero, es decir. la reacción se detiene por completo. Por lo tanto, las reacciones enzimáticas tienen una dependencia en forma de campana de la velocidad de reacción de la temperatura, lo que se explica por la superposición de dos efectos: un aumento en la velocidad de reacción al aumentar la temperatura y la aceleración de la desnaturalización térmica de la molécula de proteína, lo que conduce a la inactivación de la enzima a altas temperaturas. La desnaturalización de la mayoría de las proteínas comienza en el rango de temperatura de 45 a 50°C y finaliza muy rápidamente a 55°C. El cese de las reacciones enzimáticas a bajas temperaturas se debe a que las soluciones acuosas se congelan.
Por tanto, la termolabilidad o sensibilidad al aumento de temperatura es una de las propiedades características de las enzimas que las distingue claramente de los catalizadores inorgánicos. A una temperatura de 90°C, casi todas las enzimas pierden su actividad (las únicas excepciones son dos enzimas: la mioquinasa, que puede resistir el calentamiento hasta 100°C, y la ADN polimerasa de bacterias termófilas a un máximo de 90°C). La temperatura óptima para la acción de la mayoría de las enzimas en animales de sangre caliente es de 40 a 45°C; En estas condiciones, la velocidad de reacción es máxima debido a un aumento en la energía cinética de las moléculas que reaccionan. A bajas temperaturas (4°C y menos), las enzimas generalmente no se destruyen, aunque su actividad cae casi a cero. Este fenómeno es provocado por un cambio en la estructura del centro activo de la enzima debido a una disminución en la densidad del agua. En todos los casos es importante el tiempo de exposición a la temperatura adecuada. Actualmente, para la pepsina, la tripsina y varias otras enzimas, se ha demostrado la existencia de una relación directa entre la tasa de inactivación de la enzima y el grado de desnaturalización de las proteínas. Por tanto, el efecto de la temperatura sobre la velocidad de una reacción enzimática obedece a la ecuación de Arrhenius sólo en un rango de temperatura relativamente estrecho de 4-45°C. Fuera de este rango, las velocidades de reacciones enzimáticas disminuyen drásticamente, lo que se tiene en cuenta y se utiliza en la tecnología alimentaria y durante el almacenamiento de productos alimenticios y medicamentos que contienen enzimas. Dar ejemplos.
Influencia del pH del ambiente.
Las enzimas, como todas las proteínas, están formadas por aminoácidos. Dependiendo del pH, los radicales de algunos aminoácidos y, por tanto, de la proteína en su conjunto, pueden adquirir carga. Los grupos cargados a menudo se incluyen en los sitios activos de las enzimas, ya que varios mecanismos de catálisis enzimática se basan en catálisis ácida o básica. Una condición necesaria para la catálisis ácida o básica puede ser la presencia de una determinada carga en los grupos ionizables del centro activo. De ello se deduce que la forma catalíticamente activa de la enzima existe sólo en un estado de ionización estrictamente definido y, dependiendo del pH, se puede convertir en ella una parte mayor o menor de la enzima total presente en la mezcla.
La dependencia de la actividad enzimática del pH tiene forma de campana con un máximo bastante estrecho. Para diferentes enzimas, el valor de pH al que la enzima tiene máxima actividad es diferente. En los experimentos, el estudio de las dependencias del pH de las reacciones enzimáticas se utiliza a menudo para estudiar el número y las propiedades de los grupos ionógenos.
Al determinar la dependencia de la actividad enzimática de la concentración de iones de hidrógeno, la reacción se lleva a cabo a diferentes valores de pH del medio, generalmente a una temperatura óptima y en presencia de concentraciones de sustrato suficientemente altas (saturadas). La figura y la tabla muestran los valores de pH óptimos para varias enzimas.
Arroz. Dependencia de la actividad enzimática del pH.
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De los datos de la tabla. 4.3 se puede observar que el pH óptimo de la acción enzimática se encuentra dentro de los valores fisiológicos. La excepción es la pepsina, cuyo pH óptimo es 2,0 (a pH 6,0 no es activa ni estable). Esto se explica, en primer lugar, por la organización estructural de la molécula de enzima y, en segundo lugar, por el hecho de que la pepsina es un componente del jugo gástrico que contiene ácido clorhídrico libre, lo que crea un ambiente ácido óptimo para la acción de esta enzima. Por otra parte, el pH óptimo de la arginasa se encuentra en la zona altamente alcalina (aproximadamente 10,0); No existe tal ambiente en las células del hígado; por lo tanto, in vivo, la arginasa aparentemente no funciona en su zona de pH óptima.
Según los conceptos modernos, el efecto de los cambios en el pH del medio ambiente sobre la molécula de enzima es influir en el estado y grado de ionización de los grupos ácidos y básicos (en particular, el grupo COOH de los aminoácidos dicarboxílicos, el grupo SH de la cisteína , el nitrógeno imidazol de la histidina, el grupo NH 2 de la lisina, etc.). Con cambios bruscos del pH óptimo del medio ambiente, las enzimas pueden sufrir cambios conformacionales, lo que lleva a una pérdida de actividad debido a la desnaturalización o un cambio en la carga de la molécula de enzima. A diferentes valores de pH del medio, el centro activo puede estar parcialmente ionizado o no ionizado, lo que afecta la estructura terciaria de la proteína y, en consecuencia, la formación del complejo enzima-sustrato activo. Además, es importante el estado de ionización de sustratos y cofactores.
Información relacionada.
Velocidad de reacción enzimática
La velocidad de una reacción enzimática se mide por la cantidad de sustrato convertido por unidad de tiempo o la cantidad de producto formado. La velocidad está determinada por el ángulo de inclinación de la tangente a la curva en la etapa inicial de la reacción.
Arroz. 2 Velocidad de reacción enzimática.
Cuanto más pronunciada sea la pendiente, mayor será la velocidad. Con el tiempo, la velocidad de reacción suele disminuir, en gran parte como resultado de la disminución de la concentración de sustrato.
Factores que afectan la actividad enzimática.
La acción de F. depende de varios factores: temperatura, reacción ambiental (pH), concentración de enzima, concentración de sustrato y la presencia de activadores específicos e inhibidores específicos o inespecíficos.
Concentración de enzimas
A altas concentraciones de sustrato y otros factores permanecen constantes, la velocidad de la reacción enzimática es proporcional a la concentración de la enzima.
Arroz. 3 Dependencia de la velocidad de la reacción enzimática de la concentración de la enzima.
La catálisis siempre ocurre en condiciones donde la concentración de la enzima es mucho menor que la concentración del sustrato. Por tanto, a medida que aumenta la concentración de la enzima, también aumenta la velocidad de la reacción enzimática.
Temperatura
El efecto de la temperatura sobre la velocidad de una reacción enzimática se puede expresar mediante el coeficiente de temperatura Q 10: Q 10 = (velocidad de reacción a (x + 10) °C) / (velocidad de reacción a x °C)
Entre 0-40°C, el Q10 de una reacción enzimática es 2. En otras palabras, por cada aumento de 10°C en la temperatura, la velocidad de la reacción enzimática se duplica.
Arroz. 4 La influencia de la temperatura en la actividad de una enzima como la amilasa salival.
A medida que aumenta la temperatura, el movimiento de las moléculas se acelera y es más probable que las moléculas de las sustancias que reaccionan choquen entre sí. En consecuencia, aumenta la probabilidad de que se produzca una reacción entre ellos. La temperatura que proporciona mayor actividad se llama óptima. Más allá de este nivel, la velocidad de la reacción enzimática disminuye, a pesar del aumento en la frecuencia de colisiones. Esto ocurre debido a la destrucción de las estructuras secundarias y terciarias de la enzima, es decir, debido a que la enzima sufre una desnaturalización.
Arroz. 5 El curso de la reacción enzimática a diferentes temperaturas.
Cuando la temperatura se acerca o cae por debajo del punto de congelación, las enzimas se inactivan, pero no se produce la desnaturalización. Al aumentar la temperatura, su actividad catalítica se restablece nuevamente.
Dado que las proteínas en estado seco se desnaturalizan mucho más lentamente que las proteínas hidratadas (en forma de gel o solución de proteínas), la inactivación del fósforo en estado seco ocurre mucho más lentamente que en presencia de humedad. Por lo tanto, las esporas bacterianas secas o las semillas secas pueden resistir el calentamiento a temperaturas mucho más altas que las mismas esporas o semillas en estado húmedo.
Concentración de sustrato
Para una concentración de enzima dada, la velocidad de la reacción enzimática aumenta al aumentar la concentración de sustrato.
Arroz. 6 Dependencia de la velocidad de la reacción enzimática de la concentración del sustrato.
La velocidad de reacción máxima teórica Vmax nunca se alcanza, pero llega un momento en que un aumento adicional en la concentración de sustrato ya no implica ningún cambio perceptible en la velocidad de reacción. Esto debería explicarse por el hecho de que a altas concentraciones de sustrato, los centros activos de las moléculas de fósforo están prácticamente saturados en un momento dado. Por lo tanto, no importa cuánto exceso de sustrato esté disponible, puede combinarse con la enzima sólo después de que el complejo enzima-sustrato previamente formado se disocia en producto y enzima libre. Por lo tanto, a altas concentraciones de sustrato, la velocidad de la reacción enzimática está limitada por ambos. concentración del sustrato y el tiempo necesario para la disociación del complejo enzima-sustrato.
A una temperatura constante, cualquier fósforo funciona más eficazmente dentro de un rango de pH estrecho. El valor de pH óptimo es aquel en el que la reacción se desarrolla a máxima velocidad.
Arroz. 7 Dependencia de la actividad enzimática del pH.
A pH más alto y más bajo, la actividad de F. disminuye. El cambio de pH cambia la carga de los grupos ácidos y básicos ionizados, de los que depende la forma específica de las moléculas de fósforo. Como resultado, cambia la forma de las moléculas de fósforo y, principalmente, la forma de su centro activo. Si el pH cambia demasiado bruscamente, F. se desnaturaliza. La característica óptima del pH de un fósforo determinado no siempre coincide con el pH de su entorno intracelular inmediato. Esto sugiere que el entorno en el que se encuentra F. regula en cierta medida su actividad.
Cinética de reacciones enzimáticas. La cinética estudia las velocidades, los mecanismos de las reacciones y la influencia sobre ellas de factores como las concentraciones de enzimas y sustratos, la temperatura, el pH del medio ambiente, la presencia de inhibidores o activadores.
A una concentración de sustrato constante, la velocidad de reacción es directamente proporcional a la concentración de enzima. La gráfica de la dependencia de la velocidad de una reacción enzimática de la concentración del sustrato tiene la forma de una hipérbola equilátera.
Dependencia de la velocidad de la reacción enzimática de la concentración de enzima (a) y sustrato (b)
Se describe la dependencia de la velocidad de una reacción enzimática de la concentración del sustrato. Ecuación de Michaelis-Menten:
donde V es la velocidad en estado estacionario de la reacción bioquímica; Vmax - velocidad máxima; Km - constante de Michaelis; [S] - concentración de sustrato.
Si la concentración de sustrato es baja, es decir, [S]<< Кm, то [S] в знаменателе можно пренебречь.
Entonces 
Por tanto, a bajas concentraciones de sustrato, la velocidad de reacción es directamente proporcional a la concentración de sustrato y se describe mediante una ecuación de primer orden. Esto corresponde al tramo recto inicial de la curva V = f[S] (Figura b).
A altas concentraciones de sustrato [S] >> Km, cuando Km puede despreciarse, la ecuación de Michaelis-Menten toma la forma, es decir V=Vmáx.
Por tanto, a altas concentraciones de sustrato, la velocidad de reacción se vuelve máxima y se describe mediante una ecuación de orden cero. Esto corresponde a la sección de la curva V =f [S] paralela al eje de abscisas.
A concentraciones de sustrato numéricamente comparables a la constante de Michaelis, la velocidad de reacción aumenta gradualmente. Esto concuerda bastante con las ideas sobre el mecanismo de reacción enzimática:
donde S es el sustrato; E - enzima; ES - complejo enzima-sustrato; P - producto; k1 es la constante de velocidad para la formación del complejo enzima-sustrato; k2 es la constante de velocidad de descomposición del complejo enzima-sustrato con la formación de reactivos iniciales; k3 es la constante de velocidad de descomposición del complejo enzima-sustrato con la formación de un producto.
Tasa de conversión del sustrato con la formación del producto (P) es proporcional a la concentración del complejo enzima-sustrato. A bajas concentraciones de sustrato en solución hay un cierto número de moléculas de enzima libres (E) que no están unidas a un complejo (ES). Por lo tanto, a medida que aumenta la concentración del sustrato, aumenta la concentración de los complejos y, por tanto, también aumenta la velocidad de formación del producto. A altas concentraciones de sustrato, todas las moléculas de enzima están unidas en un complejo ES (el fenómeno de saturación de enzimas), por lo tanto, un aumento adicional en la concentración de sustrato prácticamente no aumenta la concentración de los complejos y la velocidad de formación del producto permanece constante.
Por tanto, queda claro el significado físico de la velocidad máxima de una reacción enzimática. Vmax es la velocidad a la que reacciona una enzima cuando existe enteramente como un complejo enzima-sustrato..
La constante de Michaelis corresponde numéricamente a la concentración de sustrato a la que la velocidad en estado estacionario es igual a la mitad del máximo. Esta constante caracteriza la constante de disociación del complejo enzima-sustrato:
Significado físico de la constante de Michaelis porque caracteriza la afinidad de la enzima por el sustrato. Km tiene valores pequeños cuando k1 > (k2 + k3), es decir el proceso de formación del complejo ES prevalece sobre los procesos de disociación de ES. En consecuencia, cuanto menor sea el valor de Km, mayor será la afinidad de la enzima por el sustrato. Y, a la inversa, si Km es de gran importancia, entonces (k2 + k3) > k1 y predominan los procesos de disociación ES. En este caso, la afinidad de la enzima por el sustrato es baja.
Inhibidores y activadores de enzimas. . Inhibidores de enzimas Se llaman sustancias que reducen la actividad enzimática. Cualquier agente desnaturalizante (por ejemplo, sales de metales pesados, ácidos) son inhibidores enzimáticos inespecíficos.
Inhibidores reversibles- Estos son compuestos que interactúan de forma no covalente con la enzima. Inhibidores irreversibles- Estos son compuestos que se unen específicamente a los grupos funcionales del centro activo y forman enlaces covalentes con la enzima.
La inhibición reversible se divide en competitiva y no competitiva. Inhibición competitiva sugiere similitud estructural entre el inhibidor y el sustrato. El inhibidor ocupa espacio en el sitio activo de la enzima y una cantidad significativa de moléculas de enzima quedan bloqueadas. La inhibición competitiva se puede eliminar aumentando la concentración del sustrato. En este caso, el sustrato desplaza al inhibidor competitivo del sitio activo.
La inhibición reversible puede ser no competitivo en relación al sustrato. En este caso, el inhibidor no compite por el sitio de unión a la enzima. El sustrato y el inhibidor se unen a diferentes centros, por lo que es posible formar el complejo IE, así como el complejo IES ternario, que puede descomponerse para liberar el producto, pero a un ritmo menor que el complejo ES.
Por la naturaleza de su acción Los inhibidores se dividen en:
- específico,
- inespecífico.
Inhibidores específicos ejercen su efecto sobre la enzima uniéndose con un enlace covalente en el centro activo de la enzima y apagándolo del ámbito de acción.
Inhibición inespecífica Implica el efecto de agentes desnaturalizantes sobre la enzima (sales de metales pesados, urea, etc.). En este caso, como resultado de la destrucción de la estructura cuaternaria y terciaria de la proteína, se pierde la actividad biológica de la enzima.
Activadores enzimáticos- Son sustancias que aumentan la velocidad de las reacciones enzimáticas. Muy a menudo, los iones metálicos (Fe2+, Fe3+, Cu2+, Co2+, Mn2+, Mg2+, etc.) actúan como activadores. Hay metales que se encuentran en las metaloenzimas, que son cofactores, y actuando como activadores de enzimas. Los cofactores pueden unirse estrechamente a la parte proteica de la enzima; en cuanto a los activadores, se separan fácilmente de la apoenzima. Estos metales son participantes obligatorios en el acto catalítico, que determina la actividad de la enzima. Activadores mejorar el efecto catalítico, pero su ausencia no impide que se produzca la reacción enzimática. Como regla general, el cofactor metálico interactúa con grupos del sustrato cargados negativamente. Un metal de valencia variable participa en el intercambio de electrones entre el sustrato y la enzima. Además, participan en la formación de una conformación de transición estable de la enzima, lo que contribuye a una formación más rápida del complejo ES.
Regulación de la actividad enzimática. . Uno de los principales mecanismos para regular el metabolismo es la regulación de la actividad enzimática. Un ejemplo es la regulación alostérica, regulación a través de activadores e inhibidores. A menudo sucede que el producto final de una vía metabólica es un inhibidor de una enzima reguladora. Este tipo de inhibición se llama retroinhibición o inhibición basada en el principio de retroalimentación negativa.
Muchas enzimas se producen como precursores de proenzimas inactivos y luego se activan en el momento adecuado mediante proteólisis parcial. Proteolisis parcial- escisión de parte de la molécula, lo que conduce a un cambio en la estructura terciaria de la proteína y la formación del centro activo de la enzima.
Algunas enzimas oligoméricas pueden cambiar su actividad debido a asociaciones - disociaciones de subunidades, incluidos en su composición.
Muchas enzimas se pueden encontrar en dos formas: como proteína simple y como fosfoproteína. La transición de una forma a otra va acompañada de un cambio en la actividad catalítica.
La velocidad de la reacción enzimática depende de cantidad de enzima, que en una célula está determinada por la relación entre las tasas de síntesis y descomposición. Este método de regular la velocidad de una reacción enzimática es un proceso más lento que regular la actividad enzimática.