Иммуноблоттинг (иммуноблот) - высокоспецифичный и высокочувствительный референтный метод, подтверждающий диагноз для пациентов с положительными или неопределенными результатами анализов, полученных в т.ч. при помощи РИГА или ИФА. Иммуноблоттинг - разновидность гетерогенного иммунного анализа.

Этот метод выявления антител к отдельным антигенам возбудителя основан на постановке ИФА на нитроцеллюлозных мембранах, на которые в виде отдельных полос нанесены специфические белки, разделенные гель-электрофорезом. Если имеются антитела против определенных антигенов -появляется темная линия в соответствующем локусе стрипа. Уникальность иммуноблота заключается в его высокой информативности и достоверности получаемых результатов.

Материалом для исследования является сыворотка или плазма крови человека. Для исследования на одном стрипе необходимо 1,5-2 мл крови или 15-25 мкл сыворотки.

ООО "Лабораторная диагностика" использует иммуноблоттинговые наборы для выявления антител к возбудителям различных заболеваний фирмы "EUROIMMUN" (Германия), "MIKROGEN" (Германия):

ВПГ 1 и ВПГ 2 IgM/IgG (герпесвирусная инфекция)

ЦМВ IgM/IgG (цитомегаловирусная инфекция)

Краснуха IgG

TORCH-профиль IgM (Токсоплазмоз, Краснуха, Цитомегаловирус, ВПГ 1 и ВПГ 2)

ВЭБ IgMTIgG (вирусная инфекция Эпштейна-Барра)

ВГС IgG (вирусный гепатит С)

Используют наборы двух типов - вестерн-блот и лайн-блот.

Вестерн-блот: Наборы содержат тестовые стрипы-мембраны с электрофоретически разделенными нативными антигенами соответствующих инфекционных агентов, т.о. антигены располагаются в порядке молекулярной массы. На мембраны могут быть также нанесены 1-2 дополнительные линии с клинически значимыми антигенами (вестерн-лайн блот). Это надежный подтверждающий метод, исключает ложноположительные ответы и перекрестные реакции.

Лайн-блот: В этом случае на тестовые стрип-мембраны нанесены только клинически значимые антигены (нативные, синтетические или рекомбинантные) в определенном порядке. Такой подход используется при дифференциальной диагностике нескольких инфекций на одном стрипе.

Сущность его заключается в переносе молекул исследуемого вещества с одного твердого носителя, используемого для фракционирования биополимеров, на другой, где с помощью иммунохимической реакции происходит их специфическое выявление. Современный высокочувствительный метод заключается в идентификации белков, в том числе вирусных антигенов. Метод основан на комбинации гель-электрофореза и реакции антиген-антитело. Высокая степень разрешения достигается за счет электрофоретического разделения белков, глико- и липопротеинов и максимальной специфичностью детектирующих иммунных сывороток или моноклональных антител. В оптимально отработанных условиях иммуноблотингом можно обнаруживать антиген в количествах менее 1 нг в испытуемом объеме. Технически иммуноблотинг выполняется в три приема:

1) подлежащие анализу белки подвергаются разделению в полиакриламидном геле в присутствии денатурирующих веществ: додецилсульфата натрия или мочевины, этот процесс часто обозначают как SDS-PAGE; разделенные белки могут визуализироваться после окрашивания и сравниваться с эталонными образцами;

2) разделенные белки переносятся с геля путем наложения (блотинга) на
нитроцеллюлозный фильтр и фиксируются на нем; во многих случаях, но
не всегда, при переносе сохраняются количественные соотношения белков;

3) на фильтры наносятся детектирующие поли- или моноклональные
антитела, содержащие радиоизотопную или ферментную метку; для
обнаружения связавшихся антител применяют также антивидовую
меченую сыворотку, иными словами, на заключительном этане блотинг
аналогичен твердофазным иммунологическим тестам.

Следует иметь в виду, что в данной постановке иммуноблотинга белки находятся в денатурированном состоянии, и поэтому могут не распознаваться антителами, специфическими по отношению к нативному белку, но зато при наличии сывороток ко всем составляющим пептидам одновременно выявляется весь антигенный спектр испытуемого белка. Иммуноблотинг достаточно широко используется в исследованиях строения вирусов гепатитов, в частности, для установления антигенного родства между отдельными штаммами. Высокая разрешающая способность иммуноблотинга позволяет получать хорошие результаты и в диагностической практике, когда требуется идентифицировать вирус в тканях или экскретах больного.

В зависимости от исследуемого вещества различают ДНК,- РНК и белок - блоттинг.

Иммунохимическое выявление антигенов можно проводить с помощью антител, конъюгированных с меткой. В качестве метки в последнее время широко применяют либо радиоактивные изотопы, либо ферменты (пероксидазу, щелочную фосфатазу, лактамазу и др.).

Время блоттинга путем диффузии составляет 36-48 ч. Но наиболее быстрый и эффективный способ переноса белков с гелей - электроблот, время которого, в основном, составляет 1-3 ч, для некоторых высокомолекулярных белков- более 12 ч.

Конкретный выбор сорбентов для различных модификаций блотов (нитроцеллюлоза либо бумага, обработанная соответствующим образом), выбор условий блокирования и иммуно-химического выявления антигенов полностью зависит от антигена, его количества, метода иммуноанализа и целей исследования.

Возможность обнаружить антитела к конкретным антигенам возбудителя позволяет оценить значимость этих антител (специфичность для данного этиологического агента), исключить реакцию на перекрестные антигены. Это и отличает иммуноблоттинг от ИФА, где в качестве антигена могут быть использованы различные комбинации антигенных детерминант - как специфичные, так и нет, дающих перекрестные реакции с другими возбудителями. В другом случае, при получении положительного результата в ИФА можно только предполагать, что он является следствием перекрестного реагирования, а в случае иммуноблоттинга это доказательно

Метод ИБ по целому ряду обстоятельств получил наибольшее распространение как метод, пригодный для использования в качестве теста подтверждения.

Безусловное достоинство метода - возможность тестирования антител к слабо или вовсе нерастворимым антигенам и исключение стадии введения радиоактивной метки в антигены.

О чувствительности в случае ИБ судят по предельному количеству нанесенного на гель антигена, которое при фракционировании белков удается выявить иммунохимически после переноса с геля на твердую фазу (нитроцеллюлозу). Общая чувствительность анализа зависит от целого ряда причин: условий фракционирования и иммобилизации антигена на твердом носителе, уровня фона, специфичности и аффинности антител. Важное значение имеет вид используемой метки и способ ее выявления.

Таким образом, метод иммуноблотинга позволяет идентифицировать зоны антигена на твердой фазе, не связывая весь белок с антителами специфической сыворотки. Иммуноблотинг и его модификации в основном используются для типирования бактериальных и вирусных антигенов и антител, особенно в случае недостаточной разрешающей способности обычных систем, а также при анализе иммуноглобулинов, нуклеиновых кислот или как тест подтверждения в сочетании с другими методами.

Большие трудности интерпретации результатов перекресных при реакциях и в случаях начальных стадий сероконверсии. В первой ситуации при повторном исследовании через промежуток определенный времени антитела не выявляются, а во в втором иммуноблоте появляются новые полосы, свидетельствующие о антител появлении к протеинам или гликопротеидам ВИЧ, характеризуя ответной динамику иммунной реакции на антигены вируса.

Является фактически конечным верификационным методом в цепи серологических исследований, позволяющих сделать окончательное заключение о ВИЧ-позитивности пациента или же отвергнуть таковую. Для постановки ИБ используют нитроцеллюлозные полоски, на которые методом горизонтального и затем вертикального иммунофореза заранее перенесены белки ВИЧ в порядке нарастания их молекулярных масс. Антитела испытываемых сывороток взаимодействуют с белками определенных зонах полоски. Дальнейший ход реакции не отличается от такового для ИФА, то есть предусматривает обработку полоски (стрипа) конъюгатом и хромоген-субстратом с отмыванием не связавшихся компонентов и прекращением реакции дистиллированной водой. Предварительное электрофоретическое разделение белков и их фиксация на нитроцеллюлозе позволяет идентифицировать антитела к конкретным белкам в соответствии с наличием (или отсутствием) окрашивания (серовато-голубого) соответствующих зон полоски. Иммуноблотинг не может использоваться для массового скрининг исследования вследствие высокой стоимости и является методом индивидуального арбитража на заключительном этапе серологического исследования.

Существует достаточно четкие корреляции между результатами исследования сывороток в ИБ и ИФА. Дважды положительные в ИФА (в разных тест-системах) сыворотки интерпретируются затем в ИБ как ВИЧ-позитивные в 97-98% случаев. Сыворотки, положительные в ИФА лишь в одной из двух использованных тест-системах, оказываются ВИЧ-позитивными в ИБ не чаще, чем в 4% случаев. При проведении подтверждающих исследований около 5% ИБ могут давать так называемые "неопределенные" результаты, которым, как правило, соответствуют положительные ИФА, но не РИП. Примерно в 20% случаев "неопределенные" ИБ вызывают антитела к gag- белкам ВИЧ-1 (р55, р25, р18). При получении сомнительных результатов иммуноблотинга необходимо исследование повторить через 3 месяца и при сохранении неопределённости результата - через 6 месяцев.

Радио-иммунный метод (РИМ)(Радиоиммунологический анализ, РИА) Радиоиммунный анализ - метод количественного определения биологически активных веществ, (гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и др.) в биологических жидкостях, основанный на конкурентном связывании искомых стабильных и аналогичных им меченных радионуклидом веществ со специфическими связывающими системами. Последними чаще всего являются специфические антитела. В связи с тем, что меченый антиген добавляют в определенном количестве, можно определить часть вещества, которая связалась с антителами, и часть, оставшуюся несвязанной в результате конкуренции с выявляемым немеченым антигеном. Исследование выполняют in vitro. Для Р. а. выпускают стандартные наборы реагентов, каждый из которых предназначен для определения концентрации какого-либо одного вещества. Исследование проводят в несколько этапов: смешивают биологический материал с реагентами, инкубируют смесь в течение нескольких часов, разделяют свободное и связанное радиоактивное вещество, осуществляют радиометрию проб, рассчитывают результаты. Метод отличается высокой чувствительностью, его можно использовать в диагностике заболеваний сердечно-сосудистой, эндокринный и других систем, для установления причин бесплодия, нарушения развития плода, в онкологии для определения маркеров опухолей и контроля за эффективностью лечения, для определения концентрации в крови иммуноглобулинов, ферментов и лекарственных веществ. В ряде случаев исследования выполняют на фоне нагрузочных функциональных проб (например, определение содержания инсулина в сыворотке крови на фоне пробы на толерантность к глюкозе) либо в динамике (например, определение в крови половых гормонов на протяжении менструального цикла).

С помощью коммерческого набора фирмы “ЭББОТТ” - Австрия II-I 125 удается выявлять HBsAg в концентрациях до 0, 1 нг/мл. К преимуществам метода можно отнести возможность стандартизации и автоматизации метода с получением ответов в цифровом выражении. Недостатком метода являются ограничения, определяемые режимом работы с радиоактивным материалом, и относительно короткий срок годности диагностического набора, что связано с распадом радиоактивной метки.

Диагностические наборы для выявления различных антигенов вирусов гепатитов А, В и D и антител к ним выпускаются фирмой “Изотоп” (Ташкент) и некоторыми зарубежными фирмами (например, фирмой “ЭББОТТ”). В качестве твердой фазы применяются полистироловые шарики (“ЭББОТТ”) или пробирки (“Изотоп”). Для метки антител или антигенов чаще всего используется изотоп I 125, который имеет период полураспада 60 дней и высокую удельную радиоактивность. Измерение радиоактивной метки, т. е. излучения, проводится на специальных счетчиках - радиоспектрометрах. Подсчет радиоактивных импульсов как в контрольных, так и исследуемых образцах проводится в единое фиксированное время, обычно в течение 1 минуты. При анализе результатов реакции необходимо учитывать наличие фона радиоактивности, который может влиять на конечный результат реакции. Причинами повышенного фона могут быть: загрязнение контейнера или гнезда для пробы; неправильная настройка прибора; наличие источника сильного излучения вблизи прибора.

Для подтверждения положительного результата, полученного при первичном скрининге образцов, рекомендуется повторное исследование РИА или в альтернативном тесте. При обнаружении HBsAg необходимо проводить конфирмационный тест.

Таблица 1.Классификация вакцин

Список литературы:

Обязательная:

1. Хаитов P.M., Игнатьева Г.А.,Сидорович И.Г. Иммунология:Учебник.-М.:Медицина,2000.- 432 с: ил.(Учеб. лит. для студ. медвузов).

2. Ковальчук Л.В и др. Иммунология: практикум: учеб. пособие – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2012. – 176 с.

3. Поздеев О.К. Медицинская микробиология / под ред. акад. РАМН В.И. Покровского - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2001. – 768 с.

4. Борисов Л.Б. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. М. 1997 г.

Дополнительная:

1. Генкель П.А., Микробиология с основами вирусологии. М.,1974 г.

2. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология: учебник для мед. вузов.- 3-е издание, испр. и доп. – СПб, СпецЛит. 2002. – 591 с.

3. Борисов Л.Б., Смирнова А.М., Медицинская микробиология, вирусология, иммунология, М., Медицина. 1994 г.

4. Тимаков В.Д., Левашов В.С., Борисов Л.Б. Микробиология. М. 1983 г.

Иммунный блоттинг (иммуноблот, Western Blot, вестерн-блот) - сочетает в себе иммуноферментный анализ (ИФА) с предварительным электрофоретическим переносом на нитроцеллюлозную полоску (стрип) антигенов вируса.

В этом красивом ученом названии «blot» переводится скорее всего как «клякса», а «western» - как « западная» отражает направление распространения этой «кляксы» по бумаге слева направо, то есть на географической карте это соответствует направлению с запада на восток.». Суть метода «иммунный блот» заключается в том, что иммуноферментную реакцию проводят не со смесью антигенов, а с антигенами ВИЧ, предварительно распределенными методом иммунофореза по фракциям, располагающимся согласно молекулярному весу по поверхности нитроцеллюлозной мембраны. В результате основные белки ВИЧ, носители антигенных детерминант, распределяются по поверхности в виде отдельных полос, которые и проявляются при проведении иммуноферментной реакции.

Иммуноблот включает в себя несколько стадий:

Подготовка стрипа. Предварительно очищенный и разрушенный до составных компонентов вирус иммунодефицита (ВИЧ) подвергается электрофорезу, при этом входящие в состав ВИЧ антигены разделяются по молекулярному весу. Затем методом блоттинга (аналог выдавливания на "промокашку" избытка чернил) антигены переносят на полоску нитроцеллюлозы, которая отныне содержит невидимый пока глазом спектр антигенных полос, характерный для ВИЧ.

Исследование пробы. На нитроцеллюлозную полоску наносится исследуемый материал (сыворотка, плазма крови пациента и т.п.), и если в пробе есть специфические антитела, то они связываются со строго соответствующими им (комплиментарными) антигенными полосами. В результате последующих манипуляций результат этого взаимодействия визуализируется - делается видимым.

Трактовка результата. Наличие полос в на определённых участках нитроцеллюлозной пластины подтверждает присутствие в исследованной сыворотке антител к строго определённым антигенам ВИЧ.

Полоска А - Положительный контроль

Полоска В - Слабоположительный контроль

Полоска С - Отрицательный контроль

Полоска D - Положительный образец (обнаружено присутствие антител к ВИЧ-1)

В настоящее время иммунный блоттинг (иммуноблот) является основным методом для подтверждения наличия вирусспецифических антител в исследуемой сыворотке. В некоторых случаях ВИЧ-инфекции, до развития сероконверсии, специфические антитела более эффективно выявляются методом иммунного блоттинга, чем ИФА. При исследовании методом иммунного блоттинга обнаружено, что чаще всего в сыворотках больных СПИДом выявляются антитела к gp 41, причем обнаружение р24 у лиц, обследуемых с профилактической целью, требует дополнительных исследований на наличие у них ВИЧ-инфекции. Тест-системы для иммунного блоттинга на основе рекомбинантных белков, полученных путем генной инженерии, оказались более специфичными, чем обычные системы на основе очищенного вирусного лизата. При использовании рекомбинантного антигена формируется не диффузная, а четко выраженная узкая полоска антигена, легко доступная для учета и оценки.

Сыворотки лиц, инфицированных ВИЧ-1, обнаруживают антитела к следующим основным белкам и гликопротеидам - структурным белкам оболочки (env) - gp160, gp120, gp41; ядра (gag) - p17, p24, p55, а также ферментов вируса (pol) - p31, p51, p66. Для ВИЧ-2 типичны антитела к env - gp140, gp105, gp36; gag - p16, p25, p56; pol - p68.

Среди лабораторных методов, необходимых для установления специфичности реакции, наибольшее признание имеет обнаружение антител к белкам оболочки ВИЧ-1- gp41, gp120, gp160, и ВИЧ-2 - gp36, gp105, gp140.

ВОЗ считает положительными сыворотки, в которых методом иммунного блотинга обнаруживаются антитела к каким-либо двум гликопротеидам ВИЧ. Согласно этим рекомендациям, при наличии реакции только с одним из белков оболочки (гп 160, гп 120, гп 41) в сочетании или без реакции с другими белками, результат считается сомнительным и рекомендуется повторное исследование, используя набор другой серии или другой фирмы. Если и после этого результат остается сомнительным, рекомендуется наблюдение в течение 6 месяцев (исследования через 3 месяца).

Наличие положительной реакции с антигеном p24 может указывать на период сероконверсии, так как антитела именно к этому белку иногда появляются первыми. В этом случае рекомендуется, в зависимости от клинических и эпидемиологических данных, повторить исследование с образцом сыворотки, взятым как минимум через 2 недели, и это является как раз тем случаем, когда при ВИЧ-инфекции необходимо исследование парных сывороток.

Положительные реакции с белками gag и pol без наличия реакции с белками env могут отражать стадию ранней сероконверсии, а также может указывать на ВИЧ-2 инфекцию или на неспецифическую реакцию. Лиц с такими результатами после тестирования на ВИЧ-2 повторно исследуют через 3 месяца (в течение 6 месяцев).

Описание

Метод определения Иммуноблот.

Исследуемый материал Сыворотка крови

Доступен выезд на дом

Антинуклерные антитела представляют семейство аутоантител, связывающихся с рибонуклеиновыми кислотами и ассоциированными с ними белками. Они встречаются более чем у 90% больных с диффузными болезнями соединительной ткани, а также часто отмечаются при аутоиммунных заболеваниях печени и ряде других состояний. На сегодняшний день охарактеризованы около 200 разновидностей этого семейства аутоантител, но не все они могут быть использованы в клинической практике.

Иммуноблот антинуклеарных антител позволяет в одном тесте одновременно провести исследование 15 основных разновидностей антинуклеарных антител, что обеспечивает проведение дифференциальной диагностики основных системных ревматических заболеваний. Каждая разновидность аутоантител, выявляемая с помощью иммуноблота, обычно отмечается у пациентов с характерной клинической картиной, поэтому спектр аутоантител позволяет не только диагностировать заболевание, но и установить риск развития определенных клинических проявлений.

Иммуноблот антинуклеарных антител целесообразно использовать на втором этапе серологического обследования при положительном результате других тестов, указывающих на присутствие в сыворотке обследуемого антинуклеарных антител. К таким тестам относятся определение антиядерных антител (скрининг ИФА ), выявление антинуклеарного фактора (АНФ) на клетках Hep2 (), антинуклеарных антител и антител к экстрагируемому ядерному антигену (ЭНА, ).

Метод иммуноблота антинуклеарных антител в диагностике системных ревматических заболеваний характеризуется высокой клинической специфичностью. Но специфику антинуклеарных антител даже при высоких титрах АНФ () удается установить не всегда, поскольку до сих пор остаются неохарактеризоваными ряд антигенов антинуклеарных антител. Отрицательный результат иммуноблота в этом случае не исключает диагноза системных ревматических заболеваний. Ряд антинуклеарных антител можно выявить с помощью иммуноблота - панель миозит-специфичных аутоантител () и иммуноблота - панель аутоантител при склеродермии ().

Литература

1. Лапин С.В. Тотолян А.А. Иммунологическая лабораторная диагностика аутоиммунных заболеваний/ Издательство «Человек», СПб - 2010. 272 c.
2. Насонов Е.Л., Александрова Е.Н. Современные стандарты лабораторной диагностики ревматических заболеваний. Клинические рекомендации / БХМ, М - 2006.
3. Conrad K, Schlosler W., Hiepe F., Fitzler M.J. Autoantibodies in Organ Specific Autoimmune Diseases: A Diagnostic Reference/ PABST, Dresden – 2011. 300 p.
4. Conrad K, Schlosler W., Hiepe F., Fitzler M.J. Autoantibodies in Systemic Autoimmune Diseases: A Diagnostic Reference/ PABST, Dresden – 2007. 300 p.
5. Gershvin ME, Meroni PL, Shoenfeld Y. Autoantibodies 2nd ed./ Elsevier Science – 2006. 862 p.
6. Shoenfeld Y., Cervera R, Gershvin ME Diagnostic Criteria in Autoimmune Diseases / Humana Press – 2008. 598 p.
7. Инструкции к набору реагентов.

Подготовка

Предпочтительно выдержать 4 часа после последнего приема пищи, обязательных требований нет.

Показания к назначению

Тест показан для диагностики и дифференциальной диагностики следующих состояний:

• системная красная волчанка;
• подострая кожная волчанка и другие разновидности кожной волчанки;
• смешанное заболевание соединительной ткани;
• синдром Шегрена и ассоциированные заболевания;
• диффузная и локализованная склеродермия, CREST-синдром;
• воспалительные миопатии (полимиозит и дерматомиозит);
• ювенильный хронический артрит;
• аутоиммунный гепатит;
• первичный билиарный цирроз и склерозирующий холангит;
• использование данного теста показано при обнаружении высоких титров антинуклеарного фактора, антинуклеарных антител, антител к экстрагируемому ядерному антигену, антител к ДНК, антител к нуклеосомам и антифосфолипидных антител.

Интерпретация результатов

Интерпретация результатов исследований содержит информацию для лечащего врача и не является диагнозом. Информацию из этого раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. Точный диагноз ставит врач, используя как результаты данного обследования, так и нужную информацию из других источников: анамнеза, результатов других обследований и т.д.

Единицы измерения: качественный тест, результат представляют в форме «обнаружено» или «не обнаружено».

При обнаружении полосы, характеризующей наличие какого-либо вида антител, интенсивность окраски полосы дополнительно описывают количеством плюсов («крестов») для каждого из выявленных видов антител. Увеличение степени позитивности косвенно отражает содержание и аффинность аутоантител.

Референсные значения: антитела к Sm, RNP/Sm, SS-A (60 kДа), SS-A (52 кДа), SS-B, Scl-70, PM-Scl, PCNA, CENР-B, dsDNA, Histone, Nucleosome, Rib P, AMA-M2, Jo-1 не обнаружены.

Результат определения аутоантител представляется в «крестах» для каждого соответствующего антигена. Увеличение степени серопозитивности косвенно отражает содержание и аффинность аутоантител. Варианты результата оценки серопозитивности приведены ниже:

1. Антитела не обнаружены.
2. +/- - пограничный результат;
3. + – низкое содержание аутоантител к специфическому антигену;
4. ++ – среднее содержание аутоантител к специфическому антигену;
5. +++ – высокое содержание аутоантител к специфическому антигену.

Основные заболевания, связанные с выявлением антинуклеарных антител:

Антиген	Значение
Sm (Smith)	Специфический маркер системной красной волчанки (входит в 10-ый критерий СКВ Американского колледжа ревматологов, АСR)
SS-A (Ro52)	Отмечается при различных аутоиммунных заболеваниях, чаще при системной красной волчанке и ее кожных формах, системных ревматических заболеваниях, ревматоидном артрите, аутоиммунных заболеваниях печени и т.д.
SS-A (Ro60)	Системная красная волчанка, кожные формы красной волчанки, фоточувствительность при системной красной волчанке, высокий риск врожденной красной волчанки и поражения сердца плода. Основной серологический показатель при синдроме Шегрена. Нередко отмечается совместно с антителами к SS-A (Ro52) антигену.
SS-B	Синдром Шегрена, системная красная волчанка.
PCNA	Системная красная волчанка, риск волчаночного нефрита.
Рибосомы (Ribo P)	Системная красная волчанка, риск поражения центральной нервной системы.
Нуклеосомы	Системная красная волчанка, высокий риск волчаночного гломерулонефрита.
Двуспиральная ДНК	Специфический маркер системной красной волчанки (входит в 10-ый критерий СКВ ACR), высокий риск волчаночного нефрита.
snRNP/Sm	Смешанное заболевание соединительной ткани, системная красная волчанка с низким риском поражения почек, склеродермия.
Гистоны	Системная красная волчанка, лекарственная волчанка, склеродермия.
Scl-70	Системный склероз с диффузным поражением кожи и внутренних органов.
PM-Scl	Cклеродермия, сопровождающаяся полимиозитом.
CENР-B	CREST-синдром со склеродактилией, телангиэктазиями, подкожными кальцинатами, синдромом Рейно, эзофагитом.
Jo-1	Полимиозит в виде антисинтетазного синдрома.
AMA-M2	Первичный билиарный цирроз, синдром Шегрена.

В России в настоящее время стандартной процедурой лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции является обнаружение антител к ВИЧ с помощью иммуноферментного анализа с последующим подтверждением их специфичности в реакции иммунного блоттинга.

Антитела к ВИЧ появляются у 90-95% зараженных в течение 3 месяцев после заражения, у 5-9% - через 6 месяцев от момента заражения, и у 0,5-1% - в более поздние сроки. Наиболее ранний срок обнаружение антител - 2 недели от момента заражения.

Обнаружение антител к ВИЧ включает 2 этапа. На первом этапе проводится выявление суммарного спектра антител против антигенов ВИЧ с использованием различных тестов: иммуноферментных, агглютинационных, комбинированных, гребеночных, мембранно-фильтрапионных или мембранно-диффузных. На втором этапе методом иммунного блоттинга проводится определение антител к отдельным белкам вируса. В работе допустимо использование только тест-систем, имеющих разрешение к применению Министерства Здравоохранения Российской Федерации. Диагностические процедуры должны проводиться только в соответствии с утвержденными инструкциями по применению соответствующих тестов.

Забор крови производится из локтевой вены в чистую сухую пробирку в количестве 3-5 мл. У новорожденных можно брать пуповинную кровь. Полученный материал (цельную кровь) не рекомендуется хранить более 12 часов при комнатной температуре и более 1 суток в холодильнике при 4-8°С. Наступающий гемолиз может повлиять на результаты анализа. Сыворотка отделяется центрифугированием или обводкой крови по стенке пробирки пастеровской пипеткой либо стеклянной палочкой. Отделенная сыворотка переносится вчистую (лучше стерильную) пробирку, флакон или пластиковый контейнер, и в таком виде она может хранитьел до 7 дней при температуре 4-8°С. При работе следует соблюдать правила техники безопасности, приведенные в «Инструкции по противоэпидемическому режиму в лабораториях диагностики СПИД» №42-28/38-90 от 5 июля 1990 года.

Определении суммарных антител к ВИЧ.

При получении первого положительного результата анализ проводится еще 2 раза (с той же сывороткой и в той же тест-системе). Если при этом был получен хотя бы один положительный результат (два положительных результата из трех постановок в ИФА), сыворотка направляется в референс-лабораторию.

В референс-лаборатории первично-положительная сыворотка (то есть давшая два положительных результата в первой тест-системе) повторно исследуется в ИФА во второй (другой) тест-системе, выбранной для подтверждения.

При получении положительного результата анализа и во второй тест-системе, сыворотку необходимо исследовать в ИБ.

При получении отрицательного результата во второй тест-системе сыворотка повторно исследуется в третьей тест-системе.

В случае получения отрицательного результата анализа и во второй, и в третьей тест-системах, выдается заключение об отсутствии антител к ВИЧ.

При получении положительного результата в третьей тест-системе сыворотка также направляется на исследование в иммунном блоттинге.

Иммунный блоттинг.

Принцип метода заключается в выявлении антител к определенным белкам вируса, иммобилизованным на нитроцеллюлозную мембрану. Белки оболочки вируса (env) ВИЧ-1, обычно обозначаются, как гликопротеины («гп» или «gp»), с молекулярным весом, выраженным в килодальтонах (кд): 160 кд, 120 кд, 41 кд. У ВИЧ-2 гликопротеины имеют вес 140 кд, 105 кд, 36 кд. Белки сердцевины (gag) (обычно обозначаемые как протеины - «п» или «р») у ВИЧ-1 имеют молекулярный вес соответственно 55 кд, 24 кд, 17 кд, а ВИЧ-2 -56кд, 26 кд, 18 кд. Ферменты ВИЧ-1 (pol) имеют молекулярный вес 66 кд, 51 кд, 31 кд, ВИЧ-2-68 кд.

Результаты, полученные в иммунном блоттинге, интерпретируются как положительные, сомнительные и отрицательные.

Положительными (позитивными) считаются пробы, в которых обнаруживаются антитела к 2 или 3 гликопротеинам ВИЧ.

Отрицательными (негативными) считаются сыворотки, в которых не обнаруживается антител ни к одному из антигенов (белков) ВИЧ.

Пробы, в которых обнаруживаются антитела к одному гликопротеину ВИЧ и/или каким-либо протеинам ВИЧ, считаются сомнительными (неопределенными или неинтерпретируемыми).

При получении сомнительного результата с антителами к белкам сердцевины (gag) в иммунном блоттинге с антигенами ВИЧ-1 проводится исследование с антигенами ВИЧ-2.

При получении положительных результатов иммунного блоттинга делается заключение о наличии в исследуемом материале антител к ВИЧ.

При получении отрицательного результата анализа в ИБ выдается заключение об отсутствии антител к ВИЧ.

При получении неопределенного результата (если не был выявлен антиген р24), проводятся повторные исследования на антитела к ВИЧ через 3 месяца,

и при сохранении неопределенных результатов еще через 3 месяца. Если был выявлен антиген р24, повторное обследование проводится через 2 недели после получения первого неопределенного результата.

Если через 6 месяцев после первого обследования вновь будут получены неопределенные результаты, а у пациента не будут выявлены факторы риска заражения и клинические симптомы ВИЧ-инфекции, результат расценивается как ложнололожительный. (При наличии эпидемиологических и клинических показаний серологические исследования повторяются по назначению).

Иммунный блоттинг с применением рекомбинантных вирусоспецифических полипептидов «Блот ВИЧ» отличаются тем, что в нем использованы не сами вирусные белки, а рекомбинантные полипептиды - аналоги антигенов ВИЧ («Env1», «Gag1», «Poll», «Env2»). Рекомбинантный полипептид «Env1» выявляет антитела сразу к gp120 и gp41 ВИЧ-1, полипептид «Gag1» - к антигенам р 17 и р24, полипептид «Ро11» - к антигену р51, полипептид «Env2» к антигенам gp110 и gp38 ВИЧ-2. Положительной считается сыворотка, реагирующая с Env1 или Env2 или с обоими Env (двойная инфекция ВИЧ типа 1 и 2). Реакция только с Poll и Gag рассматривается как сомнительный результат, и в этом случае последующие действия проводятся аналогично случаям сомнительных (неопределенных) результатов классического иммунного блоттинга с использованием лизата ВИЧ.

Особенностями серологической диагностики ВИЧ-инфекции у детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей, является то, что как у зараженных, так и у незараженных детей в первые 6-12 месяцев жизни обнаруживаются антитела к ВИЧ материнского происхождения, которые затем могут исчезать. Критерием, свидетельствующим о наличии у ребенка ВИЧ-инфекции, является обнаружение у него антител к ВИЧ в возрасте 18 и более месяцев. Отсутствие антител к ВИЧ у ребенка в возрасте 18 месяцев, рожденного от инфицированной ВИЧ матери, является критерием, свидетельствующим против наличия у него ВИЧ-инфекции.

По рекомендации ВОЗ иммуноблотинг (вестерн-блот) используется при диагностике ВИЧ-инфекции в качестве дополнительного экспертного метода, который должен подтверждать результаты ИФА . Обычно этим методом перепроверяют положительный результат при ИФА, поскольку он считается более чувствительным и специфичным, хотя более сложным и дорогим.

Иммунный блоттинг сочетает в себе иммуноферментный анализ (ИФА) с предварительным электрофоретическим разделением белков вируса в геле и их переносом на нитроцеллюлозную мембрану. Процедура иммуноблота состоит из нескольких стадий ( рис. 27). Сначала предварительно очищенный и разрушенный до составных компонентов ВИЧ подвергается электрофорезу, при этом все входящие в состав вируса антигены разделяются по молекулярному весу. Затем методом блоттинга антигены переносят из геля на полоску нитроцеллюлозы или нейлонового фильтра, которые отныне содержат невидимый пока глазом спектр белков, характерный для ВИЧ. Далее на стрип наносится исследуемый материал (сыворотка, плазма крови пациента и т.п.), и если в пробе есть специфические антитела, то они связываются со строго соответствующими им полосками белков-антигенов. В результате последующих манипуляций (подобных ИФА) результат этого взаимодействия визуализируется - делается видимым. Наличие полос на определённых участках стрипа подтверждает присутствие в исследованной сыворотке антител к строго определённым антигенам ВИЧ.

Иммунный блоттинг чаще всего используют для подтверждения диагноза ВИЧ-инфекции. ВОЗ считает положительными сыворотки, в которых методом иммунного блотинга обнаруживаются антитела к каким-либо двум белкам оболочки ВИЧ. Согласно этим рекомендациям, при наличии реакции только с одним из белков оболочки (