Зависимость скорости реакции от количества фермента. Скорость ферментативной реакции

Свойства ферментов

1. Зависимость скорости реакции от температуры

Зависимость активности ферментов (скорости реакции) от температуры описывается колоколообразной кривой с максимумом скорости при значениях оптимальной температуры для данного фермента . Повышение скорости реакции при приближении к оптимальной температуре объясняется увеличением кинетической энергии реагирующих молекул.

Зависимость скорости реакции от температуры

Закон о повышении скорости реакции в 2-4 раза при повышении температуры на 10°С справедлив и для ферментативных реакций, но только в пределах до 55-60°С, т.е. до температур денатурации белков. При понижении температуры активность ферментов понижается, но не исчезает совсем.

Как исключение, имеются ферменты некоторых микроорганизмов, существующих в воде горячих источников и гейзеров, у них оптимум температуры приближается к точке кипения воды. Примером слабой активности при низкой температуре может служить зимняя спячка некоторых животных (суслики, ежи), температура тела которых понижается до 3-5°С. Это свойство ферментов также используется в хирургической практике при проведении операций на грудной полости, когда больного подвергают охлаждению до 22°С.

Ферменты могут быть очень чувствительны к изменению температуры:

• у сиамских кошек мордочка, кончики ушей, хвоста, лапок черного цвета. В этих областях температура всего на 0,5°С ниже, чем в центральных областях тела. Но это позволяет работать ферменту, образующему пигмент в волосяных луковицах, при малейшем повышении температуры фермент инактивируется,
• обратный случай - при понижении температуры окружающего воздуха у зайца-беляка пигментообразующий фермент инактивируется и заяц получает белую шубку,
• противовирусный белок интерферон начинает синтезироваться в клетках только при достижении температуры тела 38°С,

Бывают и уникальные ситуации:

• для большинства людей повышение температуры тела на 5°С (до 42°С) несовместимо с жизнью из-за дисбаланса скорости ферментативных реакций. В то же время у некоторых спортсменов обнаружено, что при марафонском беге их температура тела составила около 40°С, максимальная зарегистрированная температура тела была 44°С.

2. Зависимость скорости реакции от рН

Зависимость также описывается колоколообразной кривой с максимумом скорости при оптимальном для данного фермента значении рН.

Данная особенность ферментов имеет существенное значение для организма в его адаптации к изменяющимся внешним и внутренним условиям. Сдвиги величины рН вне- и внутри клетки играет роль в патогенезе заболеваний, изменяя активность ферментов разных метаболических путей.

Для каждого фермента существует определенный узкий интервал рН среды, который является оптимальным для проявления его высшей активности. Например, оптимальные значения рН для пепсина 1,5-2,5, трипсина 8,0-8,5, амилазы слюны 7,2, аргиназы 9,7, кислой фосфатазы 4,5-5,0, сукцинатдегидрогеназы 9,0.

Зависимость скорости реакции от величины pH

Зависимость активности от кислотности среды объясняется наличием аминокислот в структуре фермента, заряд которых изменяется при сдвиге рН (глутамат, аспартат, лизин, аргинин, гистидин). Изменение заряда радикалов этих аминокислот приводит к изменению их ионного взаимодействия при формировании третичной структуры белка, изменению его заряда и появлению другой конфигурации активного центра и, следовательно, субстрат связывается или не связывается с активным центром.

Изменение активности ферментов при сдвиге рН может нести и адаптивные функции. Так, например, в печени ферменты глюконеогенеза требуют меньшей рН, чем ферменты гликолиза , что удачно сочетается с закислением жидкостей организма при голодании или физической нагрузке.

Для большинства людей сдвиги величины рН крови за пределы 6,8-7,8 (при норме 7,35-7,45) несовместимы с жизнью из-за дисбаланса скорости ферментативных реакций. В то же время у некоторых марафонцев обнаружено снижение рН крови в конце дистанции до 6,8-7,0. И ведь при этом они сохраняли работоспособность!

3. Зависимость от количества фермента

При увеличении количества молекул фермента скорость реакции возрастает непрерывно и прямо пропорционально количеству фермента, т.к. большее количество молекул фермента производит большее число молекул продукта.

ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ КИНЕТИКА

изучает закономерности протекания во времени ферментативных р-ций, а также их механизм; раздел кинетики химической.

Каталитич. цикл конверсии в-ва S (субстрата) в продукт P под действием фермента E протекает с образованием промежут. соед. X i :

где ki - константы скорости отдельных элементарных стадий, образования фермент-субстратного комплекса X 1 (ES, комплекс Михаэлиса).

При данной т-ре скорость р-ции зависит от концентраций фермента, субстрата и состава среды. Различают стационарную, предстационарную и релаксационную кинетику ферментативных р-ций.

Стационарная кинетика. В стационарном состоянии по промежуточным соед. (dX i /dt = 0, i = 1, ..., n ) и при избытке субстрата , где [S] 0 и [E] 0 - начальные концентрации соотв. субстрата и фермента, кинетика процесса характеризуется постоянным, неизменным во времени уровнем концентраций промежут. соед., а выражение для скорости процесса v 0 , наз. начальной стационарной скоростью, имеет вид (ур-ние Михаэлиса- Ментен):

(1)

где значения k кат и К м -> ф-ции констант скорости элементарных стадий и заданы ур-нениями:

Величину k кат наз. эффективной каталитич. константой скорости процесса, параметр К м -> константой Михаэлиса. Значение k кат определяется величинами наиб. медленных стадий каталитич. р-ций и иногда наз. числом оборотов фермента (ферментной системы); k кат характеризует число каталитич. циклов, совершаемых ферментной системой в единицу времени. Наиб. распространены , имеющие значение k кат. для специфич. субстратов в диапазоне 10 2 -10 3 с -1 . Типичные значения константы Михаэлиса лежат в интервале 10 -3 - 10 -4 M.

При больших концентрациях субстрата, когда т. е. скорость р-ции не зависит от концентрации субстрата и достигает постоянной величины, наз. макс. скоростью. Графически ур-ние Михаэлиса - Ментен представляет собой гиперболу. Его можно линеаризовать, используя метод двойных обратных величин (метод Лайнуи-вера - Берка), т. е. строя зависимость 1/vот 1/[S] 0 , или др. методы. Линейная форма ур-ния (1) имеет вид:

(2)

Она позволяет определить графически значения К м и v макс (рис. 1).

Рис. 1. График линейной трансформации ур-ния Михаэлиса - Ментен в двойных обратных величинах (по Лайнуиверу - Берку).

Величина К м > численно равна концентрации субстрата, при к-рой скорость р-ции равна , поэтому К м часто служит мерой сродства субстрата и фермента, однако это справедливо лишь, если

Величины К м > и изменяются в зависимости от значений рН. Это связано со способностью участвующих в катализе групп молекулы фермента изменять свое состояние ионизации и, тем самым, свою каталитич. эффективность. В простейшем случае изменение рН приводит к протонированию или депротонированию, по крайней мере, двух ионизирующихся групп фермента, участвующих в катализе. Если при этом только одна форма фермент-субстратного комплекса (напр., ESH) из трех возможных (ES, ESH и ESH 2) способна превращаться в продукт р-ции, то зависимость скорости от рН описывается ф-лой:

где f = 1 + / и f " = 1 + + K" b /> -т. наз. рН-ф-ции Михаэлиса, а К а, К b и К" a , K" b -> константы ионизации групп аи bсоотв. своб. фермента и фермент-субстратного комплекса. В координатах lg - рН эта зависимость представлена на рис. 2, причем тангенсы углов наклона касательных к восходящей, независимой от рН, и нисходящей ветвям кривой должны быть равны соответственно +1, 0 и -1. Из такого графика можно определить значения рК а групп, участвующих в катализе.

Рис. 2. Зависимость каталитич. константы от рН в логарифмич. координатах.

Скорость ферментативной р-ции не всегда подчиняется ур-нию (1). Один из часто встречающихся случаев - участие в р-ции аллостерич. ферментов (см. Регуляторы ферментов), для к-рых зависимость степени насыщения фермента от [S] 0 имеет негиперболич. характер (рис. 3). Это явление обусловлено кооперативностью связывания субстрата, т. е. когда связывание субстрата на одном из участков макромолекулы фермента увеличивает (положит. кооперативность) или уменьшает (отрицат. кооперативность) сродство к субстрату др. участка.

Рис. З Зависимость степени насыщения фермента субстратом от концентрации субстрата при положительной (I) и отрицательной (II) кооперативности, а также в ее отсутствии (III).

Предстационарная кинетика. При быстром смешении р-ров фермента и субстрата в интервале времен 10 -6 -10 -1 с можно наблюдать переходные процессы, предшествующие образованию устойчивого стационарного состояния. В этом предстационарном режиме при использовании большого избытка субстрата система дифференц. ур-ний, описывающая кинетику процессов, линейна. Решение данного типа системы линейных дифференц. ур-ний дается суммой экспоненциальных членов. Так, для кинетич. схемы, представленной выше, кинетика накопления продукта имеет вид:

где A i -> , b, а n -> ф-ции элементарных констант скорости; -корни соответствующего характеристич. ур-ния.

Величина, обратная , наз. характеристич. временем процесса:

Для р-ции, протекающей с участием nпромежут. соед., можно получить nхарактеристич. времен.

Исследование кинетики ферментативной р-ции в предстационарном режиме позволяет получить представление о детальном механизме каталитич. цикла и определить константы скорости элементарных стадий процесса.

Экспериментально кинетику ферментативной р-ции в предстационарном режиме исследуют с помощью метода остановленной струи (см. Струевые кинетические методы), позволяющего смешивать компоненты р-ции в течение 1 мс.

Релаксационная кинетика. При быстром возмущающем воздействии на систему (изменение т-ры, давления, электрич. поля) время, к-рое необходимо системе для достижения нового равновесия или стационарного состояния, зависит от скорости процессов, определяющих каталитич. ферментативный цикл.

Система ур-ний, описывающая кинетику процесса, линейна, если смещение от положения равновесия невелико. Решение системы приводит к зависимостям концентраций компонентов разл. стадий процесса в виде суммы экспоненциальных членов, показатели экспонент к-рых имеют характер времен релаксаций. Результатом исследования является спектр времен релаксации, соответствующий числу промежут. соед., участвующих в процессе. Величины времен релаксаций зависят от констант скорости элементарных стадий процессов.

Релаксационные методы кинетики позволяют определить константы скорости отдельных элементарных стадий трансформации интермедиатов. Методы изучения релаксационной кинетики имеют разл. разрешающую способность: поглощение ультразвука - 10 -6 -10 -10 с, температурный скачок - 1O -4 -10 -6 с, метод электрич. импульса - 10 -4 -10 -6 с, скачок давления - 10 -2 с. При исследовании кинетики ферментативных р-ций наиб, применение нашел метод температурного скачка.

Макрокинетика ферментативных процессов. Развитие методов получения гетерогенных катализаторов путем иммобилизации ферментов на разл. носителях (см. Иммобилизованные ферменты )обусловило необходимость анализа кинетики процессов с учетом массопереноса субстрата. Теоретически и экспериментально исследованы закономерности кинетики р-ций с учетом эффектов диффузионного слоя и для систем с внутридиффузионными затруднениями при распределении фермента внутри носителя.

В условиях, когда на кинетику процесса влияет диффузионный перенос субстрата, каталитич. эффективность системы уменьшается. Фактор эффективности равен отношению плотности потока продукта в условиях протекания ферментативной р-ции с диффузионно пониженной концентрацией субстрата к потоку, к-рый мог бы реализоваться в отсутствие диффузионных ограничений. В чисто диффузионной области, когда скорость процесса определяется массопереносом субстрата, фактор эффективности для систем с внешнедиффузи-онным торможением обратно пропорционален диффузионному модулю :

где толщина диффузионного слоя, D - коэф. диффузии субстрата.

Для систем с внутридиффузионным торможением в р-циях первого порядка

где Ф т - безразмерный модуль (модуль Тиле).

При анализе кинетич. закономерностей в ферментативных реакторах широкое теоретич. и эксперим. развитие получили "идеальные" модели реакторов, проточный (проточный реактор идеального перемешивания), проточный реактор с идеальным вытеснением, мембранный реактор.

Кинетика полиферментных процессов. В организме (клетке) ферменты действуют не изолированно, а катализируют цепи трансформации молекул. Р-ции в полиферментных системах с кинетич. точки зрения можно рассматривать как последоват. процессы, специфич. особенностью к-рых является ферментами каждой из стадий:

где , соотв. макс, скорость процесса и константа Михаэлиса i -й стадии р-ции соответственно.

Важная особенность процесса - возможность образования устойчивого стационарного состояния. Условием-его возникновения может служить неравенство > v 0 , где v 0 - скорость лимитирующей стадии, характеризуемой наименьшей константой скорости и тем самым определяющей скорость всего последоват. процесса. В стационарном состоянии концентрации метаболитов после лимитирующей стадии меньше константы Михаэлиса соответствующего фермента.

Специфич. группу полиферментных систем составляют системы, осуществляющие окислит.-восстановит. р-ции с участием белковых переносчиков электронов. Переносчики образуют специфич. структуры, комплексы с детерминированной последовательностью переноса электрона. Кинетич. описание такого рода систем рассматривает в качестве независимой переменной состояния цепей с разл. степенью заселенности электронами.

Применение. Ф. р. к. широко используют в исследовательской практике для изучения механизмов действия ферментов и ферментных систем. Практически значимая область науки о ферментах - инженерная энзимология, оперирует понятиями Ф. р. к. для оптимизации биотехнол. процессов.

Лит.: Полторак О. M., Чухрай E. С, Физико-химические основы ферментативного катализа, M., 1971; Березин И. В., Мартинек К, Основы физической химии ферментативного катализа, M., 1977; Варфоломеев С. Д., Зайцев С. В., Кинетические методы в биохимических исследованиях, M.. 1982. С. Д. Варфоломеев.

Химическая энциклопедия. - М.: Советская энциклопедия . Под ред. И. Л. Кнунянца . 1988 .

Смотреть что такое "ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ КИНЕТИКА" в других словарях:

Каталитич. р ция циклич. процесс, складывающийся из ряда элементарных р ций, скорости к рых описываются действующих масс законом. Этот закон имеет простую форму для идеальных газовых смесей, идеальных р ров и идеальных поверхностных слоев.… … Химическая энциклопедия

Кинетика химических реакций, учение о химических процессах о законах их протекания во времени, скоростях и механизмах. С исследованиями кинетики химических реакций связаны важнейшие направления современной химии и химической… … Большая советская энциклопедия

КИНЕТИКА ХИМИЧЕСКАЯ - (от греч. kinesis движение), отдел теоретической химии, посвященный изучению законов хим. реакций. Можно наметить несколько типов хим. взаимодействий и прежде всего отличать реакции, протекающие в гомогенной (однородной) среде, от реакций,… … Большая медицинская энциклопедия

- (биокатализ), ускорение биохим. р ций при участии белковых макромолекул, называемых ферментами (энзимами). Ф. к. разновидность катализа, хотя термин ферментация (брожение)известен с давних времен, когда еще не было понятия хим. катализа. Первое… … Химическая энциклопедия

- (от лат. re приставка, означающая обратное действие, и actio действие), превращения одних в в (исходных соед.) в другие (продукты р ции) при неизменяемости ядер атомов (в отличие от ядерных реакций). Исходные соединения в Р. х. иногда наз.… … Химическая энциклопедия

- (от лат. fermentum закваска) (энзимы), белки, выполняющие роль катализаторов в живых организмах. Осн. ф ции Ф. ускорять превращение в в, поступающих в организм и образующихся при метаболизме (для обновления клеточных структур, для обеспечения его … Химическая энциклопедия

- (от греч. pharmakon лекарство и kinetikos приводящий в движение), изучает кинетич. закономерности процессов, происходящих с лек. ср вом в организме. Осн. фармакокинетич. процессы: всасывание, распределение, метаболизм и экскреция (выведение).… … Химическая энциклопедия

Лекция №6

Основы ферментативного катализа.

Краткая история изучения кинетики ферментативных реакций. Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры, рН, концентрации фермента и концентрации субстрата. Вывод уравнения Михаэлиса-Ментен. Ферментативная активность. Каталитическая константа - число оборотов фермента. Максимальная скорость ферментативной реакции (V max). Константа диссоциации фермент-субстратного комплекса (K s). Константа Михаэлиса-Ментен (K m).

Краткая история изучения кинетики ферментативных реакций.

Ферментативная кинетика занимается исследованием закономерностей влияния химической природы реагирующих веществ (ферментов, субстратов) и условий их взаимодействия (концентрация, рН среды, температуры, присутствие активаторов или ингибиторов) на скорость ферментативной реакции. Главной целью изучения кинетики ферментативных реакций является получение информации, которая может способствовать выяснению молекулярного механизма действия фермента.

Общие принципы кинетики химических реакций применимы и к ферментативным реакциям.

Самая ранняя попытка математически описать ферментативные реакции была предпринята Дюкло в 1898 г. Браун (1902) и независимо от него Анри (1903) впервые выдвинули гипотезу об образовании в ходе реакции фермент-субстратного комплекса. Это предположение основывалось на трех экспериментальных фактах:

1. папаин образовывает нерастворимое соединение с фибрином (Вюрц, 1880);

2. сахароза защищает фермент инвертазы от тепловой денатурации (О`Салливан и Томпсон, 1890);

3. Фишер в 1898-1899 показал, что ферменты являются стереохимически специфическими катализаторами.

МИХАЭЛИС (Michaelis), Леонор

Леонор Михаэлис – немецкий биохимик и химик-органик, основатель кинетики ферментативных процессов. Основные работы посвящены изучению ферментативных реакций. В 1913 г. ввёл константу (константа Михаэлиса) в уравнение зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата в стационарном состоянии (уравнение Михаэлиса – Ментен).

Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры, рН, концентрации фермента и концентрации субстрата.

Предварительные эксперименты по изучению кинетики ферментативных реакций показали, что скорость реакции E + S E + P, вопреки теоретическим ожиданиям, не зависит от концентрации фермента и субстрата так, как в случае обычной реакции второго порядка.

В тоже время к ферментам применимы три основных критерия, характерных и для неорганических катализаторов, а именно:

1. Они остаются неизмененными после реакции, т.е. освобождаясь, могут вновь реагировать с новыми молекулами субстрата (хотя нельзя исключить побочных влияний условий среды на активность фермента).

2. Ферменты способны оказывать действие в ничтожно малых концентрациях (например, одна молекула фермента ренина, содержащегося в слизистой оболочке желудка теленка, створаживает около 10 6 молекул казеиногена молока за 10 мин при температуре 37°С). Наличие либо отсутствие фермента или любого другого катализатора не оказывает влияния на величину константы равновесия и свободной энергии (ΔG).

3. Катализаторы лишь повышают скорость, с которой система приближается к термодинамическому равновесию, не сдвигая точки равновесия.

На активность фермента оказывают влияние все те факторы, которые могут вызвать изменение его структуры, а именно, к числу таких факторов относятся:

3. Силы, действующие в текучих средах (гидродинамические силы, гидростатическое давление и поверхностное натяжение)

4. Химические агенты (спирт, мочевина или пероксид водорода и др.)

5. Облучение (свет, звук, ионизирующая радиация)

6. Различные химические соединения, которые связываясь с ферментами, могут изменять скорость катализируемых ферментами реакций.

Иногда снижение каталитической активности, вызванное, например изменением рН, обратимо. В таких случаях возврат к первоначальным условиям сопровождается восстановлением активности фермента. Возможно и необратимое изменение активности фермента.

Рассмотрим влияние различных факторов на скорость ферментативной реакции.

Влияние температуры

Одним из основных уравнений химической кинетики является уравнение Аррениуса, выражающее зависимость константы скорости реакции от температуры:

Однако, температурный диапазон ферментативных реакций, для которого применимо уравнение Аррениуса, очень узок для большинства ферментов. Что же произойдет, если мы попытаемся заставить фермент катализировать процесс еще быстрее, подняв температуру выше физиологически допустимой? При высокой температуре, когда начинает доминировать процесс термической инактивации фермента, нарушается зависимость скорости реакции от температуры, описываемая уравнением Аррениуса – а именно, после определенного температурного максимума скорость реакции быстро падает дот нуля. С другой стороны при снижении температуры ниже 0°С скорость реакции также падает до нуля, т.е. реакция полностью прекращается. Таким образом ферментативные реакции имеют колоколообразную зависимость скорости реакции от температуры, что объясняется наложением двух эффектов - возрастанием скорости реакции при увеличении температуры и ускорением тепловой денатурации белковой молекулы, приводящей к инактивации фермента при высоких температурах. Денатурация большинства белков начинается в диапазоне температур от 45 до 50°С и завершается очень быстро при 55°С. Прекращение ферментативных реакции при низких температурах обусловлено тем, что водные растворы замерзают.

Таким образом, термолабильность, или чувствительность к повышению температуры, является одним из характерных свойств ферментов, резко отличающих их от неорганических катализаторов. При температуре 90°С почти все ферменты утрачивают свою активность (исключение составляет только два фермента – миокиназа, которая выдерживает нагревание до 100°С, ДНК-полимераза из термофильных бактерий макс. при 90°С). Оптимальной для действия большинства ферментов теплокровных животных является температура 40-45°С; в этих условиях скорость реакции оказывается максимальной вследствие увеличения кинетической энергии реагирующих молекул. При низких температурах (4°С и ниже) ферменты, как правило, не разрушаются, хотя активность их падает почти до нуля. Это явление обусловлено изменением строения активного центра фермента вследствие уменьшения плотности воды. Во всех случаях имеет значение время воздействия соответствующей температуры. В настоящее время для пепсина, трипсина и ряда других ферментов доказано существование прямой зависимости между скоростью инактивации фермента и степенью денатурации белка. Таким образом, влияние температуры на скорость ферментативной реакции подчиняется уравнению Аррениуса лишь в сравнитель узком диапазоне температур 4-45°С. Вне этого диапазана скорости ферментативных реакций резко снижаются, что учитывается и используется в пищевых технологиях и при хранении пищевых продуктов и лекарственных средств, содержащих ферменты. Привести примеры.

Влияние рН среды.

Ферменты, как и все белки, состоят из аминокислот. В зависимости от рН радикалы некоторых аминокислот, а значит, и белок в целом могут приобретать заряд. Заряженные группы часто входят в состав активных центров ферментов, так как в основе целого ряда механизмов ферментативного катализа лежит катализ кислотного или основного типа. Необходимым условием для осуществления кислотного или основного катализа может быть наличие определенного заряда на ионизируемых группах активного центра. Отсюда следует, что каталитически активная форма фермента существует только в одном строго определенном состоянии ионизации, и в зависимости от рН в нее может превращаться большая или меньшая часть всего имеющегося в смеси фермента.

Зависимость активности фермента от рН имеет колоколообразную форму с довольно узким максимумом. Для разных ферментов значение рН, при котором фермент имеет максимальную активность различно. В эксперименте достаточно часто используется исследование рН-зависимостей ферментативных реакций для изучения числа и свойств ионогенных групп.

При определении зависимости активности фермента от концентрации водородных ионов реакцию проводят при разных значениях рН среды, обычно при оптимальной температуре и наличии достаточно высоких (насыщающих) концентраций субстрата. На рисунке и в таблице приводятся оптимальные значения рН среды для ряда ферментов.

Рис. Зависимость активности ферментов от рН.

Из данных табл. 4.3 видно, что рН-оптимум действия ферментов лежит в пределах физиологических значений. Исключение составляют пепсин, рН-оптимум которого 2,0 (при рН 6,0 он не активен и не стабилен). Объясняется это, во-первых, структурной организацией молекулы фермента и, во-вторых, тем, что пепсин является компонентом желудочного сока, содержащего свободную соляную кислоту, которая создает оптимальную кислую среду для действия этого фермента. С другой стороны, рН-оптимум аргиназы лежит в сильнощелочной зоне (около 10,0); такой среды нет в клетках печени, следовательно, in vivo аргиназа функционирует, по-видимому, не в своей оптимальной зоне рН среды.

Согласно современным представлениям, влияние изменений рН среды на молекулу фермента заключается в воздействии на состояние и степень ионизации кислотных и основных групп (в частности, СООН-группы дикарбоновых аминокислот, SH-группы цистеина, имидазольного азота гистидина, NH 2 -группы лизина и др.). При резких сдвигах от оптимума рН среды ферменты могут подвергаться конформационным изменениям, приводящим к потере активности вследствие денатурации или изменения заряда молекулы фермента. При разных значениях рН среды активный центр может находиться в частично ионизированной или неионизированной форме, что сказывается на третичной структуре белка и соответственно на формировании активного фермент-субстратного комплекса. Имеет значение, кроме того, состояние ионизации субстратов и кофакторов.

Похожая информация.

Скорость ферментативной реакции

Мерой скорости ферментативной реакции служит количество субстрата, подвергшегося превращению в единицу времени, или количество образовавшегося продукта. Скорость определяют по углу наклона касательной к кривой на начальной стадии реакции.

Рис. 2 Скорость ферментативной реакции.

Чем круче наклон, тем больше скорость. Со временем скорость реакции обычно снижается, по большей части в результате снижения концентрации субстрата.

Факторы, влияющие на ферментативную активность

Действие Ф. зависит от ряда факторов: температуры, реакции среды (pH), концентрации фермента, концентрации субстрата, от присутствия специфических активаторов и неспецифических или специфических ингибиторов.

Концентрация фермента

При высокой концентрации субстрата и при постоянстве других факторов скорость ферментативной реакции пропорциональна концентрации фермента.

Рис. 3 Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации фермента.

Катализ осуществляется всегда в условиях, когда концентрация фермента гораздо ниже концентрации субстрата. Поэтому с возрастанием концентрации фермента растет и скорость ферментативной реакции.

Температура

Влияние температуры на скорость ферментативной реакции может быть выражено через температурный коэффициент Q 10: Q 10 = (скорость реакции при (х + 10)°C) / (скорость реакции при х °C)

В пределах 0-40°C Q 10 ферментативной реакции равен 2. Иными словами, при каждом повышении температуры на 10°C скорость ферментативной реакции удваивается.

Рис. 4 Влияние температуры на активность такого фермента, как амилаза слюны.

С повышением температуры движение молекул ускоряется, и у молекул реагирующих веществ больше шансов столкнуться друг с другом. Увеличивается, следовательно, и вероятность того, что реакция между ними произойдет. Температура, обеспечивающая наибольшую активность, называется оптимальной. За пределами этого уровня скорость ферментативной реакции снижается, несмотря на увеличение частоты столкновений. Происходит это вследствие разрушения вторичной и третичной структур фермента, иными словами, вследствие того, что фермент претерпевает денатурацию.

Рис. 5 Ход ферментативной реакции при разных температурах.

Когда температура приближается к точке замерзания или оказывается ниже ее, ферменты инактивируются, но денатурации при этом не происходит. С повышением температуры их каталитическая активность вновь восстанавливается.

Поскольку белки в сухом состоянии денатурируются значительно медленнее, чем белки оводненные (в виде белкового геля или раствора), инактивирование Ф. в сухом состоянии происходит гораздо медленнее, чем в присутствии влаги. Поэтому сухие споры бактерий или сухие семена могут выдержать нагревание до гораздо более высоких температур, чем те же споры или семена в увлажненном состоянии.

Концентрация субстрата

При данной концентрации фермента скорость ферментативной реакции возрастает с увеличением концентрации субстрата.

Рис. 6 Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата.

Теоретическая максимальная скорость реакции V max никогда не достигается, но наступает момент, когда дальнейшее увеличение концентрации субстрата уже не влечет за собой сколько-нибудь заметного изменения скорости реакции. Это следует объяснить тем, что при высоких концентрациях субстрата активные центры молекул Ф. в любой данный момент оказываются практически насыщенными. Таким образом, сколько бы ни было в наличии избыточного субстрата, он может соединиться с Ф. лишь после того, как образовавшийся ранее фермент-субстратный комплекс диссоциирует на продукт и свободный Ф. Поэтому при высоких концентрациях субстрата скорость ферментативной реакции лимитируется и концентрацией субстрата, и временем, которое требуется для диссоциации фермент-субстратного комплекса.

При постоянной температуре любой Ф. работает наиболее эффективно в узких пределах pH. Оптимальным считается то значение pH, при котором реакция протекает с максимальной скоростью.

Рис. 7 Зависимость активности фермента от pH.

При более высоких и более низких pH активность Ф. снижается. Сдвиг pH меняет заряд ионизированных кислотных и основных групп, от которого зависит специфичная форма молекул Ф. В результате изменяется форма молекул Ф., и в первую очередь форма его активного центра. При слишком резких сдвигах pH Ф. денатурирует. Свойственный данному Ф. оптимум pH не всегда совпадает с pH его непосредственного внутриклеточного окружения. Это позволяет предположить, что среда, в которой находится Ф., в какой-то мере регулирует его активность.

Кинетика ферментативных реакций. Кинетика изучает скорости, механизмы реакций и влияние на них таких факторов, как концентрации ферментов и субстратов, темпера­тура, рН среды, присутствие ингибиторов или активаторов.

При постоянной концентрации субстрата скорость реакции прямо пропорциональна концентрации фермента. График зависимости скорости ферментативной реакции от кон­центрации субстрата имеет вид равнобочной гиперболы.

Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации фермента (а) и субстрата (б)

Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата описывается уравнением Михаэлиса - Ментен :

где V - стационарная скорость биохимической реакции; Vmax - максимальная скорость; Кm - константа Михаэлиса; [S] - концен­трация субстрата.

Если концентрация субстрата низкая, т. е. [S] << Кm, то [S] в знаменателе можно пренебречь.

Тогда

Таким образом, при низких концентраци­ях субстрата скорость реакции прямо пропор­циональна концентрации субстрата и описы­вается уравнением первого порядка. Это со­ответствует начальному прямолинейному уча­стку кривой V = f[S] (рисунок б).

При высоких концентрациях субстрата [S] >> Кm, когда Кm можно пренебречь, уравнение Михаэлиса - Ментен приобретает вид, т.е. V=Vmax.

Таким образом, при высоких концентрациях субстрата скорость реакции стано­вится максимальной и описывается уравнением нулевого порядка. Это соответствует участку кривой V =f [S], параллельному оси абсцисс.

При концентрациях субстрата, численно сравнимых с констан­той Михаэлиса, скорость реакции возрастает постепенно. Это вполне согласуется с представлениями о механизме ферментативной реак­ции:

где S - субстрат; Е - фермент; ES - фермент-субстратный комп­лекс; Р - продукт; k1 - константа скорости образования фермент-субстратного комплекса; k2 - константа скорости распада фермент-субстратного комплекса с образованием исходных реагентов; k3 - константа скорости распада фермент-субстратного комплекса с обра­зованием продукта.

Скорость превращения субстрата с образованием продукта (Р) про­порциональна концентрации фермент-субстратного комплекса . При малых концентрациях субстрата в растворе имеется некоторое число свободных молекул фермента (Е), не связанных в комплекс (ES). Поэтому при увеличении концентрации субстрата концентрация ком­плексов растет, следовательно, растет и скорость образования продук­та. При больших концентрациях субстрата все молекулы фермента связаны в комплекс ES (явление насыщения фермента), поэтому даль­нейшее повышение концентрации субстрата практически не увеличи­вает концентрацию комплексов и скорость образования продукта остается постоянной.

Таким образом, становится ясен физический смысл максимальной скорости ферментативной реакции. Vmах - это скорость, с которой реагирует фермент, полностью существующий в виде фермент-суб­стратного комплекса .

Константа Михаэлиса численно соответствует такой концентра­ции субстрата, при которой стационарная скорость равна половине максимальной. Данная константа характеризует кон­станту диссоциации фермент-субстратного комплекса:

Физический смысл константы Михаэлиса в том, что она характе­ризует сродство фермента к субстрату. Кm имеет малые значения, когда k1 > (k2 + k3), т.е. процесс образования комплекса ES преоб­ладает над процессами диссоциации ES. Следовательно, чем меньше значения Кm, тем сродство фермента к субстрату больше. И, наобо­рот, если Кm имеет большое значение, то (k2 + k3) > k1 и процессы диссоциации ES преобладают. В этом случае сродство фермента к субстрату небольшое.

Ингибиторы и активаторы ферментов . Ингибиторами ферментов называются вещества, снижающие активность ферментов. Любые денатурирующие агенты (например, соли тяжелых металлов, кислоты) являются неспецифическими ингибито­рами ферментов.

Обратимые ингибиторы - это соединения, которые нековалентно взаимодействуют с ферментом. Необратимые ингибиторы - это соединения, специфически связывающие функциональные группы активного центра и образующие ковалентные связи с ферментом.

Обратимое ингибирование разделяют на конкурентное и неконку­рентное. Конкурентное ингибирование предполагает структурное сход­ство ингибитора и субстрата. Ингибитор занимает место в активном центре фермента, и значительное количество молекул фермента ока­зывается блокировано. Конкурентное ингибирование можно снять, если повысить концентрацию субстрата. В этом случае субстрат вы­тесняет конкурентный ингибитор из активного центра.

Обратимое ингибирование может быть неконкурентным в отноше­нии субстрата. В этом случае ингибитор не конкурирует за место присоединения к ферменту. Субстрат и ингибитор связываются с раз­ными центрами, поэтому появляется возможность образования комп­лекса IE, а также и тройного комплекса IES, который может распа­даться с освобождением продукта, но с меньшей скоростью, чем комп­лекс ES.

По характеру своего действия ингибиторы подразделяются на:

• спе­цифические,
• неспецифические.

Специфические ингибиторы оказывают свое действие на фермент, присоединяясь ковалентной связью в активном центре фермента и выключая его из сферы действия.

Неспецифическое ингибирование предполагает воздействие на фер­мент денатурирующих агентов (солей тяжелых металлов, мочевины и др.). В этом случае в результате разрушения четвертичной и третич­ной структуры белка происходит потеря биологической активности фермента.

Активаторы ферментов - это вещества, увеличивающие скорость фермен­тативной реакции. Чаще всего в качестве активаторов выступают ионы метал­лов (Fe2+, Fe3+, Cu2+, Co2+, Mn2+, Mg2+ и т.д.). Различают металлы, находящиеся в составе металлоферментов, являющиеся кофакторами, и вы­ступающие в качестве активаторов ферментов. Кофакторы могут прочно связы­ваться с белковой частью фермента, что же касается активаторов, то они легко отделяются от апофермента. Такие металлы являются обязательными участника­ми каталитического акта, определяющими активность фермента. Активаторы уси­ливают каталитическое действие , но их отсутствие не препятствует протека­нию ферментативной реакции. Как правило, металл-кофактор взаимодейству­ет с отрицательно заряженными группировками субстрата. Металл с переменной валентностью принимает участие в обмене электронов между субстратом и ферментом. Кроме того, они принимают участие в образовании ста­бильной переходной конформации фермента, что способствует более быстро­му образованию ES комплекса.

Регуляция активности ферментов . Одним из основных механизмов регуляции метаболизма служит регуляция активности ферментов. Одним из примеров является аллостерическая регуляция, регуляция посредством активаторов и ингибиторов. Часто бывает так, что конечный продукт метаболического пути является ингибитором регуляторного фермента. Такой тип ингибирования называется ретроингибированием, или ингибированием по принципу отрицательной обратной связи.

Многие ферменты вырабатываются в виде неактивных предше­ственников-проферментов, а затем в нужный момент активируются за счет частичного протеолиза. Частичный протеолиз - отщепление части молекулы, которое приводит к изменению третичной структуры белка и формированию активного центра фермента.

Некоторые ферменты-олигомеры могут изменять свою активность за счет ассоциации - диссоциации субъединиц , входящих в их со­став.

Многие ферменты могут находиться в двух формах: в виде про­стого белка и в виде фосфопротеида. Переход из одной формы в дру­гую сопровождается изменением каталитической активности.

Скорость ферментативной реакции зависит от количества фермента , которое в клетке определяется соотношением скоростей его синтеза и распада. Этот способ регуляции скорости ферментативной реакции является более медленным процессом, чем регуляция активности фер­мента.