Laiku diagnozuota ŽIV infekcija tampa itin svarbia priemone, nes ankstyvesnis gydymas gali iš esmės nulemti tolesnę ligos raidą ir pailginti paciento gyvenimą. Pastaraisiais metais šios baisios ligos nustatymo srityje padaryta didelė pažanga: senos tyrimų sistemos keičiamos pažangesnėmis, tyrimo metodai tampa prieinamesni, jų tikslumas gerokai padidėja.
Šiame straipsnyje kalbėsime apie šiuolaikinius ŽIV infekcijos diagnostikos metodus, kuriuos pravartu žinoti, norint laiku gydyti šią problemą ir palaikyti normalią paciento gyvenimo kokybę.
ŽIV diagnozavimo metodai
Rusijoje ŽIV infekcijai diagnozuoti atliekama standartinė procedūra, kurią sudaro du lygiai:
- ELISA testų sistema (atrankinė analizė);
- imuninis blotingas (IB).
Taip pat gali būti naudojami kiti diagnostikos metodai:
- greitieji testai.
ELISA testų sistemos
Pirmajame diagnozės etape ŽIV infekcijai nustatyti naudojamas atrankos testas (ELISA), kuris yra pagrįstas ŽIV baltymais, sukurtais laboratorijose, kurios fiksuoja specifinius antikūnus, gaminamus organizme reaguojant į infekciją. Po jų sąveikos su tiriamosios sistemos reagentais (fermentais), pasikeičia indikatoriaus spalva. Be to, šie spalvų pokyčiai apdorojami specialia įranga, kuri lemia atliktos analizės rezultatą.
Tokie ELISA tyrimai gali parodyti rezultatus per kelias savaites nuo ŽIV infekcijos įvedimo. Ši analizė nenustato viruso buvimo, bet nustato antikūnų prieš jį gamybą. Kartais žmogaus organizme antikūnai prieš ŽIV prasideda praėjus 2 savaitėms po užsikrėtimo, tačiau daugumos žmonių jie gaminasi vėliau, po 3-6 savaičių.
Yra keturios skirtingo jautrumo ELISA testų kartos. Pastaraisiais metais vis dažniau naudojamos III ir IV kartos bandymų sistemos, kurios yra pagrįstos sintetiniais peptidais arba rekombinantiniais baltymais ir pasižymi didesniu specifiškumu bei tikslumu. Jais galima diagnozuoti ŽIV infekciją, stebėti ŽIV paplitimą ir užtikrinti saugumą tiriant paaukotą kraują. III ir IV kartos ELISA testų sistemų tikslumas siekia 93-99% (jautresni testai, kurie gaminami Vakarų Europoje – 99%).
ELISA tyrimui atlikti iš paciento venos paimama 5 ml kraujo. Nuo paskutinio valgio iki analizės turi praeiti ne mažiau kaip 8 valandos (paprastai ji atliekama ryte tuščiu skrandžiu). Tokį tyrimą rekomenduojama atlikti ne anksčiau kaip po 3 savaičių po tariamos infekcijos (pavyzdžiui, po nesaugių santykių su nauju lytiniu partneriu).
ELISA tyrimo rezultatai gaunami po 2-10 dienų:
- neigiamas rezultatas: rodo, kad nėra ŽIV infekcijos ir nereikia siuntimo pas specialistą;
- klaidingai neigiamas rezultatas: gali būti stebimas ankstyvosiose infekcijos stadijose (iki 3 savaičių), vėlesnėse AIDS stadijose esant stipriam imuniteto slopinimui ir netinkamai paruošus kraują;
- klaidingai teigiamas rezultatas: jį galima pastebėti sergant kai kuriomis ligomis ir netinkamai paruošus kraują;
- teigiamas rezultatas: rodo užsikrėtimą ŽIV infekcija, reikalingas IB ir paciento siuntimas pas specialistą AIDS centre.
Kodėl ELISA testas gali duoti klaidingai teigiamus rezultatus?
Klaidingai teigiami ŽIV ELISA testo rezultatai gali būti stebimi netinkamai apdorojant kraują arba pacientams, sergantiems tokiomis sąlygomis ir ligomis:
- daugybinė mieloma;
- infekcinės ligos, kurias sukelia Epstein-Barr virusas;
- būsena po ;
- autoimuninės ligos;
- nėštumo fone;
- būklė po vakcinacijos.
Dėl aukščiau aprašytų priežasčių kraujyje gali būti nespecifinių kryžmiškai reaguojančių antikūnų, kurių susidarymo neišprovokavo ŽIV infekcija.
Pastaraisiais metais klaidingai teigiamų rezultatų dažnis gerokai sumažėjo, nes naudojamos III ir IV kartos testų sistemos, kuriose yra jautresnių peptidinių ir rekombinantinių baltymų (jie sintetinami naudojant in vitro genų inžineriją). Panaudojus tokius ELISA tyrimus, klaidingai teigiamų rezultatų dažnis gerokai sumažėjo ir yra apie 0,02-0,5 proc.
Klaidingai teigiamas rezultatas nereiškia, kad žmogus yra užsikrėtęs ŽIV. Tokiais atvejais PSO rekomenduoja atlikti kitą ELISA testą (privalomas IV kartos).
Paciento kraujas siunčiamas į etaloninę ar arbitražo laboratoriją, pažymėtą „pakartojimas“ ir tiriamas IV kartos ELISA tyrimo sistema. Jei naujos analizės rezultatas yra neigiamas, pirmasis rezultatas pripažįstamas klaidingu (klaidingai teigiamas) ir IB neatliekamas. Jei antrojo tyrimo metu rezultatas yra teigiamas arba abejotinas, pacientas turi atlikti IB per 4–6 savaites, kad būtų patvirtinta arba paneigta ŽIV infekcija.
imuninis blotingas
Galutinė ŽIV infekcijos diagnozė gali būti nustatyta tik gavus teigiamą imuninio blotingo (IB) rezultatą. Jai įgyvendinti naudojama nitroceliuliozės juostelė, ant kurios dedami virusiniai baltymai.
IB kraujo mėginiai imami iš venos. Tada jis yra specialiai apdorojamas, o jo serume esantys baltymai atskiriami specialiame gelyje pagal jų krūvį ir molekulinę masę (manipuliacija atliekama specialia įranga, veikiant elektriniam laukui). Ant kraujo serumo gelio uždedama nitroceliuliozės juostelė ir specialioje kameroje atliekamas blotavimas („blotingas“). Juostelė yra apdorojama ir, jei naudojamose medžiagose yra antikūnų prieš ŽIV, jie prisijungia prie IB antigeninių juostų ir pasirodo kaip linijos.
IB laikomas teigiamu, jei:
- pagal Amerikos CDC kriterijus - ant juostelės yra dvi ar trys eilutės gp41, p24, gp120 / gp160;
- pagal Amerikos FDA kriterijus - ant juostelės yra dvi eilutės p24, p31 ir eilutė gp41 arba gp120 / gp160.
99,9% atvejų teigiamas IB rezultatas rodo ŽIV infekciją.
Jei nėra linijų - IB yra neigiamas.
Identifikuojant linijas su gp160, gp120 ir gp41, IB abejotina. Tokį rezultatą galima aptikti, kai:
- onkologinės ligos;
- nėštumas;
- dažni kraujo perpylimai.
Tokiais atvejais rekomenduojama atlikti antrą tyrimą naudojant kitos įmonės rinkinį. Jei po papildomo IB rezultatas išlieka abejotinas, tuomet būtinas stebėjimas šešis mėnesius (IB atliekamas kas 3 mėnesius).
polimerazės grandininė reakcija
PGR testas gali aptikti viruso RNR. Jo jautrumas yra gana didelis ir leidžia nustatyti ŽIV infekciją jau 10 dienų po užsikrėtimo. Kai kuriais atvejais PGR gali duoti klaidingai teigiamus rezultatus, nes jo didelis jautrumas taip pat gali reaguoti į antikūnus prieš kitas infekcijas.
Šis diagnostikos metodas yra brangus, reikalauja specialios įrangos ir aukštos kvalifikacijos specialistų. Šios priežastys neleidžia to atlikti atliekant masinius gyventojų tyrimus.
PGR naudojama šiais atvejais:
- nustatyti ŽIV naujagimiams, kuriuos pagimdė ŽIV infekuotos motinos;
- nustatyti ŽIV „lango periodu“ arba esant abejotinam IB;
- kontroliuoti ŽIV koncentraciją kraujyje;
- donorų kraujo tyrimui.
Tik PGR testu ŽIV diagnozė nenustatoma, o atliekama kaip papildomas diagnostikos metodas ginčams spręsti.
Ekspreso metodai
Viena iš ŽIV diagnostikos naujovių tapo greitieji testai, kurių rezultatus galima įvertinti per 10-15 minučių. Efektyviausi ir tiksliausi rezultatai gaunami atliekant imunochromatografinius tyrimus, pagrįstus kapiliarinio srauto principu. Tai specialios juostelės, ant kurių užtepamas kraujas ar kiti tiriamieji skysčiai (seilės, šlapimas). Esant antikūnams prieš ŽIV, po 10-15 minučių ant testo atsiranda spalvota ir kontrolinė juostelė – teigiamas rezultatas. Jei rezultatas neigiamas, rodoma tik kontrolinė eilutė.
Kaip ir atliekant ELISA testus, greitųjų testų rezultatai turėtų būti patvirtinti IB analize. Tik tada galima diagnozuoti ŽIV infekciją.
Yra greitųjų rinkinių, skirtų testavimui namuose. OraSure Technologies1 (JAV) testas yra patvirtintas FDA, parduodamas be recepto ir gali būti naudojamas ŽIV aptikti. Po tyrimo, gavus teigiamą rezultatą, pacientui rekomenduojama atlikti tyrimą specializuotame centre, kad būtų patvirtinta diagnozė.
Likę bandymai, skirti naudoti namuose, dar nepatvirtinti FDA ir jų rezultatai gali būti labai abejotini.
Nepaisant to, kad greitieji testai yra prastesni nei IV kartos ELISA tyrimai, jie plačiai naudojami papildomam populiacijos tyrimui.
Pasitikrinti dėl ŽIV infekcijos galite bet kurioje poliklinikoje, Centrinėje regioninėje ligoninėje ar specializuotuose AIDS centruose. Rusijos teritorijoje jie laikomi visiškai konfidencialiai arba anonimiškai. Kiekvienas pacientas gali tikėtis medicininės ar psichologinės konsultacijos prieš arba po analizės. Už ŽIV tyrimus teks mokėti tik komercinėse gydymo įstaigose, o valstybinėse klinikose ir ligoninėse jie atliekami nemokamai.
Norėdami gauti informacijos apie tai, kaip galite užsikrėsti ŽIV ir kokie mitai egzistuoja apie galimybę užsikrėsti, skaitykite
Kraujas imamas iš venos. Tada tyrimas atliekamas pagal instrukcijas:
- mėginys dedamas į gelį elektroforetiniam atskyrimui, todėl susidaro specifiniai virusui jautrūs baltymai;
- ant apdoroto gelio užtepamas nitroceliuliozės popierius;
- paruoštas mėginys dedamas į blotavimo aparatą.
Norint nustatyti specifinius fermentus, būtina tinkamai paruošti popierių laboratoriniams tyrimams. Norėdami tai padaryti, ant jo dedami antikūnai ir pažymėtas radioaktyvus konjugatas. Tyrimo rezultatas vertinamas vizualiai, tiriamos sukonstruotos fermentų grandinės.
Rezultatų iššifravimas
Po manipuliacijų ant popieriaus lieka juostelės. Jie yra ten, kur įvyko konjugacija, tai yra, naudojamas vaistas reagavo su viruso baltymu. Tokiu būdu galima aptikti baltymų dalis:
- iš ŽIV-1 šerdies - p17, p24, p55;
- ŽIV-2 sukėlėjas – p16, p26, p56.
Western blot rezultatai laikomi teigiamais, jei aptinkami 2 iš 3 ŽIV-1 arba ŽIV-2 baltymų. Kadangi Western blot (antrasis tyrimo pavadinimas) dažnai naudojamas teigiamam ELISA rezultatui patvirtinti, reakcija tikrinama, ar nėra specifinių baltymų: gp120 / 160, gp41 arba p24. Jie yra trijų pagrindinių AIDS genų – gag, pol ir env – dalis. Pradinės diagnozės metu tyrimas atliekamas tik dėl baltymų p25, gp110 / 120 ir gp160, jei gautas teigiamas rezultatas, tada tyrimas atliekamas dėl p24. Ši baltymo dalis leidžia aptikti virusą ankstyvoje stadijoje.
Teigiamas rezultatas yra priežastis kreiptis dėl sudėtingesnės diagnozės. Tai klaidinga tik 3 atvejais:
- pacientams, kurių bilirubino kiekis yra didelis;
- susilietus su viruso antigenais;
- esant jungiamojo audinio patologijoms.
Jei pacientas neturi AIDS baltymus atitinkančių linijų, rezultatas vertinamas kaip neigiamas. Tai reiškia, kad asmuo nėra užsikrėtęs ŽIV arba yra „lango periode“. Pastaroji reiškia, kad virusas galėjo patekti į organizmą, bet jame dar nesivystyti. Siekiant pagerinti diagnozės tikslumą, naudojamos testavimo sistemos:
- Rekombinantinis-ŽIV;
- antigenas;
- Peptoscreen.
Patikrinus juos, rezultatas skaičiuojamas kaip neigiamas, jei mėginyje nerandama gp120, gp160, Sp4 baltymų.
Yra ir kitas aiškinimo variantas – neutralus arba abejotinas rezultatas. Tai pasireiškia tiems, kurie turėjo lytinių santykių su ŽIV užsikrėtusiu partneriu. Jų kraujyje randama antikūnų prieš gp120 ir gp160 baltymus. Taip pat abejotinas atsakymas atliekant blotingumą, kai infekcija yra besimptomė, tai yra, ji yra ramybės būsenoje.
Svarbu nuodugniai patikrinti abejotiną rezultatą. Norėdami tai padaryti, naudokite kraujo serumo tyrimą dinamikoje, ty reguliariai tikrinkite imunoblotavimą ir ELISA šešis mėnesius. Taip pat skiriami papildomi tyrimai, nes autoantikūnų ir imuninių kompleksų buvimas kraujyje gali būti dėl:
- užkrečiamos ligos;
- vėžinių navikų buvimas;
- alergijos.
Skiriamieji bruožai:
- Reagentų rinkinyje "MPBA - Blot - HIV-1, HIV-2" yra išgryninti lizato viruso baltymai ŽIV 1 ir peptidas - ŽIV-2 gp36 antigeninis determinatas;
- Užtikrina antikūnų prieš ŽIV-1, ŽIV-1 O grupės, ŽIV 2 aptikimą vienoje juostelėje;
- Paprasta analizės rengimo ir atlikimo procedūra;
- Vidinė reakcijos kokybės kontrolė*
- Maksimalus analizės greitis (3 valandos);
- Nedidelis tiriamojo mėginio tūris - 20 µl;
- Nereikalauja papildomos įrangos tyrimams;
- Rinkinio kokybę garantuoja rusiškų ir tarptautinių standartų pavyzdžiai**
* Vidinę kokybės kontrolę užtikrina:
- vidinės kontrolės juostelės, užtikrina serumo ar plazmos mėginio įvedimo kontrolę;
- kontrolinis neigiamas serumas (K-);
- kontrolinis teigiamas serumas (K+), leidžiantis identifikuoti juostelėje aptiktas juostas;
- kontrolinis silpnai teigiamas serumas (K + cl), kuris užtikrina reagento rinkinio jautrumo kontrolę.
**Kokybės užtikrinimas:
MPBA-Blot-HIV-1, ŽIV-2 reagentų rinkinio charakteristikos buvo nustatytos tiriant mėginius iš atsitiktinės donorų imties, pacientų, kuriems diagnozuota ŽIV infekcija, komercines serokonversijos grupes, standartines paneles ir mėginius, kurie „galimai trukdo determinacija“ komponentai.
Reagentų rinkinys neduoda klaidingai teigiamų rezultatų tiriant standartinės grupės serumus, kuriuose nėra antikūnų prieš ŽIV 1.2 ir ŽIV-1 antigeną ("Standartinis AT (-) HIV", Nr. FSR 2007/00953 of 10/ 25/2007). Specifiškumas – 100%.
Diagnostinis specifiškumas nustatytas ištyrus atsitiktinę 200 donorų atranką iš įvairių kraujo centrų ir klinikų, kurių preliminariai patvirtinta, kad nėra ŽIV-1, ŽIV-2 infekcijos. Specifiškumas tiriant atsitiktinę donorų imtį buvo 100 %;
Reagentų rinkinio specifiškumas buvo nustatytas tiriant 250 mėginių, įskaitant serumo ar plazmos mėginius, paimtus iš nėščių moterų, hospitalizuotų pacientų, pacientų, sergančių hepatitu C ir E, ir mėginius su „galimai trukdančiais nustatymui“ komponentais. Naudojant MPBA-Blot-HIV-1, ŽIV-2 rinkinį, šių mėginių klaidingai teigiamų rezultatų nerasta.
Diagnostinis jautrumas buvo nustatytas naudojant:
- Boston Biomedica, Inc. ŽIV-1 skydelio plazmos mėginiai (WWRB 301) iš skirtingų regionų, kuriuose yra skirtingi ŽIV-1 potipiai: M grupė (A, B, C, D, E, F potipiai) ir O grupė; reagento rinkinio jautrumas buvo 100 %;
Reagentų rinkinio jautrumas buvo nustatytas tiriant tarptautines serokonversijos plokštes Boston Biomedica, Inc (SeraCare Life Sciences), kat. nrs. PRB 903, PRB 904, PRB 909, PRB 912, PRB 916, PRB 917, PRB 918, PRB 919, PRB 921, PRB 923, PRB 924, PRB 927, PRB 928, PRB 930
Reagentų rinkinys aptinka antikūnus prieš ŽIV-1 standartinės grupės, kurioje yra antikūnų prieš ŽIV-1 („Standartinis AT (+) HIV-1“, Nr. FSR 2007/00953, 2007 m. spalio 25 d.), serume, aptinka antikūnus. į ŽIV-2 standartinės grupės, kurioje yra antikūnų prieš ŽIV-2, serume ("Standartinis AT (+) HIV-2", Nr. FSR 2007/00953, 2007-10-25). Jautrumas – 100%.
2011 m. liepos 13 d. registracijos liudijimas Nr. FSR 2010/07958 (galiojimas neribojamas)
Junginys:
- Imunosorbentas. Baltos nitroceliuliozės membranos juostelės su atskirais ŽIV-1 baltymais (gp160, gp120, p66, p55, p51, gp41, p31, p24, p17), adsorbuotos ant jų elektrotransferiniu būdu ir užteptos ant juostelės sintetiniu ŽIV-2 peptidu, gp36 baltymo ir anti-IgG žmogaus analogas (vidinė kontrolė) - 18 vnt;
- K- – kontrolinis neigiamas serumas. Žmogaus kraujo serumas, kuriame nėra antikūnų prieš ŽIV-1,2, HCV, ŽIV antigeną, HBsAg, inaktyvuojamas kaitinant 560C temperatūroje; skaidrus šviesiai geltonas skystis - 1 mėgintuvėlis (0,08 ml). Sudėtyje yra konservantų: timerosalio ir natrio azido;
- K+ – kontrolinis teigiamas serumas. Žmogaus kraujo serumas, kuriame yra antikūnų prieš ŽIV-1,2 (titras ne mažesnis kaip 1:10000), neturintis HBsAg, ŽIV antigeno, antikūnų prieš HCV, inaktyvuotas kaitinant 560C temperatūroje; skaidrus šviesiai geltonas skystis - 1 mėgintuvėlis (0,08 ml) Sudėtyje yra konservantų: timerosalio ir natrio azido;
- K+sl – kontrolinis silpnai teigiamas serumas. Žmogaus kraujo serumas, kuriame yra antikūnų prieš ŽIV-1,2 (titras ne didesnis kaip 1:200), neturintis HBsAg, ŽIV antigeno, antikūnų prieš HCV, inaktyvuotas kaitinant 560C temperatūroje; skaidrus šviesiai geltonas skystis - 1 mėgintuvėlis (0,08 ml). Sudėtyje yra konservantų: timerosalio ir natrio azido;
- RROKk (x10) – tirpalas mėginiams ir konjugatui skiesti. Koncentratas – Tris buferis, kuriame yra iš anksto apdorotas normalus ožkos serumas; nepermatomas pilkas skystis - 1 buteliukas (10 ml). Sudėtyje yra konservantų: timerosalio;
- PRk (x20) - plovimo tirpalas. Koncentratas – Tris buferis, kuriame yra Tween-20; skaidrus bespalvis skystis - 1 buteliukas (70 ml). Sudėtyje yra konservantų: timerosalio;
- Konjugatas. Ožkos antikūnai prieš žmogaus IgG, konjuguoti su šarmine fosfataze; skaidrus bespalvis skystis - 1 mėgintuvėlis (0,06 ml);
- Substratas (dažymasis tirpalas). 5-brom-4-fluor-indolil-fosfato (BCIP) ir nitrozintetrazolio (NBT) tirpalas; skaidrus šviesiai geltonas skystis - 1 buteliukas (50 ml);
- Milteliai imuniniam blotavimui. Nugriebto pieno milteliai - amorfiniai balti arba šviesiai geltoni milteliai - 5 pak. x 1g;
- Tabletė su dangteliu reakcijai nustatyti - 2 vnt;
- Plastikiniai pincetai - 1 vnt.
Imunoblotingas -(iš anglų kalbos „blot“ – dėmė) – antigenų (arba antikūnų) nustatymo metodas naudojant žinomus serumus (arba antigenus). Tai gelio elektroforezės ir ELISA derinys. Iš pradžių bakterijų ląstelės ar virionai sunaikinami ultragarsu, o vėliau visi viruso ar bakterijų ląstelių antigenai yra atskiriami elektroforezės būdu ir ant specialios nitroceliuliozės plėvelės gaunamas komercinis reagentas. Nustatant imunoblotingą, paciento tiriamasis serumas užtepamas ant plėvelės su žinomais antigenais. Inkubavus ir išplovus neprisijungusius antikūnus, jie pereina į ELISA – ant plėvelės užtepamas antiserumas prieš žmogaus imunoglobulinus, paženklintas fermentu, ir chromogeninis substratas, kuris keičia spalvą sąveikaudamas su fermentu. Esant antigenui-antikūnui-antiserumui prieš imunoglobulino-fermento kompleksus, ant nešiklio atsiranda spalvotų dėmių. Imunoblotavimo metodas leidžia atskirai aptikti antikūnus prieš įvairius patogeno antigenus (pavyzdžiui, sergant ŽIV infekcija, imunoblotavimas aptinka antikūnus prieš gp120, gp24 ir kitus viruso antigenus).
Radioimuninis tyrimas (RIA)
Metodas pagrįstas antigeno ir antikūno reakcija naudojant antigeną arba antikūno žymę su radionuklidu. Kaip etiketė naudojami 125I, 14C, 3H, 51Cr ir kiti radionuklidai. Susidarę imuniniai kompleksai yra išskiriami iš sistemos, o jų radioaktyvumas nustatomas skaitikliais (β spinduliuotė). Spinduliuotės intensyvumas yra tiesiogiai proporcingas surištų antigenų ir antikūnų molekulių skaičiui.
Plačiai naudojama kietosios fazės RIA versija, kurioje naudojami žymėti antikūnai arba antigenai, adsorbuoti polistireno plokščių šuliniuose.
RIA naudojama aptikti mikrobų, virusų, įvairių hormonų, fermentų, vaistinių medžiagų, imunoglobulinų antigenus, taip pat kitas medžiagas, esančias tiriamojoje medžiagoje nedidelėmis 10–12–10–15 g/l koncentracijomis.
Kontroliniai klausimai
Imuninės bakteriolizės reakcija: kokia tai reakcija; kas yra antigenas, kas yra antikūnas, reakcijos mechanizmas, nustatymo metodai, praktinis pritaikymas. Imuninės hemolizės reakcija: būtini ingredientai, nustatymo būdas; valdikliai, praktinis pritaikymas. Vietinės hemolizės reakcija gelyje (Yerne reakcija): reakcijos principas, formulavimo būdas, praktinis pritaikymas. Komplemento fiksavimo reakcija: reakcijos principas; kas susidaro imuniniam serumui sąveikaujant su specifiniu antigenu; kas atsitiks su papildymu, jei jis yra šioje sąveikoje? Koks yra komplemento likimas, jei nėra specifinio afiniteto tarp antigeno ir antikūnų? Kokia reakcija gali būti naudojama norint nustatyti, kas nutiko komplementui; kodėl naudojama ši reakcija; koks yra matomas teigiamas RSK rezultatas? Kodėl? Kokia komplemento savybė naudojama pirmajame CSC etape? Antrame etape? Jei galutinis RSK rezultatas yra hemolizė, ar tai reiškia teigiamą ar neigiamą rezultatą? Paaiškinkite rezultatus: RSK+ + + +, RSK+ + +, RSK+ +, RSK+. Pavadinkite pirmosios RSK sistemos sudedamąsias dalis ir antrosios RSK sistemos sudedamąsias dalis. Kodėl tiriamąjį serumą reikia inaktyvuoti? Kaip titruojamas komplementas? Hemolizinis serumas: kas jame yra, kaip jis gaunamas, kas yra titras ir kaip jis nustatomas? Kokie gyvūnai naudojami RSC komponentams gauti? RSC nustatymo šaltyje technika. Kurioms iš šių reakcijų stadijoje būtinas komplemento dalyvavimas: nusodinimas, flokuliacija, agliutinacija, nepilnų antikūnų nustatymas, imuninė bakteriolizė, imuninė hemolizė, Jerne, CSC? Imunofluorescencinė reakcija (RIF) – nurodykite tiesioginės Coons reakcijos įvykių seką; reikalingų ingredientų. Kas yra antigenas, kas yra antikūnas, kaip antikūnai žymimi, kaip atsižvelgiama į reakcijos rezultatą, kaip atrodo teigiamas rezultatas? Praktinis pritaikymas – ką galima nustatyti naudojant šią reakciją? Netiesioginė imunofluorescencinė reakcija – nurodykite šios reakcijos įvykių seką, reikalingus ingredientus, kas yra antigenas, kokie imuniniai serumai naudojami; praktinis naudojimas; netiesioginio RIF pranašumas prieš tiesioginę reakciją. Fermentinis imunologinis tyrimas (ELISA) – reakcijos principas; būtini ingredientai; nurodo įvykių seką nustatant reakciją, kad būtų aptiktas antigenas tiriamojoje medžiagoje; būtini ingredientai; kas atsitinka su teigiamu rezultatu, kaip jis atrodo? Nurodykite veiksmų seką ELISA metu, kad būtų galima aptikti antikūnus tiriamajame serume; būtini ingredientai; kas atsitiks su teigiamu rezultatu? Imunoblotingas – reakcijos principas; pagrindiniai etapai; būtini ingredientai; Kaip atsižvelgiama į rezultatą? reakcijos nauda. Radioimuninis tyrimas (RIA) – kokie yra pagrindiniai reakcijos etapai; kuo paženklinti antikūnai ar antigenai, kaip atsižvelgiama į rezultatą? Imunoelektroninė mikroskopija – metodo principas; pagrindiniai etapai; būtini ingredientai; Kuo paženklinti antikūnai? kaip atsižvelgiama į reakcijos rezultatą. Imobilizacijos reakcijos – metodo principas, nustatymo technika, komponentai, rezultatų apskaita.
Užduotys, kurias reikia atlikti savarankiško mokymosi procese.
Užpildykite Imuniteto reakcijų lentelę, kad gautumėte šioje temoje aptartas reakcijas.
Imuninės reakcijos
Mokinio darbas praktinėje pamokoje
Nedelsdami pradėkite darbą suformuluodami 1-ąjį RSC etapą, bet vėliau užsirašykite jį į sąsiuvinį (žr. toliau).
1. Imuninės hemolizės reakcija. Peržiūrėkite demonstracinę imuninės hemolizės reakciją, nubraižykite ją kaip diagramą, paaiškinkite rezultatą eksperimentiniuose ir kontroliniuose mėgintuvėliuose.
2. Komplemento surišimo reakcija
a) išardykite RSC pagal lentelę;
b) užrašų knygelėje nubrėžkite RSC nustatymo schemą lentelės pavidalu;
c) įdėti antrąjį RSK etapą (pirmasis etapas dedamas pamokos pradžioje);
d) išardyti RSK būtinus diagnostinius preparatus;
e) atsižvelgti į rezultatą. Suformuluokite išvadą apie specifinių antikūnų buvimą tiriamajame serume.
3. Imunofluorescencinė reakcija. Išstudijuokite lentelę, savo užrašų knygelėje sudarykite reakcijos nustatymo schemą; pamatyti diagnostinius serumus; nustatyti, kas serume yra, kaip jis paruoštas, kokiai reakcijai (tiesioginei ar netiesioginei RIF) jis naudojamas. Pažiūrėkite į RIF demonstravimo rezultatą fluorescenciniame mikroskope.
4. Fermentinis imunologinis tyrimas (ELISA). Užrašų knygelėje sudarykite dviejų variantų reakcijos schemą: antigenui aptikti tiriamojoje medžiagoje ir antikūnams serume nustatyti. Peržiūrėkite ŽIV ir hepatito B diagnostikos sudedamųjų dalių rinkinį. Nustatykite, kas yra kiekvienoje sudedamojoje dalyje ir kam jis naudojamas.
5. Imunoblotingas. Savo užrašų knygelėje pasidarykite reakcijos schemą; pamatyti demonstraciją – reakcijos rezultatą.
6. Radioimuninis tyrimas (RIA). Sąsiuvinyje nupieškite reakcijos schemą.
7. Imuninė elektroninė mikroskopija (IEM). Žiūrėkite demonstraciją – reakcijos rezultatą, užrašų knygelėje surašykite reakcijos schemą, rodyklėmis nurodykite antigeną (virusą) ir pažymėtus antikūnus.
Imunoblotavimas yra labai jautrus baltymų aptikimo metodas, pagrįstas elektroforezės ir ELISA arba RIA deriniu. Imunoblotavimas naudojamas kaip ŽIV infekcijos diagnostikos metodas ir kt.
Bendrąja prasme imunoblotingas suprantamas kaip baltymų mišinio, perkelto į kietą atramą-membraną, su kuria jie jungiasi kovalentiniais ryšiais, analizė, po kurios atliekama imunodetekcija.
Galima analizuoti baltymų mišinį, tiesiogiai nusodintą ant substrato (taškinė analizė) arba po jo išankstinio frakcionavimo elektrofokusavimo, disko elektroforezės arba dvimatės elektroforezės (Western blot) būdu.
Patogenų antigenai atskiriami poliakrilamido gelio elektroforezės būdu, po to iš gelio perkeliami į aktyvuotą popierių arba nitroceliuliozės membraną ir sukuriami ELISA metodu.
Firmos gamina tokias juosteles su antigenų „dėmėmis“. Ant šių juostelių tepamas paciento serumas. . Tada, po inkubacijos, pacientas nuplaunamas nuo neprisijungusių paciento antikūnų ir užtepamas serumas prieš žmogaus imunoglobulinus, paženklintus fermentu. . Ant juostelės susidaręs kompleksas (antigenas + paciento antikūnas + antikūnas prieš žmogaus Ig) aptinkamas pridedant chromogeninį substratą, kuris, veikiant fermentui, keičia spalvą.
Ši metodika taip pat taikoma atrenkant bakterijų, fagų ar virusų, ekspresuojančių tikslinių klonuotų genų produktus, klonus.
Baltymų perkėlimas į membraną atliekamas pasyviai arba naudojant elektros perdavimo aparatą. Baltymų pernešimo į membraną efektyvumą įtakoja daugelis veiksnių, tokių kaip baltymų molekulinė masė, gelio poringumas, perdavimo laikas ir naudojamo buferinio tirpalo (trans buferio) sudėtis.
Atsižvelgiant į eksperimento užduotis ir sąlygas, parenkamos perkėlimo sąlygos, kurios užtikrina geriausius rezultatus. Dažniausiai naudojami substratai yra nitroceliuliozė, polivinilideno difluoridas (PVDF) arba teigiamai įkrautos nailono membranos. Nitroceliuliozė gali surišti iki 80-100 mikrogramų baltymų 1 cm2.
Mažos molekulinės masės baltymai (kurių molekulinė masė mažesnė nei 20 kDa) gali būti prarasti dėl plovimo, o tai leidžia preliminariai ištirti tam tikrų genetinių lokusų polimorfizmą pagal atitinkamų restrikcijos DNR fragmentų ilgius.
Be to, naudojant Southern hibridizaciją, nesunku išsiaiškinti, ar tikslinio geno vidinėje dalyje yra tam tikro restrikcijos fermento hidrolizės vieta, kuri leidžia pasirinkti optimalią tiriamo genomo regiono klonavimo strategiją.
Pagal panašią schemą RNR molekulės taip pat gali būti perkeltos iš agarozės gelio į nitroceliuliozės filtrą. Šis metodas buvo vadinamas Northern blotting, o ne Southern blotting, nes pavardė Southern angliškai reiškia „pietinis“.
Atitinkamai, perkėlimas į filtrus iš baltymų gelio buvo vadinamas Western blotting. Dideli baltymai (didesni nei 100 kDa), denatūruoti natrio dodecilsulfato (SDS) tirpale, gali būti prastai perkelti į membraną, jei transbuferyje yra etanolio. Alkoholis žymiai pagerina baltymų pernešimą iš SDS-poliakrilamido gelio, tačiau susiaurina poras gelyje, dėl ko išlaikomi dideli baltymai.
PVDF membrana yra optimizuota imunodetekcijai ir gali išlaikyti specifiškai surištus baltymus iki 160 µg/cm2 su labai mažu nespecifinio surišimo lygiu.
Imunoblotingas
Svarbi šios membranos savybė yra galimybė ją pakartotinai naudoti. Zeta-Probe nailono membranos veiksmingai suriša SDS baltymus, kai nėra alkoholio, ir šis surišimas yra atsparus tolesniam gydymui. Taip pat efektyviai išlaikomi mažos molekulinės masės baltymai. Zeta-Probe membranos, kurių surišimo geba yra maždaug 480 μg baltymų 1 cm2, leidžia aptikti nedidelius baltymų kiekius tyrimo mišiniuose.
Antigenui imobilizavus ant membranos, likusios surišimo vietos blokuojamos želatinos, galvijų serumo albumino arba lieso pieno tirpalais.
Tada membrana inkubuojama polikloninių arba monokloninių antikūnų prieš tiriamą antigeną tirpale. Nuplovus neprisijungusius antikūnus, membrana inkubuojama antrinių antikūnų tirpale, kurie yra šarminės fosfatazės fermentų (šarminės fosfatazės, AP) arba krienų peroksidazės (HRP) konjugatas su antikūnais prieš rūšinius (ožkų antikūnus prieš triušius, pelę ar. žmogaus imunoglobulinai) arba baltymai A (Staphylococcus aureus baltymas) arba G (Streptococcus sp. proteinas), turintys didelį afinitetą imunoglobulinų Fc sričiai.
Susidariusių imuninių kompleksų aptikimas atliekamas cheminiu arba chemiliuminescenciniu metodu. Cheminės reakcijos substratai naudojant šarminės fosfatazės konjugatus yra 5-bromo-4-chlor-3-indolilfosfatas (BCIP) arba tetrazolio mėlynasis (NBT), o naudojant krienų peroksidazės konjugatus - 4-chlor-1-naftolis ir vandenilio peroksidas.
Dėl fermentinių reakcijų ant membranos antigeno-antikūno komplekso lokalizacijos vietoje susidaro spalvota juosta arba dėmė.
Šio metodo jautrumas yra 100 pg baltymų naudojant AP konjugatus ir 100-500 pg naudojant HRP konjugatus. Chemiliuminescencinis imuninių kompleksų nustatymas gali aptikti mažiau nei 5 pg antigeno. Šio metodo principas – HRP reaguojant su vandenilio peroksidu ir cikliniu diacilhidrazinoluminoliu, skleidžiama 428 nm bangos ilgio šviesa, kurią galima įrašyti į šviesai jautrią plėvelę.
Imunoblotavimo reakcija (RI) buvo sukurta remiantis ELISA. Tai specifiškiausias ir jautriausias imunocheminės analizės metodas. Imunoblotavimas (iš anglų kalbos blot - sušlapti, dėmė) sujungia ELISA su elektroforeze. Jis naudojamas aptikti ne sudėtingus antikūnus prieš ŽIV, o antikūnus prieš atskirus jo struktūrinius baltymus (baltymus-p24, glikoproteinus-gp120, gp 41 ir kt.). ŽIV infekcijos diagnozei žr. ekspertų (patvirtinamųjų) reakcijų.
Reakcija vyksta keliais etapais:
Virusas sunaikinamas į komponentus - antigenus (p24, gp120, gp 41 ir tt), kuriems atliekama elektroforezė poliakrilamido gelyje, tai yra, antigenų atskyrimas į frakcijas pagal molekulinę masę.
2. Gelis padengiamas nitroceliuliozės membrana ir į ją elektroforezės būdu perkeliamos antigeno frakcijos. Nitroceliuliozė elgiasi kaip blotingasis popierius. Membrana supjaustoma juostelėmis (juostelėmis). Firmos gamina tokias juosteles su antigenų „dėmėmis“.
Imunoblotingas – papildomas netiesioginis metodas
Juostelės su užteptais ŽIV antigenais panardinamos į tiriamojo serumą ir nuplaunamos nuo nesurištos medžiagos.
4. Juostelės inkubuojamos su peroksidaze pažymėtu antiglobulino serumu ir nuplaunamos.
Pridedamas substratas ir pažymimas spalvotų frakcijų (dėmių) skaičius, atitinkantis AG-AT komplekso lokalizacijos zoną.
Juostelių buvimas tam tikrose juostelės vietose patvirtina, kad tiriamame serume yra antikūnų prieš griežtai apibrėžtus ŽIV antigenus. Imunoblotavimo rezultatas laikomas teigiamu, jei ant membranos matomos juostos, atitinkančios bet kuriuos du iš trijų ŽIV antigenų – p24, gp41 ir gp 120 (37 pav.).
BRĖŽINIAI
NAUDOTOS LITERATŪROS SĄRAŠAS
Pagrindinė literatūra
Medicinos mikrobiologija, virusologija ir imunologija: vadovėlis medicinos studentams. universitetai 2-asis leidimas, pataisytas. ir papildomas – 702 p. Red. A.A. Vorobjovas. M.: VRM, 2012 m.
2. Mikrobiologija, virusologija ir imunologija: laboratorinių tyrimų vadovas: studijų vadovas / (V.B. Sboychakov ir kt.); red. V.B.Sboychakova, M.M.Karapats. – M.: GEOTAR-Media, 2014.- 320 p.: iliustr.
3. Medicinos mikrobiologija, imunologija ir virusologija [Elektroninis išteklius]: medaus vadovėlis.
universitetai - 760 p. — Prieigos režimas: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN9785299004250.html Korotyaev A.I., Babichev S.A. Sankt Peterburgas: Spetslit, 2010 m.
4. Medicinos mikrobiologija, virusologija ir imunologija [Elektroninis išteklius]: vadovėlis: 2 tomai / V. 1. - 448 p. — Prieigos režimas: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142241.html Zverev V.V., Boychenko M.N.
M. : Geotar Media, 2010. .
5. Medicinos mikrobiologija, virusologija ir imunologija [Elektroninis išteklius]: vadovėlis: 2 tomai T. 2 - 480 p. Prieigos režimas: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142242.html Zverev V.V., Boychenko M.N. M. : Geotar Media, 2010 m.
papildomos literatūros
1. Imunodiagnostinės reakcijos: vadovėlis / sudarytojai: G.K. Davletshina, Z.G. Gabidullin, A.A. Akhtarieva, M.M.
Khusnarizanova, Yu.Z. Gabidullin, M.M. Alsynbaev - Ufa: Rusijos sveikatos apsaugos ministerijos GBOU VPO BSMU leidykla, 2016 m. - 86 p.
2. Kai kurių savybių, lemiančių kartu auginamų Enterobacter, Сitrobacter, Serratia, E. coli, Proteus bakterijų variacijų patogeninį potencialą, ypatybės: mokslinė publikacija / Yu. Z. Gabidullin, R. S. Sufiyarov, I. I. Dolgushin - Ufa, 2015. - 250 s.
Pagrindinis puslapis » Imunoblotas – kas tai? Imunoblotas diagnozuojant infekcines ligas
Imunoblotas - kas tai? Imunoblotas diagnozuojant infekcines ligas
Kas yra imunoblotas? Tai yra įprastas žmogaus virusinių infekcijų laboratorinės diagnostikos metodas. Tai vienas tiksliausių ir patikimiausių būdų nustatyti ŽIV buvimą.
Dėl patikimumo jis yra net didesnis nei su fermentu susietas imunosorbento (elisa) tyrimas. Imunoblotų rezultatai laikomi įtikinamais ir įtikinamais.Bendroji informacija
Imunoblotas - kas tai? Norint atpažinti asmenį ŽIV užsikrėtusiu, turite atlikti laboratorinį tyrimą ir nustatyti, ar kraujo serume nėra antikūnų.
Western blot sekcijų metodas taip pat vadinamas Western blot (western blot). Jis naudojamas žmogaus virusinėms infekcijoms nustatyti, kaip papildomas ekspertinis metodas. Tai būtina norint patvirtinti ELISA – laboratorinį tyrimą, leidžiantį nustatyti antikūnų prieš ŽIV buvimą kraujyje. Imunoblotas dar kartą patikrinkite teigiamą ELISA.
Jis laikomas jautriausiu, sudėtingiausiu ir brangiausiu.
Tikslas
Kas yra imunoblotas? Šis kraujo serumo laboratorinio tyrimo metodas, siekiant nustatyti antikūnų prieš virusą buvimą.
Atliekant specialius tyrimus dėl bendro viruso baltymų kiekio gelyje ir ant nitroceliuliozės membranų.
Imunoblotavimas (antikūnų aptikimas pacientų serume prieš tam tikrus patogeno antigenus)
Western blot sekcijos procedūra skirta ŽIV infekcijai nustatyti įvairiais etapais. Pirmajame etape išvalytas virusas iš jo sudedamųjų dalių yra elektroforezė ir jame esantys antigenai, padalyti iš molekulinės masės.
Žmogaus imunodeficito virusas dauginasi gyvose ląstelėse, įterptose į jo genetinę informaciją. Šiame etape asmuo tampa ŽIV viruso nešiotojas, jei esate užsikrėtęs.
Šios ligos specifika yra ta, kad ji ilgą laiką nepasireiškia. Virusas naikina limfocitus, todėl sumažėja žmogaus imunitetas, organizmas nebegali kovoti su infekcijomis.
Jei ŽIV bus gydomas teisingai ir laiku, pacientas gyvens iki senatvės. Gydymo trūkumas neišvengiamai sukelia mirtį. Nuo užsikrėtimo momento, bet be gydymo, maksimalus laikotarpis yra ne daugiau kaip dešimt metų.
Ypatumai
Imunoblotinė analizė yra patikimas metodas, leidžiantis nustatyti, ar yra antikūnų prieš pirmojo ir antrojo tipo ŽIV antigenus.
Jei žmogus yra užsikrėtęs, po dviejų savaičių antikūnų, kuriuos galima aptikti daug vėliau. ŽIV ypatybė yra ta, kad antikūnų kiekis greitai didėja ir lieka paciento kraujyje. Net jei jie yra, liga gali nepasireikšti dvejus ar daugiau metų. ELISA metodas ne visada tiksliai nurodo ligos buvimą, todėl reikia patvirtinti PGR ir Western blot sekcijų rezultatus, jei fermento imunologinis tyrimas parodė teigiamą rezultatą.
Indikacijos dėl
Koks „imunoblotas“ jau buvo nustatytas, bet kuris pristatomas tyrime?
Žmogaus imunodeficito viruso (ŽIV) imunobloto tyrimo priežastis bus teigiamas ELISA rezultatas. Pacientams, kuriems ruošiamasi operuoti, būtina atlikti su fermentu susietą imunosorbento tyrimą. Be to, turėtumėte analizuoti moteris, planuojančias nėštumą, taip pat tuos, kurie yra išsižadėję. Jei Elisa rezultatai abejotini, ŽIV užsikrėtusiems pacientams skiriamos Western blot sekcijos.
Kreipimosi į gydytoją priežastimi gali būti šie nerimą keliantys simptomai: greitas svorio kritimas, silpnumas, funkcijų praradimas, žarnyno sutrikimai (viduriavimas), trunkantis tris savaites, dehidratacija, karščiavimas, limfmazgių padidėjimas organizme, kandidozės vystymasis. tuberkuliozė, pneumonija, toksoplazmozė, pūslelinės paūmėjimas.
Prieš duodamas veninį kraują pacientui ruoštis nereikia.
Nevalgykite 8-10 valandų prieš tyrimą. Nerekomenduojama gerti alkoholio ir kavos gėrimų, sunkių fizinių pratimų, patirti jaudulį dieną prieš kraujo davimą.
Kur atlikti analizę?
Kur galiu išsitirti dėl ŽIV?
ELISA – imunoblotinė analizė, atliekama privačiose miesto klinikose, rezultatus pateikia per dieną. Taip pat galima nedelsiant nustatyti diagnozę. Valstybinėse įstaigose elisa medicininiai tyrimai ir Western blot skyriai pagal Rusijos Federacijos įstatymus yra nemokami.
Privalomas nėščiųjų, ligonių, kuriems reikalinga hospitalizacija ar operacija, infekcinių ligų patikra Kaip atliekamas šis tyrimas?
Kaip atlikti ELISA tyrimą? Imunoblotas teigiamas / neigiamas patvirtina arba paneigia elisa rezultatus. Procedūra gana paprasta. Specialistas paima veninį kraują, laiku tai trunka mažiau nei penkias minutes.
Po mėginio paėmimo injekcijos vieta turi būti dezinfekuojama ir užklijuojama gipsu. Mėginiai imami nevalgius, todėl po procedūros nepakenks suvalgyti plytelę juodojo šokolado ar saldaus karšto gėrimo.
Norėdami gauti siuntimą nemokamai analizei valstybinėje gydymo įstaigoje, turite apsilankyti pas terapeutą.
Apskritai imunoblotas nesiskiria nuo kitų kraujo tyrimų imant mėginius. Tyrimo metodika paprasta. Jei žmogaus kraujyje yra viruso, organizmas pradeda gaminti antikūnus, kad jį sunaikintų. Kiekvienam virusui yra daug baltymų antigenų. Šių antikūnų aptikimas yra Western blot atskyrimo metodo pagrindas. Kaina
Kiek analizės? ŽIV imunoblotas reiškia pigius tyrimus.
Vidutiniškai atrankos imunologinio tyrimo metodai svyruoja nuo 500 iki 900 rublių. Western blot skyriai yra tyrimo patikrinimas, kurio kaina svyruoja nuo trijų iki penkių tūkstančių rublių. Sudėtingesni metodai yra daug brangesni. Pavyzdžiui, už polimerazės grandininės reakcijos (PGR) analizę turėsite sumokėti apie 12 000 rublių.
Rezultatų interpretacija
Dažniausi ŽIV infekcijos diagnozavimo metodai yra fermentų imunologinis tyrimas ir imunoblotas.
Jie skirti žmogaus imunodeficito viruso antikūnams serume nustatyti. Infekcija paprastai patvirtinama dviem tyrimais: patikra ir patvirtinamuoju. Rezultatų interpretaciją turėtų atlikti gydytojas, jis diagnozuoja ir paskiria gydymą. Jei imunoblotas teigiamas, tai reiškia, kad žmogaus organizme yra virusas.
Teigiamas rezultatas neturėtų būti savarankiško gydymo priežastis, nes kiekvienas pacientas gali turėti savo ligos vaizdą.
Kokybinė analizė apima patikrinimą ir sertifikavimą. Jei pacientas neturi viruso, rezultatas yra „neigiamas“. Nustačius šį sertifikatą, atliekami papildomi atrankiniai tyrimai. Imunobloto analizė, patvirtinanti arba paneigianti atranką. Jei bandymo juostelės atsiranda tam tikrose vietose patamsėjus (baltymų lokalizacija), diagnozė yra „ŽIV“.
Jei rezultatai abejotini, tyrimai atliekami per tris mėnesius.
Apsisaugoti nuo užsikrėtimo žmogaus imunodeficito virusu galima laikantis tam tikrų taisyklių: vengti atsitiktinio lytinio kontakto, kontakto metu naudoti prezervatyvus, nevartoti narkotikų.
Jei liga nustatoma nėščiai moteriai, svarbu laikytis gydančio gydytojo rekomendacijų, nepamiršti tyrimų dėl viruso buvimo.
Kas yra Western Blotting?
Baltymų identifikavimas sudėtinguose įvairių audinių mišiniuose ar ekstraktuose yra viena iš dažnai sutinkamų problemų. Naudojant tokį įrankį kaip specifinius antikūnus, galima nustatyti tiriamą baltymą su minimaliomis laiko ir finansinėmis sąnaudomis.
Taikant Western blot metodą, pirmajame etape baltymų mišinys atskiriamas elektroforezės būdu, dalyvaujant natrio dodecilsulfatui (SDS), po to perkeliamas į nitroceliuliozės membraną elektroblotavimo būdu.
Šio metodo esmė slypi tame, kad gelis po elektroforezės dedamas ant nitroceliuliozės membranos tarp filtravimo popieriaus sluoksnių. Taip surinktas „sumuštinis“ dedamas į elektrinį lauką, kad baltymo-SDS kompleksai judėtų per gelio plokštelę ir būtų imobilizuoti (dėl nespecifinės sorbcijos) ant nitroceliuliozės membranos paviršiaus.
Jungiant baltymo-SDS kompleksą prie nitroceliuliozės membranos, daugiausia dalyvauja elektrinės jėgos, o ši sąveika yra daugiataškė ir lemia baltymų „plitimą“ membranos paviršiuje. Taigi po elektrotransferos gauname nitroceliuliozės gelio kopiją su baltymais, išdėstytais taip pat, kaip ir poliakrilamido gelyje.
Po SDS - elektroforezės, elektrotransferos ir baltymų sorbcijos iš gelio ant nitroceliuliozės membranos, tretinė baltymo konformacija labai pasikeičia, jei apskritai teisinga kalbėti apie tretinės baltymo struktūros egzistavimą po tokio atšiauraus apdorojimo. . Todėl imunocheminiam tiriamo baltymo nustatymui dažniausiai naudojami tik mono- arba polikloniniai antikūnai, būdingi baltymo molekulės linijinėms sritims.
51. Fermentinis imunologinis tyrimas, imunoblotingas. Mechanizmas, komponentai, taikymas.
Antikūnai, specifiniai konformaciniams epitopams (arba vietoms, kuriose yra kontaktų tarp subvienetų), paprastai netinka naudoti Western blot metodu.
Po baltymų pernešimo membrana paeiliui inkubuojama su tiriamam baltymui būdingais antikūnais, o po to su antriniais antikūnais, specifiniais pirminių antikūnų Fc fragmentams, konjuguotais su fermento (ar kitokiu) ženklu (1 pav.).
1 A). Tuo atveju, kai tiriamam antigenui specifiniai pirminiai antikūnai yra tiesiogiai konjuguoti su etikete, antrinių antikūnų nereikia (1 B pav.). Imuniniai kompleksai, susidarę tiriamo baltymo lokalizacijos vietoje, „išsireiškia“ chromogeninio substrato pagalba (priklausomai nuo etiketės tipo).
Metodo jautrumas ir specifiškumas labai priklauso nuo to, kokie antikūnai naudojami tyrime.
Naudojami antikūnai turi būti specifiniai unikaliai aminorūgščių sekai, būdingai tik tiriamam baltymui. Priešingu atveju galima antikūnų sąveika (ypač stambių baltymų ekstraktų atveju) su keliomis baltymų molekulėmis, o tai savo ruožtu lems kelių spalvotų juostų atsiradimą ant membranos.
Šiuo atveju tiriamo baltymo nustatymas dažnai būna sunkus arba net neįmanomas.
Antras svarbus veiksnys, į kurį reikia atsižvelgti renkantis antikūnus, yra afinitetas. Kuo didesnis naudojamų antikūnų afinitetas, tuo ryškesnės ir aiškesnės baltymų juostos nusidažo, tuo didesnis metodo jautrumas. Naudojant didelio afiniteto antikūnus, galima pasiekti 1 ng ir net didesnį jautrumą.
Norint vizualizuoti su membrana susieto antigeno ir antikūnų sąveikos rezultatą, naudojami antriniai antikūnai, konjuguoti su agentais, galinčiais tam tikromis sąlygomis duoti tam tikrą signalą.
Paprastai kaip toks agentas naudojamas fermentas (peroksidazė arba fosfatazė), kurio reakcijos produktas turi spalvą ir nusėda ant membranos netirpių nuosėdų pavidalu.
Šiuo metodu taip pat galima naudoti fluorescencines etiketes.
Ryžiai. 1. Tirto baltymo imunocheminio dažymo schema: A - naudojant antrinius antikūnus, konjuguotus su fermento žyme; B – pirminis antikūnas yra tiesiogiai konjuguotas su fermento žyme.
Protokolas:
I. Gelio ir membranos paruošimas ir baltymų elektrotransfera
Poliakrilamido gelis po elektroforezės buvo patalpintas į vonią su blotingo buferiu (25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM glicinas, 10 % etanolis).
Du filtravimo popieriaus lapai, supjaustyti pagal blotingo kasetės formą ir sudrėkinti blotingo buferiu, dedami ant tos kasetės dalies, kuri bus nukreipta į anodą. Tada ant filtravimo popieriaus dedama nitroceliuliozės membrana, iš anksto sudrėkinta tuo pačiu buferiu, užtikrinant, kad tarp membranos ir popieriaus nebūtų oro burbuliukų.
Po to gelį reikia atsargiai uždėti ant membranos, ypatingą dėmesį skiriant, kad tarp gelio ir membranos nebūtų oro burbuliukų. Sumuštinį užbaigia du sudrėkinto filtravimo popieriaus sluoksniai, kurie dedami ant gelio paviršiaus (2 pav.). Gautas sumuštinis įspaudžiamas į kasetę ir dedamas tarp elektrodų taip, kad membrana būtų nukreipta į anodą.
Ryžiai. 2. Baltymų elektros perdavimo į membraną schema.
II. elektros perdavimas
Baltymai perkeliami į nitroceliuliozės membraną buferyje, kuriame yra 25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM glicino, 10 % etanolio, 30–50 min., esant pastoviai 100 V įtampai.
Elektros perdavimo laikas priklauso nuo pernešamų baltymų dydžio, kuo didesnis baltymas, tuo ilgiau užtrunka elektros perdavimas. Elektrotransporto kokybė ir baltymų juostų išsidėstymas buvo įvertintas nitroceliuliozės membraną nudažant 0,3 % Ponceau S 1 % acto rūgštyje. Prieš atliekant imuninį dažymą, membraną reikia kelis kartus nuplauti silpnai šarminiu vandeniniu Tris tirpalu, kad būtų pašalinti su baltymais susieti dažai.
III. Ant nitroceliuliozės membranos imobilizuotų baltymų imunocheminis dažymas
Norint blokuoti nespecifines antikūnų surišimo vietas, membrana inkubuojama nuolat maišant kambario temperatūroje 30 min PBST (geresniam blokavimui galima naudoti PBST tirpalą, kuriame yra 10 % nugriebto pieno miltelių).
Po blokavimo membrana inkubuojama vieną valandą kambario temperatūroje, nuolat maišant PBST, kuriame yra 1-10 μg/ml specifinių antikūnų.
Optimali antikūnų koncentracija parenkama empiriškai ir priklauso nuo antikūnų sąveikos su antigenu afiniteto.
Inkubavimo pabaigoje membrana 5 kartus plaunama PBST ir perkelta į antrinių antikūnų, konjuguotų su krienų peroksidaze, tirpalą. Konjugato praskiedimą paprastai nurodo gamintojas ant pakuotės arba empiriškai parenka tyrėjas. Inkubuokite membraną antrinių antikūnų tirpale 1 valandą nuolat maišydami.
Po kruopštaus plovimo (bent 5–6 buferio keitimai) PBST membrana perkeliama į chromogeninio substrato tirpalą, kuriame yra 3 mg diaminobenzidino (DAB) ir 10 µl 30 % vandenilio peroksido 10 ml 0,1 M Tris-HCl, pH 7,6. .
Inkubuojama maišant 5–10 minučių. Pasibaigus inkubacijai su substratu, membraną reikia nuplauti PBST, išdžiovinti filtravimo popieriumi ir nedelsiant padaryti elektroninę kopiją nuskaitant spalvotą. Jei membrana visiškai išsausėja, dažytos baltymų juostelės išblunka, vaizdas tampa ne toks ryškus ir kontrastingas.
Pastaba: DAB yra toksiškas ir galimas kancerogenas. Dirbkite tik su guminėmis pirštinėmis!