ИССЛЕДОВАНИЕ БЕЛКОВОГО ОБМЕНА
Активности панкреатической липазы
Клинико-диагностическое значение определения
Повышение активности панкреатической липазы в сыворотке крови отмечено при панкреатите любого происхождения, в особенности- остром панкреатите, при котором активность фермента повышается также и в асцитической жидкости. У больных панкреатитом целесообразно одновременно исследовать активность липазы в крови и моче, поскольку в последней она оказывается повышенной чаще, чем в крови. Лекарственные препараты, провоцирующие спазм сфинктера Одди (наркотические средства, анальгетики, секретин), гепарин (стимулирующий высвобождение липазы) активируют данный фермент.
Низкие показатели активности липазы обнаружены у больных туберкулезом, сифилисом, раком, при различных инфекционных заболеваниях, причем по мере прогрессирования патологического процесса активность фермента все более снижается.
Белки – высокомолекулярные азотсодержащие вещества. Различают простые белки – протеины, состоящие из 20 различных аминокислот, и сложные белки – протеиды, состоящие из протеина и простетического (небелкового) компонента. К простетическим компонентам относятся нуклеиновые кислоты, гем, липиды, фосфорная кислота и др. К сложным белкам относятся нуклеопротеиды, хромопротеиды, липопротеиды, фосфопротеиды.
Биохимический анализ обычно начинается с определения содержания общего белка в плазме (сыворотке) крови .
Изменения уровня общего белка бывают как абсолютными, так и относительными. Последние обычно наблюдаются при увеличении (уменьшении) объема крови (плазмы). Так, гидремия приводит к относительной гипопротеинемии, а дегидратация - к относительной гиперпротеинемии. В связи с этим, при трактовке показателей общего белка в сыворотке (плазме) крови следует обязательно учитывать нарушения водного обмена.
Дегидратация может скрыть абсолютную гипопротеинемию, поскольку при данном сочетании концентрация белка в плазме крови не всегда отличается от нормы. Отсюда следует, что причиной гипо- и гиперпротеинемии может быть не только нарушение равновесия между поступлением, биосинтезом белка, его катаболизмом и удалением, но и изменение объема внутрисосудистого пространства за счет жидкой (водной) части крови. Понятно, что патогенез этих изменений различен.
Для дифференциации абсолютных и относительных изменений содержания белка в плазме достаточно исследовать показатель гематокрита или определить объем плазмы (крови).
При подавляющем большинстве хронических заболеваний внутренних органов, сопровождающихся сдвигами в белковом обмене, обнаруживается гипопротеинемия, носящая обычно вторичный характер.
Абсолютная гипопротеинемия выявляется при патофизиологических синдромах, выражающихся в снижении биосинтеза, усилении катаболизма, аномальных потерях, патологическом распределении белка между отдельными секторами организма. Причинами абсолютной гипопротеинемии являются:
1. Недостаточное поступление белка с пищей вследствие голодания, недоедания, сужения (стриктуры) пищевода (из-за ожога, опухоли), нарушения целостности и функции желудочно-кишечного тракта͵ при продолжительных воспалительных процессах в стенке кишечника и других состояниях, сопровождающихся ухудшением переваривания и всасывания белков.Снижение уровня общего белка в плазме (или тенденция к развитию гипопротеинемии) отмечается также при синдроме нарушенного всасывания белковой пищи и несбалансированности ее аминокислотного состава.
2. Подавление протеосинтетической функции печени, наблюдаемое при паренхиматозных гепатитах, циррозах печени, а также интоксикациях, обусловленных длительными нагноительными процессами, злокачественными новообразованиями, тиреотоксикозом, токсическим действием некоторых химических веществ.
3. Повышенный распад белков в организме, вызванный потребностью в возмещении больших энергетических затрат, связан с дефицитом пластических ресурсов. Отмечается при термических ожогах и ожоговой болезни, злокачественных новообразованиях.
4. Потеря белка организмом: с кровью при острых и хронических кровотечениях, с мочой при нефротическом синдроме (нефрозе, амилоидозе почек).
5. Перемещение в другие ткани при резко увеличенной проницаемости капиллярной стенки: образование обширных отеков, переход в третье пространство - при образовании экссудатов, выпотов в серозные полости, в просвет кишечника (при завороте кишок, перитоните).
6. Дефектопротеинемии, ᴛ.ᴇ. сравнительно редко встречающиеся наследственно обусловленные (генетически детерминированные) нарушения в синтезе белков крови.
7. Особенности физиологического состояния организма. Пониженное содержание белка в плазме крови отмечено и при некоторых физиологических состояниях: к примеру, у женщин в последние месяцы беременности и в период лактации.
Относительные гипопротеинемии. Известно, что обильные перфузии раствора глюкозы и других физиологических жидкостей, приводят к уменьшению концентрации белка вследствие увеличения объема жидкой части крови.
Более половины всего количества белков плазмы (35-55г/л) приходится на долю альбумина. Альбумин плазмы быстро обновляется: в течение суток синтезируется и распадается 10-16г этого белка. Благодаря значительной концентрации, высокой гидрофильности и небольшим размерам молекул альбумин выполняет важную функцию по поддержанию коллоидоосмотического давления крови. Тем самым он принимает участие в обмене воды между кровью и межтканевым пространством. При содержании альбумина ниже 30г/л онкотическое давление уменьшается настолько, что вода переходит из внутри - во внесосудистый сектор.
Определение уровня альбумина в плазме играет существенную роль для оценки тяжести течения заболеваний, сопровождающихся гипоальбуминемией.
Столь же важное диагностическое значение имеет определение концентрации альбумина в моче.
Снижение уровня альбумина отмечается при хронических заболеваниях почек – нефротическом синдроме, а также при ожогах, кровопотерях, инфекционных болезнях, гнойных процессах, неспецифической пневмонии, туберкулезе легких и других органов, остром полиартрите и иных воспалительных состояниях, при злокачественных опухолях (раковая кахексия), лейкемии, анемии, сердечной недостаточности, инфаркте миокарда, массивной потере белка через кишечник.
Появление белка в моче (протеинурия) отмечается при ряде заболеваний почек. Принято выделять органические (вызванные поражением паренхимы почек – заболевания воспалительного характера, нефротический синдром, иногда врожденные дефекты нефрона) и функциональные почечные протеинурии, связанные с увеличением проницаемости почечного фильтра или замедлением тока крови в клубочках (под влиянием переохлаждения, физического и психического перенапряжения).
Преренальная протеинурия связана с усиленным распадом белков тканей, выраженным гемолизом; ренальная - обусловлена патологией почек (клубочковой и канальцевой); постренальная - вызвана патологией мочевыводящих путей и чаще всего – воспалительной экссудацией.
Принято дифференцировать три степени выраженности протеинурии : умеренную – при суточной потере белка до 1г, среднюю – от 1 до 3 г и выраженную – более 3г/сутки.
Основными причинами протеинурии являются:
1. повышение проницаемости гломерулярного фильтра для белков плазмы (гломерулярная протеинурия);
2. нарушение канальцевой реабсорбции профильтрованных белков (тубулярная протеинурия);
3. парапротеинемия и/или увеличение содержания белков в крови;
4. изменение почечной гемодинамики;
Страница 66 из 76
Видео: Определение с реактивного белка в сыворотке крови
Показатели общего белка плазмы крови и его отдельных фракций имеют важное значение в диагностике многих заболеваний.
Определение общего белка сыворотки крови. Может производиться с помощью ряда методов (азотометрические, гравиметрические, нефелометрические, рефрактометрические, спектрофотометрические и др.). Из колориметрических способов биуретовый метод наиболее специфичен, достаточно чувствителен, точен и практически доступен. Этот метод представлен в качестве унифицированного для определения общего белка в сыворотке крови. Основан он на следующем принципе: белки реагируют в щелочной среде с меди сульфатом, образуя соединения, окрашенные в фиолетовый цвет.
Техника определения общего белка такова. К 5 мл рабочего раствора биуретового реактива (4,5 г сегнетовой соли растворяют в 40 мл 0,2 н. NaOH, прибавляют 1,5 г C11SO4 5Н2О и 0,5 г К1 и доливают до 100 мл 0,2 н. NaOH) добавляют 0,1 мл сыворотки крови. Через 30 минут пробу колориметрируют на ФЭКе в 10 мм кювете при зеленом светофильтре против контроля. Для приготовления контроля к 5 мл биуретового реактива добавляют 0,1 мл 0,9 % NaCl. Расчет ведут по калибровочному графику.
Нормальная концентрация общего белка у взрослых колеблется от 62 до 82 г/л. Данные по возрастам у детей представлены в табл. 49.
Таб.г. 49. Содержание белковых фракций в процентах от общего количества белка (средние данные) по возрастам (по Ю. Е. Вельтищеву, 1979)
Наиболее частыми причинами развития гипопротеинемип являются недостаточное поступление белков в организм с пищей (белковое голодание), значительные потери белка и угнетение процессов биосинтеза белков крови.
Недостаточное поступление белков в организм наблюдается при нарушениях деятельности желудочно-кишечного тракта (сужение пищевода, пилороспазм и пилоростеноз, опухоли, воспалительные процессы желудочно-кишечного тракта и др.), малом содержании белка в рационе или несбалансированном аминокислотном составе и др
К потерям белка организмом ведут заболевания почек, протекающие с протеинурией, острые и хронические кровотечения, обширные экссудаты и выпоты в серозные полости, ожоги и др.
Гипопротеинемия, связанная с понижением биосинтеза белка в печени, встречается при хронических гепатитах, интоксикациях, циррозах, длительных нагноительных процессах, злокачественных образованиях и др.
Гиперпротеинемия-явление сравнительно редкое. Наблюдается при эксикозах, несахарном диабете, непроходимости кишечника, генерализованном перитоните, миеломной болезни (стойкая до 120 г/л).
Методы определения белковых фракций в сыворотке крови. Исследование количественных взаимоотношении между отдельными белковыми фракциями имеет важное диагностическое значение, так как позволяет дифференцировать отдельные виды гипо- и гиперпротеинемии, а также ряд заболеваний, не сопровождающихся изменением содержания общего белка.
Для фракционирования белков плазмы используются высаливание нейтральными солями, электрофоретическое фракционирование, иммунологические и седиментационные методы, преципитирование этиловым спиртом при низкой температуре, хроматография, гельфильтрация. Наиболее часто из них применяются электрофоретические методы, основанные на различной скорости передвижения белков в электрическом поле в зависимости от их электрического заряда и других физических и химических свойств.
Широкое распространение получили методы электрофореза на бумаге и гелях - агаровом, крахмальном и других, особенно на полиакриламидном геле, с помощью которого можно получить около 30 фракций белка. Чаще стал применяться электрофорез на пленках ацетата целлюлозы. Однако в клинико-диагностических лабораториях используется преимущественно метод электрофореза на бумаге (В. Г. Колб, В. С. Камышников, 1976). В основе этого метода лежит следующий принцип: под влиянием постоянного электрического поля белки сыворотки, обладающие электрическим зарядом, движутся по смоченной буферным раствором бумаге со скоростью, которая зависит от величины заряда и молекулярной массы. Белки сыворотки крови при этом разделяются на пять фракции: альбумины и глобулины а1, а2, в, у.
Нормальное соотношение альбуминов и глобулинов (альбумин-глобулиновый коэффициент) равно примерно 2:1. Процентное соотношение отдельных фракций белков у взрослых и детей в зависимости от возраста представлено в табл. 49. Общее количество белка и белковых фракций в крови изменяется при различных заболеваниях у детей.
У взрослых и детей старшего возраста выделяют следующие типы электрофореграмм: I) острого воспалительного процесса- 2) подострого хронического воспаления- 3) нефротического симптомокомплекса- 4) злокачественных новообразовании- 5) гепатитов- 6) цирроза печени- 7) механической желтухи- 8) у- и р-глобулиновых плазмацитом.
В первом типе отмечается снижение уровня альбуминов и повышение a1, а2-глобулинов, а в более поздних стадиях и у-глобулинов- во втором - умеренное уменьшение фракций альбуминов и выраженное увеличение а2-, у-глобулиновых фракций- в третьем - значительное уменьшение альбуминов, повышение а-глобулинов при умеренном понижении у-глобулинов- в четвертом - снижение альбуминов и значительное увеличение всех глобулиновых фракций- в пятом - умеренное уменьшение альбуминов и увеличение у- и (3-глобулинов- в шестом - снижение альбуминов при сильном увеличении у-глобулиновой фракции, основание которой расширено- в седьмом - уменьшение альбуминов и умеренное увеличение СС2-, Р- и у-глобулинов- в восьмом - общий белок резко повышен, альбумины и большинство глобулинов снижены, в зависимости от вида больше увеличены у- или в-гло- булины.
У грудных детей наблюдается физиологическая недостаточность биосинтеза у-глобулинов. Поэтому при инфекционных заболеваниях у них в- и а2- глобулины повышаются более значительно, чем у детей старшего возраста и взрослых. Постоянное повышение у-глобулинов у детей раннего возраста может свидетельствовать о септическом состоянии.
Белок – это основное азотсодержащее органическое вещество. Один грамм азота содержится в 6,25 грамм белка (азотистый коэффициент), т. е. белок примерно на 16% состоит из азота. Следовательно, исследовав обмен азота в организме, можно оценить состояние белкового обмена. Об интенсивности синтеза белков можно судить по количеству поступившего в организм азота, распад белков можно оценить по количеству выведенного азота с мочой и потом (количество азота, теряемого с потом, незначительно в обычных условиях, поэтому азот пота принято чаще всего не учитывать). Сопоставить синтез и распад белков можно, определив азотистый баланс.
Азотистый баланс – это соотношение количества поступившего в организм и выведенного из него азота. Выделяют следующие виды азотистого баланса - положительный, отрицательный и азотистое равновесие. Положительный азотистый баланс: поступление азота в организм превышает выведение его из организма (ретенция азота в организме). Это свидетельствует о том, что синтез белка превышает его распад. В норме такой вид азотистого баланса встречается при росте организма, во время беременности, реконвалесценции, прибавлении мышечной массы при занятиях спортом. Отрицательный азотистый баланс – поступление азота меньше его выделения из организма. Это свидетельствует о том, что синтез белка меньше его распада. Такой вид азотистого баланса встречается в следующих ситуациях:
1) белковое голодание (поступает недостаточное количество белков в организм или с пищей поступают неполноценные белки. Неполноценный белок не содержит одну или несколько незаменимых аминокислот);
2) нарушение всасывания аминокислот;
3) старение;
4) болезни или состояния, сопровождающиеся выраженным распадом тканей (опухоли, кахексия);
5) снижение синтеза белка из-за ферментопатии.
Азотистое равновесие – поступление и выведение азота одинаковое. Свидетельствует об одинаковой интенсивности синтеза и распада белка (Рагузин А.В., Сетко Н.П., Ширшов О.В., Фатеева Т.А 2001)
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Белки (протеины) – это сложные высокомолекулярные азотсодержащие соединения, состоящие из аминокислот. Набор и последовательность аминокислот в белке характеризуют как его биохимическую специфичность, так и ценность в питании. Из нескольких десятков известных в настоящее время аминокислот в составе пищевых продуктов содержится 20.
Аминокислоты, из которых состоят белки, делят на заменимые и незаменимые.Незаменимые аминокислоты обязательно должны поступать с пищей в необходимых количествах и в определенных соотношениях. Заменимые аминокислоты могут претерпевать в организме взаимопревращения или образовываться из незаменимых в результате различных биохимических превращений (реакции переаминирования, синтез из небелковых соединений с использованием аммиака в качестве источника азота). К незаменимым аминокислотам относятся аргинин, валин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, триптофан, фенилаланин, треонин (причем аргинин и гистидин считаются незаменимыми для детей в возрасте до 3 лет). Заменимые аминокислоты: аланин, аспарагин, аспарагиновая кислота, глицин, глутаминовая кислота, глутамин, серин, цистин, тирозин, пролин.
Белки организма человека выполняют жизненно важные функции: пластическую, энергетическую, каталитическую, регуляторную, защитную, транспортную, рецепторную.
Согласно физиологическим нормам питания, действующим в нашей стране, общее количество белка в рационах питания детей должно составлять удвоенное количество по сравнению с обеспечивающим азотистый баланс или азотистое равновесие, а для взрослого населения -1,5 количество. Для дошкольников - 53- 69 г, для школьников - 77-98 г, для взрослого населения: у женщин - 58-87 г и у мужчин - 65-117 г (в зависимости от их профессиональной деятельности).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Рагузин А.В., Сетко Н.П., Ширшов О.В., Фатеева Т.А. Физиолого – гигиенические аспекты обмена веществ, обмена энергии и рационального питания: Методическое пособие для самостоятельной работы студентов медико-профилактического факультета – Оренбург: Издательский центр ОГАУ, 2001. - 40 с.
2. Физиология человека/Под редакцией Г.И. Косицкого – М.: «Медицина», 1985. – 560 с.
3. Биохимия: Учеб. для вузов / В.П. Комов, В.П. Шведова. – М.: Дрофа, 2004. – 640 с.
4. Руководство к практическим занятиям по гигиене питания: учеб. пособие для вузов/ Сетко Н.П., Сетко А.Г., Фатеева Т.А., Володина Е.А., Тришина С.П., Чистякова Е.С.; под общ. Ред. Н.П. Сетко. – Оренбург: ОрГМА, 2011. – 652 с.
Определения общего белка в сыворотке \плазме\ крови и других биологических жидкостях.
Все известные способы определения концентрации общего белка в сыворотке крови подразделяют на следующие основные группы:
1.Азотометрические, основанные на установлении количества белкового азота - метод Кьельдаля и его модификации.
2.Способы, состоящие в определении плотности сыворотки - неточные, т.к. плотность зависит не только от содержания белков.
3.Весовые - белки сыворотки крови осаждают, высушивают до постоянного веса и взвешивают на аналитических весах. Методы трудоемки и требуют большого количества сыворотки.
4.Рефрактометрические - не совершенны, т.к. часть рефракции обуславливается иными компонентами сыворотки.
5.Колориметрические - наиболее распространенным является биуретовый метод, являющийся унифицированным.
6.Другие методы - нефелометрические, поляриметрические, спектрофотометрические не получили широкого распространения.
Отечественной промышленностью налажен выпуск наборов для исследования концентрации общего белка в сыворотке крови по биуретовой реакции. На этом же принципе основано измерение уровня общего белка в биологических жидкостях с помощью реактивов, поставляемых различными фирмами.
Определение общего белка в сыворотке крови по биуретовой реакции.
Реактивы.
1.0,9% раствор хлористого натрия /0,9 г хлористого натрия на 100 мл дистиллированной воды/.
2.0,2Н раствор едкого натрия, свободного от углекислого газа /20 мл 1Н едкого натрия доводят до 100 мл прокипяченной дистиллированной водой/.
3.Биуретовый реактив: 4,5г сегнетовой соли растворяют в 40 мл 0,2Н раствора едкого натрия, затем прибавляют 1,5 г сернокислой меди и 0,5 г едкого натра. Хранят в посуде из темного стекла, раствор стоек.
4.0,5% раствор йодистого калия в 0,2Н растворе едкого натрия.
5.Рабочий раствор биуретового реактива: 20 мл биуретового реактива смешивают с 80 мл раствора йодистого калия. Раствор стоек.
6.Стандартный раствор альбумина из человеческой или бычьей сыворотки: 10% раствор альбумина в 0,9% растворе хлористого натрия /1 мл раствора содержит 0,1 г белка - 100г/л/.
Принцип метода.
Белки реагируют в щелочной среде с сернокислой медью с образованием соединений, окрашенных в фиолетовый цвет \биуретовая реакция/.
Ход определения: к 5 мл рабочего раствора биуретового реактива прибавляют 0,1 мл сыворотки, смешивают, избегая образования пены. Через 30 мин \ и не позднее часа\ измеряют на ФЭКе в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 540-560 нм \зеленый светофильтр\ против контроля.
Контроль : к 5 мл рабочего раствора биуретового реактива прибавляют 0,1 мл 0,9% раствора хлористого натрия, далее обрабатывают как опыт.
Расчет ведут по калибровочному графику.
Нормальные величины общего белка - 65-85 г\л.
Построение калибровочного графика.
Реактив: стандартный раствор альбумина 10% в 0,9% растворе хлористого натрия, 1 мл которого содержит 0,1 г белка. Для приготовления реактива можно использовать лиофилизированный альбумин из набора «Билирубин-эталон» фирмы Лахема. В инструкции набора указывается содержание альбумина в мг. Исходя из этого, делаем расчет, сколько необходимо к данному альбумину прилить 0,9% хлористого натрия, чтобы получить в 1 мл раствора 0,1 г белка.
Например: в инструкции набора указано, что лиофилизированный альбумин содержит 160 мг альбумина. Расчет: стандартный 10% раствор содержит 10г или 10 000 мг в 100 мл
в эталоне 160 мг в Х
Х = 1,6 мл, т.е. добавляем в бутылочку, где содержится альбумин 1,6 мл 0,9% хлористого натрия и получаем, что 1 мл этого раствора содержит 0,1 г белка.
После приготовления стандартного раствора готовим из него серию рабочих разведений по таблице:
Вычисление концентрации белка в г\л.
1 мл стандартного 10% р-ра содержит 0,1 г белка
0,04 г белка содержится в 1 мл раствора
Х в 1 000 мл
Из каждого рабочего разведения соответствующей концентрации берут по 0.1 мл в 3-4 пробирки, т.е. каждое определение проводят в 3-4 параллелях и в каждую пробирку прибавляют по 5 мл биуретового реактива. Через 30-60 мин колориметрируют на ФЭКе против контроля. Получаем на каждую концентрацию 3-4 показания оптической плотности. Находим из них среднее арифметическое, предварительно отбросив резко отклоняющиеся показания.
Строим калибровочный график: по оси абсцисс откладываем концентрацию белка в г\л, т.е. 40-60-80-100г\л; а по оси ординат показания оптических плотностей, полученных на ФЭКе \среднее арифметическое/.
Калибровочная кривая должна иметь вид примой, проведенной через 3 точки. Данную кривую проверяют на сыворотках доноров \не менее 3-4 определений\. При получении нормальных показаний белка, т.е. в пределах нормы; построенную калибровочную кривую используют в работе.
Примечание.
1.Калибровочную кривую необходимо строить не менее 1 раза в год, а также каждый раз после ремонта и на вновь полученном фотоэлектроколориметре.
2.Линейная зависимость между оптической плотностью и концентрацией сохраняется до Д=0,5. Если в сыворотке содержится большее количество белка, то сыворотку разводят хлористым натрием вдвое.
Определение мочевины в крови и моче.
Мочевина является основным азотсодержащим продуктом катаболизма белков.
При распаде белков накапливается аммиак – токсичное вещество. Основным путем обезвреживания аммиака является синтез мочевины в печени. Концентрация мочевины в крови зависит от скорости ее образования в печени и удаления из организма через почки с мочой.
У большинства пациентов скорость образования мочевины отражает скорость утилизации и распада клеточного белка.
При тяжелой патологии печени способность гепатоцитов синтезировать мочевину нарушается, аммиак накапливается, а содержание мочевины в крови снижается.
Выведение образовавшейся мочевины происходит с мочой и зависит от выделительной функции почек.
Определение мочевины проводится следующими методами:
1. Химический метод по цветной реакции с диацетилмонооксимом.
2. Ферментативный метод (уреазный)
3. Метод «сухой химии».
Определение мочевины по реакции с диацетилмонооксимом.
Реактивы.
1.Диацетилмонооксим и тиосемикарбазид или реагент в таблетках.
2.Эталонный или стандартный раствор, содержащий в 100 мл 100 мг мочевины или в 1 мл - 1 мг.
Приготовление растворов.
Раствор реагента: 1 таблетку растворить при нагревании в мерной колбе на 50 мл в 30 мл дистиллированной воды. После охлаждения довести объем до отметки. Раствор устойчив несколько недель.
Раствор серной кислоты: в мерную колбу на 250 мл вносят 150 мл дистиллированной воды и 25 мл 96% серной кислоты ЧДА. Нагревают после охлаждения доводят объем до метки. Раствор устойчив.
Рабочий раствор реагента и серной кислоты готовится перед реакцией в соотношении 1:1 (см. схему определения).
Принцип метода.
Мочевина образует с диацетилмонооксимом при наличии тиосемикарбазида и солей железа в сильно кислой среде комплекс красного цвета, интенсивность окраски пропорциональна концентрации мочевины.
Ход определения.
Реактивы Опыт Контроль Стандарт
1.сыворотка 0,02 - -
2.рабочий раствор
а\раствор реагента 2,0 2,0 2,0
б\раствор серной
кислоты 2,0 2,0 2,0
3.стандартный р-р
мочевины - - 0,02
Выдержать 10 минут в кипящей водяной бане. Охладить 2-3 минуты в струе холодной воды. Колориметрировать не позднее, чем через 15 минут: светофильтр зеленый \при длине волны 490-540\, кювета на 1 см, против контроля.
Расчет : До
Х= -------- * С ст в ммоль\л, где
До - оптическая плотность опыта;
Дст - оптическая плотность стандартного раствора мочевины или эталона;
С ст - концентрация мочевины в стандартном растворе;
Х - концентрация мочевины в пробе сыворотки.
Для пересчета мг % в ммоль\л используется коэффициент – 0,1665.
Нормальные величины мочевины в сыворотке крови - 2,5 -8,3 ммоль\л.
Примечания.
1. Выше приведенный ход определения можно модифицировать, увеличив объемы всех отмериваемых растворов в 2-3 раза, в зависимости от объема кювет.
3. Перерасчет показателей мочевины в азот мочевины можно сделать умножением на фактор 0,466.
4. Тиосемикарбазид является ядовитым реактивом. При работе с ним необходимо соблюдать правила работы с ядовитыми веществами.
Методы исследования белкового обмена: Электрофоретический – основан на разделении белков в постоянном электрическом поле в зависимости от величины белковой молекулы. Ультрацентрифугирование – основано на различной скорости седиментации отдельных белков в зависимости от их молекулярной массы. Хроматографические: - Ионнообменная хроматография основана на различной способности отдельных белков к обмену с ионами ионнообменных смол, - Хроматография на молекулярных ситах (гельфильтрация) – на сефадексах – белки разделяются в зависимости от величины молекулы, - Аффинная хроматография – белки делятся на индивидуальные в зависимости от сродства к аффинату (наполнителю колонок).
Высаливание – основано на удалении водной оболочки различными концентрациями солей щелочных и щелочно-земельных металлов и иона аммония. Это старый метод разделения белков. Использование цветных реакций – например биуретовая на общий белок, ксантопротеиновая на циклические аминокислоты,интенсивность окраски измеряют колориметрически. Иммунологические методы – используют для количественного определения индивидуальных белков. При взаимодействии со специфической антисывороткой образуется мутный раствор, интенсивность помутнения измеряют колориметрически.
Подготовка обследуемых: Забор крови делают утром с 8 до 10 часов утра. В экстренных случаях взятие крови осуществляется в любое время дня. Кровь берут натощак, после 8-12-часового голодания. Воздержание от приема алкогольных напитков не менее 24 часов. Исключается физическое напряжение и эмоциональное возбуждение, для чего дают обследуемому отдохнуть 15 минут.
Получение и хранение биологического материала: Желтушные, гемолизированные, хилезные сыворотка или плазма не пригодны для исследования. Для получения плазмы венозную кровь собирают в чистую, сухую пробирку с антикоагулянтом. Соли ЭДТА, гепарин, гепаринат лития, оксалат натрия, цитраты снижают результаты. Центрифугирование проводят в обычном режиме не позднее 3 часов от забора материала.
Для получения сыворотки крови венозную кровь собирают в чистую, сухую пробирку. Центрифугирование проводят в обычном режиме не позднее 3 часов от забора материала. Для исследования мочи используют утреннюю порцию. Исследование проводят не позднее, чем через 2 часа после взятия пробы.
Условия хранения биологического материала: Биологический материал хранят в хорошо закрытых контейнерах. Цельная кровь не пригодна для хранения, даже в присутствии консервантов. Плазму и сыворотку можно хранить 1 день при комнатной температуре, 7 дней при 4-8 С, от 3 до 6 месяцев при –20 С. В закрытых сосудах белок стабилен в моче 2 дня при комнатной температуре, до 17 дней в холодильнике (4-8 С).
Примечания: уровень общего белка может зависеть от возраста (у детей и пожилых ниже), пола (у мужчин выше), характера питания. Повышение белков в крови вызывают следующие факторы: длительное пребывание в вертикальном положении, стресс, прием алкоголя, некоторые лекарственные препараты (цефотаксим, фуросемид, фенобарбитал, преднизалон, прогестерон). Понижение уровня белков в крови вызывают: травма, курение, беременность, голодание, перерыв в приеме алкоголя, нарушение питания, ожирение, некоторые лекарственные препараты (декстран, ибупрофен, пероральные контрацептивы).
Домашнее задание Пустовалова Л.М. Основы биохимии для медицинских колледжей стр
