Imunobloting (imunoblot) je zelo specifična in zelo občutljiva referenčna metoda, ki potrdi diagnozo pri bolnikih s pozitivnimi ali nedoločenimi rezultati testov, vklj. z uporabo RIGA ali ELISA. Imunobloting je vrsta heterogenega imunskega testa.

Ta metoda odkrivanja protiteles proti posameznim antigenom povzročiteljev temelji na ELISA testu na nitroceluloznih membranah, na katere so naneseni specifični proteini v obliki ločenih trakov, ločenih z gelsko elektroforezo. Če obstajajo protitelesa proti določenim antigenom, se na ustreznem mestu traku pojavi temna črta. Edinstvenost imunoblota je v visoki informativnosti in zanesljivosti dobljenih rezultatov.

Material za študijo je človeški serum ali plazma. Za raziskavo na enem traku je potrebno 1,5-2 ml krvi ali 15-25 µl seruma.

LLC "Laboratorijska diagnostika" uporablja komplete imunoblotinga za odkrivanje protiteles proti patogenom različnih bolezni podjetja "EUROIMMUN" (Nemčija), "MIKROGEN" (Nemčija):

HSV 1 in HSV 2 IgM/IgG(okužba s herpesvirusom)

CMV IgM/IgG(okužba s citomegalovirusom)

Rdečke IgG

TORCH profil IgM(toksoplazmoza, rdečke, citomegalovirus, HSV 1 in HSV 2)

EBV IgMTIgG(okužba z virusom Epstein-Barr)

HCV IgG(virusni hepatitis C)

Obstajata dve vrsti kompletov - western blot in line blot.

Western blot: Kompleti vsebujejo testne membranske trakove z elektroforetično ločenimi nativnimi antigeni ustreznih povzročiteljev okužb, t.j. antigeni so razvrščeni glede na molekulsko maso. Na membrane lahko nanesete tudi 1-2 dodatni liniji s klinično pomembnimi antigeni (Western line blot). Je zanesljiva potrditvena metoda, ki odpravlja lažne pozitivne rezultate in navzkrižne reakcije.

Črtni madež: V tem primeru se na testne lističe v določenem vrstnem redu nanesejo le klinično pomembni antigeni (nativni, sintetični ali rekombinantni). Ta pristop se uporablja pri diferencialni diagnozi več okužb na enem traku.

Njegovo bistvo je v prenosu molekul testirane snovi z enega trdnega nosilca, ki se uporablja za frakcioniranje biopolimerov, na drugega, kjer jih specifično detektiramo z imunokemijsko reakcijo. Sodobna zelo občutljiva metoda je prepoznavanje beljakovin, vključno z virusnimi antigeni. Metoda temelji na kombinaciji gelske elektroforeze in reakcije antigen-protitelo. Visoka stopnja ločljivosti je dosežena zaradi elektroforetske ločitve proteinov, gliko- in lipoproteinov ter največje specifičnosti detekcije imunskih serumov ali monoklonskih protiteles. V optimalnih pogojih lahko imunobloting zazna antigen v količinah, manjših od 1 ng v volumnu testa. Tehnično se imunobloting izvaja v treh korakih:

1) proteine, ki jih je treba analizirati, ločimo v poliakrilamidnem gelu v prisotnosti denaturirnih snovi: natrijev dodecil sulfat ali sečnina, ta postopek se pogosto imenuje SDS-PAGE; ločene beljakovine je mogoče vizualizirati po barvanju in primerjati z referenčnimi vzorci;

2) ločene beljakovine se prenesejo iz gela s prekrivanjem (blotiranjem).
nitrocelulozni filter in pritrjen nanj; v mnogih primerih, vendar
ne vedno se med prenosom ohranijo količinska razmerja beljakovin;

3) filtri so prevlečeni z detekcijskim poli- ali monoklonskim
protitelesa, ki vsebujejo radioizotopsko ali encimsko oznako; Za
detekcija vezanih protiteles, uporablja se tudi antispecialna analiza
označeni serum, z drugimi besedami, v končni fazi, blotiranje
podobno imunskim testom na trdni fazi.

Upoštevati je treba, da so pri tej nastavitvi imunoblotinga proteini v denaturiranem stanju, zato jih protitelesa, specifična za nativni protein, morda ne bodo prepoznala, toda v prisotnosti serumov za vse sestavne peptide, celotno antigensko spekter testiranega proteina se hkrati detektira. Imunobloting se pogosto uporablja pri študijah strukture virusov hepatitisa, zlasti za ugotavljanje antigenskega razmerja med posameznimi sevi. Visoka ločljivost imunoblotinga omogoča doseganje dobrih rezultatov v diagnostični praksi, ko je potrebno identificirati virus v tkivih ali izločkih bolnika.

Glede na preizkušano snov ločimo DNA, RNA in protein – blotiranje.

Imunokemično detekcijo antigenov lahko izvedemo z uporabo protiteles, konjugiranih z oznako. V zadnjem času se bodisi radioaktivni izotopi bodisi encimi (peroksidaza, alkalna fosfataza, laktamaza itd.) pogosto uporabljajo kot oznake.

Čas difuzijskega blotiranja je 36-48 ur. Toda najhitrejši in najučinkovitejši način za prenos proteinov iz gelov je elektroblotiranje, ki je običajno 1-3 ure, za nekatere proteine ​​z visoko molekulsko maso več kot 12 ur.

Posebna izbira sorbentov za različne modifikacije madežev (nitroceluloza ali ustrezno obdelan papir), izbira pogojev za blokiranje in imunokemijsko odkrivanje antigenov je v celoti odvisna od antigena, njegove količine, metode imunskega testa in ciljev študije.

Sposobnost odkrivanja protiteles proti specifičnim antigenom patogena omogoča oceno pomena teh protiteles (specifičnost za določeno etiološko sredstvo), da se izključi reakcija na navzkrižne antigene. To je tisto, po čemer se imunobloting razlikuje od testa ELISA, kjer se lahko kot antigen uporabijo različne kombinacije antigenskih determinant – tako specifičnih kot nespecifičnih, kar povzroča navzkrižne reakcije z drugimi patogeni. V nasprotnem primeru, ko dobimo pozitiven rezultat ELISA, lahko samo domnevamo, da je rezultat navzkrižne reakcije, v primeru imunoblotinga pa je to dokončno.

Metoda IB je iz več razlogov postala najbolj razširjena kot metoda, primerna za uporabo kot potrditveni test.

Nedvomna prednost metode je možnost testiranja protiteles na šibko ali popolnoma netopne antigene in izključitev stopnje vnosa radioaktivne oznake v antigene.

Občutljivost pri IB presojamo po mejni količini nanesenega antigena na gel, ki ga pri frakcioniranju proteinov imunokemijsko zaznamo po prenosu iz gela v trdno fazo (nitrocelulozo). Celotna občutljivost testa je odvisna od številnih dejavnikov: pogojev za frakcioniranje in imobilizacijo antigena na trdnem nosilcu, ravni ozadja, specifičnosti in afinitete protiteles. Pomembna je vrsta uporabljene oznake in način njenega zaznavanja.

Tako metoda imunoblotinga omogoča identifikacijo con antigena na trdni fazi brez vezave celotnega proteina na specifična serumska protitelesa. Imunobloting in njegove modifikacije se uporabljajo predvsem za tipizacijo bakterijskih in virusnih antigenov in protiteles, predvsem v primeru nezadostne ločljivosti konvencionalnih sistemov, pa tudi pri analizi imunoglobulinov, nukleinskih kislin ali kot potrditveni test v kombinaciji z drugimi metodami.

Velike težave pri interpretaciji rezultatov navzkrižnih reakcij in v primerih začetnih stopenj serokonverzije. V prvi situaciji pri ponovnem pregledu po določenem času protitelesa niso zaznana, v drugem imunoblotu pa se pojavijo novi pasovi, ki kažejo na pojav protiteles proti proteinom ali glikoproteinom HIV, ki označujejo dinamiko odziva imunskega odziva. na virusne antigene.

Gre pravzaprav za zadnjo verifikacijsko metodo v verigi seroloških testov, ki omogoča dokončen sklep o pacientovi HIV-pozitivnosti ali pa jo zavrne. Za nastavitev IB se uporabljajo nitrocelulozni trakovi, na katere se z metodo horizontalne in nato vertikalne imunoforeze vnaprej prenesejo HIV proteini v vrstnem redu naraščanja njihove molekulske mase. Protitelesa testiranih serumov medsebojno delujejo z beljakovinami na določenih območjih traku. Nadaljnji potek reakcije se ne razlikuje od tistega za ELISA, to je, da vključuje obdelavo traku (traku) s konjugatom in substratom kromogena, izpiranje nevezanih komponent in zaustavitev reakcije z destilirano vodo. Predhodna elektroforetska ločitev beljakovin in njihova fiksacija na nitrocelulozi omogoča identifikacijo protiteles proti specifičnim beljakovinam v skladu s prisotnostjo (ali odsotnostjo) obarvanja (sivo-modro) ustreznih območij traku. Imunoblotinga ni mogoče uporabiti za množično presejalno študijo zaradi visokih stroškov in je metoda individualne arbitraže v zadnji fazi serološke študije.

Obstaja dokaj jasna povezava med rezultati študije serumov v IB in ELISA. Dvakrat pozitivni pri testu ELISA (v različnih testnih sistemih) se serume nato pri IB interpretira kot HIV pozitivne v 97-98 % primerov. Serumi, ki so pri testu ELISA pozitivni le v enem od dveh uporabljenih testnih sistemov, se pri IB izkažejo za HIV pozitivne ne pogosteje kot v 4 % primerov. Pri izvajanju potrditvenih študij lahko približno 5% IB daje tako imenovane "nedoločene" rezultate, ki praviloma ustrezajo pozitivnemu ELISA, ne pa RIP. V približno 20 % primerov "nedoločene" IB povzročijo protitelesa proti HIV-1 gag proteinom (p55, p25, p18). Če dobite dvomljive rezultate imunoblotinga, je treba študijo ponoviti po 3 mesecih in, če je rezultat še vedno negotov, po 6 mesecih.

Radioimunska metoda (RIM) (Radioimunološka analiza, RIA) Radioimunotest je metoda za kvantitativno določanje biološko aktivnih snovi (hormonov, encimov, zdravil itd.) v bioloških tekočinah, ki temelji na kompetitivni vezavi želenih stabilnih in podobnih snovi, označenih z radionuklidom s specifičnimi vezavnimi sistemi. Slednja so največkrat specifična protitelesa. Ker je označeni antigen dodan v določeni količini, je mogoče določiti del snovi, ki se je vezal na protitelesa, in del, ki ostane nevezan zaradi kompeticije z zaznanim neoznačenim antigenom. Študija se izvaja in vitro. Za R. in. proizvajajo standardne komplete reagentov, od katerih je vsak zasnovan za določanje koncentracije katere koli snovi. Študija poteka v več fazah: biološki material se zmeša z reagenti, mešanica se inkubira več ur, loči se prosta in vezana radioaktivna snov, izvede se radiometrija vzorcev in izračunajo rezultati. Metoda je zelo občutljiva, uporablja se lahko pri diagnostiki bolezni srčno-žilnega, endokrinega in drugih sistemov, za ugotavljanje vzrokov neplodnosti, motenj v razvoju ploda, v onkologiji za določanje tumorskih markerjev in spremljanje učinkovitosti zdravljenja, za ugotavljanje koncentracija imunoglobulinov, encimov in zdravilnih učinkovin. V nekaterih primerih se študije izvajajo na podlagi funkcionalnih obremenitvenih testov (na primer določanje vsebnosti insulina v krvnem serumu na podlagi testa tolerance za glukozo) ali v dinamiki (na primer določanje spolnih hormonov v krvi med menstrualni ciklus).

S pomočjo komercialnega kompleta ABBOTT - Austria II-I 125 je možno zaznati HBsAg v koncentracijah do 0,1 ng/ml. Prednosti metode so možnost standardizacije in avtomatizacije metode s pridobivanjem odgovorov v numeričnem smislu. Slabost metode so omejitve, ki jih določa način delovanja z radioaktivnimi snovmi, in relativno kratek rok trajanja diagnostičnega kompleta, ki je povezan z razpadom radioaktivne oznake.

Diagnostični kompleti za odkrivanje različnih antigenov virusov hepatitisa A, B in D ter protiteles proti njim proizvajajo Isotope (Taškent) in nekatera tuja podjetja (na primer ABBOTT). Polistirenske kroglice (ABBOTT) ali epruvete (Isotop) se uporabljajo kot trdna faza. Najpogosteje uporabljen izotop za označevanje protiteles ali antigenov je I 125, ki ima razpolovno dobo 60 dni in visoko specifično radioaktivnost. Merjenje radioaktivne oznake, to je sevanja, se izvaja na posebnih števcih - radiospektrometrih. Štetje radioaktivnih impulzov v kontrolnih in testnih vzorcih se izvaja ob istem določenem času, običajno v 1 minuti. Pri analizi rezultatov reakcije je treba upoštevati prisotnost radioaktivnega ozadja, ki lahko vpliva na končni rezultat reakcije. Vzroki za povečano ozadje so lahko: kontaminacija posode ali gnezda z vzorcem; nepravilna nastavitev naprave; prisotnost vira močnega sevanja v bližini naprave.

Za potrditev pozitivnega rezultata, pridobljenega pri začetnem presejanju vzorcev, se priporoča ponovni RIA ali alternativni test. Če se odkrije HBsAg, je treba opraviti potrditveni test.

Tabela 1. Razvrstitev cepiv

Bibliografija:

Obvezno:

1. Khaitov R.M., Ignatieva G.A., Sidorovich I.G. Imunologija: Učbenik.-M .: Medicina, 2000.- 432 str.: Ill. (Študijska literatura za študente medicine).

2. Kovalchuk L. V. in drugi Imunologija: delavnica: učbenik. dodatek - M.: GEOTAR-Media, 2012. - 176 str.

3. Pozdeev O.K. Medicinska mikrobiologija / ur. akad. RAMS V.I. Pokrovsky - M.: GEOTAR-Media, 2001. - 768 str.

4. Borisov L.B. Vodnik za praktične vaje iz mikrobiologije. M. 1997

Dodatno:

1. Genkel P.A., Mikrobiologija z osnovami virologije. M., 1974

2. Korotyaev A.I., Babichev S.A. Medicinska mikrobiologija, imunologija in virologija: učbenik za med. univerze.- 3. izdaja, popr. in dodatno - Sankt Peterburg, SpetsLit. 2002. - 591 str.

3. Borisov L.B., Smirnova A.M., Medicinska mikrobiologija, virologija, imunologija, M., Medicina. 1994

4. Timakov V.D., Levashov V.S., Borisov L.B. Mikrobiologija. M. 1983

Imunski blot (imunoblot, Western blot, Western blot)- združuje encimski imunosorbentni test (ELISA) s predhodnim elektroforetskim prenosom virusnih antigenov na nitrocelulozni trak (trak).

V tem lepem znanstvenem imenu se "blot" najverjetneje prevede kot "blot", "western" kot "western" pa odraža smer porazdelitve te "blot" na papirju od leve proti desni, to je na geografskem zemljevidu, to ustreza smeri od zahoda proti vzhodu. ". Bistvo metode "imunskega blota" je, da se imunoencimska reakcija ne izvaja z mešanico antigenov, temveč z antigeni HIV, ki so predhodno razdeljeni z imunoforezo v frakcije, ki se nahajajo glede na molekulsko maso na površini nitrocelulozne membrane. Posledično so glavni proteini HIV, nosilci antigenskih determinant, razporejeni po površini v obliki ločenih pasov, ki se pojavijo med encimskim imunskim testom.

Imunoblot vključuje več stopenj:

Priprava traku. Virus imunske pomanjkljivosti (HIV), ki je predhodno prečiščen in uničen na sestavne dele, podvržemo elektroforezi, medtem ko antigene, ki sestavljajo HIV, ločimo po molekulski masi. Nato se z blotiranjem (analogno iztiskanju odvečnega črnila na "blotterju") antigeni prenesejo na trak iz nitroceluloze, ki zdaj vsebuje spekter antigenskih trakov, značilnih za HIV, očem nevidnih.

Vzorčna študija. Testni material (serum, krvna plazma bolnika itd.) se nanese na nitrocelulozni trak, in če so v vzorcu specifična protitelesa, se vežejo na strogo ustrezne (komplementarne) antigenske trakove. Kot rezultat kasnejših manipulacij se rezultat te interakcije vizualizira – postane viden.

Razlaga rezultata. Prisotnost pasov na določenih območjih nitrocelulozne plošče potrjuje prisotnost protiteles proti strogo določenim antigenom HIV v preučevanem serumu.

Proga A - Pozitivna kontrola

Proga B - Šibka pozitivna kontrola

Proga C – negativna kontrola

Trak D - pozitiven vzorec (odkrita protitelesa proti HIV-1)

Trenutno je imunski blot (imunoblot) glavna metoda za potrditev prisotnosti virusno specifičnih protiteles v testnem serumu. V nekaterih primerih okužbe s HIV se pred serokonverzijo specifična protitelesa učinkoviteje odkrijejo z imunoblotingom kot z ELISA. Študija imunskega blotinga je pokazala, da so protitelesa proti gp 41 najpogosteje odkrita v serumih bolnikov z aidsom, odkrivanje p24 pri osebah, pregledanih v profilaktične namene, pa zahteva dodatne študije na prisotnost okužbe s HIV. Imunoblot testni sistemi, ki temeljijo na gensko spremenjenih rekombinantnih proteinih, so se izkazali za bolj specifične od običajnih sistemov, ki temeljijo na prečiščenem virusnem lizatu. Pri uporabi rekombinantnega antigena se ne oblikuje razpršen, ampak jasno definiran ozek pas antigena, ki je lahko dostopen za obračunavanje in vrednotenje.

Serum oseb, okuženih s HIV-1, odkrije protitelesa proti naslednjim glavnim proteinom in glikoproteinom - proteini strukturne ovojnice (env) - gp160, gp120, gp41; jedra (gag) - p17, p24, p55, kot tudi virusni encimi (pol) - p31, p51, p66. Za HIV-2 so značilna protitelesa proti env - gp140, gp105, gp36; gag - p16, p25, p56; pol-p68.

Med laboratorijskimi metodami, ki so potrebne za ugotavljanje specifičnosti reakcije, ima največjo prepoznavnost dokazovanje protiteles proti ovojnim proteinom HIV-1 - gp41, gp120, gp160 in HIV-2 - gp36, gp105, gp140.

WHO meni, da so serumi pozitivni, če z imunoblotingom odkrijemo protitelesa proti katerim koli glikoproteinom HIV. V skladu s temi priporočili, če pride do reakcije samo z enim od proteinov ovojnice (rp 160, rp 120, rp 41) v kombinaciji ali brez reakcije z drugimi proteini, se rezultat šteje za dvomljiv in se priporoča drugi test z uporabo kompleta iz druge serije ali drugega podjetja. Če po tem rezultat ostane dvomljiv, je priporočljivo opazovanje 6 mesecev (raziskava po 3 mesecih).

Prisotnost pozitivne reakcije z antigenom p24 lahko kaže na obdobje serokonverzije, saj se protitelesa proti temu proteinu včasih pojavijo najprej. V tem primeru je glede na klinične in epidemiološke podatke priporočljivo ponoviti študijo z vzorcem seruma, odvzetim vsaj 2 tedna pozneje, in to je ravno v primeru, ko so pri okužbi s HIV potrebni parni serumi.

Pozitivne reakcije z beljakovinami gag in pol brez prisotnosti reakcije z beljakovinami env lahko odražajo stopnjo zgodnje serokonverzije in lahko kažejo tudi na okužbo s HIV-2 ali nespecifično reakcijo. Osebe s takšnimi rezultati po testiranju na HIV-2 se ponovno pregledajo po 3 mesecih (v 6 mesecih).

Opis

Metoda določanja Imunoblot.

Material v študiji Serum

Možnost obiska na domu

Antinuklearna protitelesa so družina avtoprotiteles, ki se vežejo na ribonukleinske kisline in z njimi povezane beljakovine. Pojavijo se pri več kot 90 % bolnikov z difuznimi boleznimi vezivnega tkiva, pogosto pa jih opažamo tudi pri avtoimunskih boleznih jeter in številnih drugih stanjih. Do danes je bilo opisanih približno 200 vrst te družine avtoprotiteles, vendar vseh ni mogoče uporabiti v klinični praksi.

Imunoblot antinuklearnih protiteles omogoča istočasno preučevanje 15 glavnih vrst antinuklearnih protiteles v enem testu, kar zagotavlja diferencialno diagnozo glavnih sistemskih revmatičnih bolezni. Vsako vrsto avtoprotiteles, odkritih z imunoblotom, običajno opazimo pri bolnikih z značilno klinično sliko, zato spekter avtoprotiteles omogoča ne le diagnosticiranje bolezni, temveč tudi ugotavljanje tveganja za razvoj določenih kliničnih manifestacij.

Imunoblot antinuklearnih protiteles je priporočljivo uporabiti v drugi fazi serološkega pregleda s pozitivnim rezultatom drugih testov, ki kažejo na prisotnost antinuklearnih protiteles v serumu osebe. Ti testi vključujejo določanje antinuklearnih protiteles (ELISA presejanje), odkrivanje antinuklearnega faktorja (ANF) na celicah Hep2 (), antinuklearnih protiteles in protiteles proti jedrnemu antigenu, ki ga je mogoče ekstrahirati (ENA,).

Imunoblot metoda protinuklearnih protiteles v diagnostiki sistemskih revmatskih bolezni ima visoko klinično specifičnost. Toda specifičnosti protinuklearnih protiteles, tudi pri visokih titrih ANF (), ni vedno mogoče ugotoviti, saj številni antigeni protijedrnih protiteles še vedno ostajajo neopredeljeni. Negativen rezultat imunoblota v tem primeru ne izključuje diagnoze sistemskih revmatskih bolezni. Številna protinuklearna protitelesa je mogoče odkriti z uporabo imunoblota - plošče avtoprotiteles, specifičnih za miozitis () in imunoblota - plošče avtoprotiteles pri sklerodermi ().

Literatura

1. Lapin S.V. Totoljan A.A. Imunološka laboratorijska diagnostika avtoimunskih bolezni / Založba "Chelovek", St. Petersburg - 2010. 272 ​​​​str.
2. Nasonov E.L., Aleksandrova E.N. Sodobni standardi laboratorijske diagnostike revmatskih bolezni. Klinične smernice / BHM, M - 2006.
3. Conrad K, Schlosler W., Hiepe F., Fitzler M.J. Avtoprotitelesa pri organsko specifičnih avtoimunskih boleznih: diagnostična referenca/ PABST, Dresden - 2011. 300 str.
4. Conrad K, Schlosler W., Hiepe F., Fitzler M.J. Avtoprotitelesa pri sistemskih avtoimunskih boleznih: diagnostična referenca/PABST, Dresden - 2007. 300 str.
5. Gershvin ME, Meroni PL, Shoenfeld Y. Avtoprotitelesa 2. izdaja/ Elsevier Science - 2006. 862 str.
6. Shoenfeld Y., Cervera R, Gershvin ME Diagnostični kriteriji pri avtoimunskih boleznih / Humana Press - 2008. 598 str.
7. Navodila za komplet reagentov.

Priprava

Priporočljivo je vzdržati 4 ure po zadnjem obroku, ni obveznih zahtev.

Indikacije za imenovanje

Test je indiciran za diagnozo in diferencialno diagnozo naslednjih stanj:

• sistemski eritematozni lupus;
• subakutni kožni lupus in druge vrste kožnega lupusa;
• mešana bolezen vezivnega tkiva;
• Sjögrenov sindrom in pridružene bolezni;
• difuzna in lokalizirana skleroderma, CREST sindrom;
• vnetne miopatije (polimiozitis in dermatomiozitis);
• juvenilni kronični artritis;
• avtoimunski hepatitis;
• primarna biliarna ciroza in sklerozirajoči holangitis;
• uporaba tega testa je indicirana za odkrivanje visokih titrov antinuklearnega faktorja, antinuklearnih protiteles, protiteles proti jedrnemu antigenu, ki ga je mogoče ekstrahirati, protiteles proti DNA, protiteles proti nukleosomom in antifosfolipidnih protiteles.

Interpretacija rezultatov

Razlaga rezultatov preiskave vsebuje informacije za lečečega zdravnika in ni diagnoza. Podatki v tem razdelku se ne smejo uporabljati za samodiagnozo ali samozdravljenje. Natančno diagnozo postavi zdravnik na podlagi rezultatov te preiskave in potrebnih informacij iz drugih virov: zgodovine, rezultatov drugih preiskav itd.

Merske enote: kvalitativni test, rezultat je predstavljen v obliki "zaznano" ali "ni najdeno".

Ko je zaznan trak, ki označuje prisotnost katere koli vrste protiteles, se intenzivnost barve pasu dodatno opiše s številom plusov ("križcev") za vsako od identificiranih vrst protiteles. Povečanje stopnje pozitivnosti posredno odraža vsebnost in afiniteto avtoprotiteles.

Referenčne vrednosti: protitelesa proti Sm, RNP/Sm, SS-A (60 kDa), SS-A (52 kDa), SS-B, Scl-70, PM-Scl, PCNA, CENP-B, dsDNA, Histon, Nukleosom , Rib P, AMA-M2, Jo-1 niso bili najdeni.

Rezultat določanja avtoprotiteles je predstavljen v "križcih" za vsak pripadajoči antigen. Povečanje stopnje seropozitivnosti posredno odraža vsebnost in afiniteto avtoprotiteles. Možnosti ocene seropozitivnosti so navedene spodaj:

1. Protiteles niso našli.
2. +/- - mejni rezultat;
3. + - nizka vsebnost avtoprotiteles proti specifičnemu antigenu;
4. ++ je povprečna vsebnost avtoprotiteles proti specifičnemu antigenu;
5. +++ - visoka vsebnost avtoprotiteles proti specifičnemu antigenu.

Glavne bolezni, povezane z odkrivanjem protinuklearnih protiteles:

Antigen	Pomen
Sm (Smith)	Specifični marker za sistemski eritematozni lupus (vključen v 10. kriterij za SLE Ameriškega koledža za revmatologijo, ACR)
SS-A (Ro52)	Opazimo ga pri različnih avtoimunskih boleznih, pogosteje pri sistemskem eritematoznem lupusu in njegovih kožnih oblikah, sistemskih revmatičnih boleznih, revmatoidnem artritisu, avtoimunskih boleznih jeter itd.
SS-A (Ro60)	Sistemski eritematozni lupus, kožne oblike eritematoznega lupusa, fotosenzitivnost pri sistemskem eritematoznem lupusu, visoko tveganje za prirojeni eritematozni lupus in srčne bolezni ploda. Glavni serološki indikator pri Sjögrenovem sindromu. Pogosto ga opazimo skupaj s protitelesi proti antigenu SS-A (Ro52).
SS-B	Sjögrenov sindrom, sistemski eritematozni lupus.
PCNA	Sistemski eritematozni lupus, tveganje za lupusni nefritis.
Ribosomi (Ribo P)	Sistemski eritematozni lupus, nevarnost poškodbe centralnega živčnega sistema.
Nukleosomi	Sistemski eritematozni lupus, visoko tveganje za lupusni glomerulonefritis.
dvoverižna DNK	Specifični marker sistemskega eritematoznega lupusa (vključen v 10. kriterij SLE ACR), visoko tveganje za lupusni nefritis.
snRNP/Sm	Mešana bolezen vezivnega tkiva, sistemski eritematozni lupus z majhnim tveganjem za okvaro ledvic, skleroderma.
Histoni	Sistemski eritematozni lupus, z zdravili povzročen lupus, skleroderma.
Scl-70	Sistemska skleroza z difuznimi lezijami kože in notranjih organov.
PM-Scl	Skleroderma s polimiozitisom.
CENP-B	Sindrom CREST s sklerodaktilijo, teleangiektazijami, podkožnimi kalcifikacijami, Raynaudov sindrom, ezofagitis.
Jo-1	Polimiozitis v obliki antisintetaznega sindroma.
AMA-M2	Primarna biliarna ciroza, Sjögrenov sindrom.

V Rusiji je trenutno standardni postopek laboratorijske diagnoze okužbe s HIV odkrivanje protiteles proti HIVz uporabo encimskega imunskega testa sledi potrditev njihove specifičnosti v reakciji imunski bloting.

Protitelesa proti HIV se pojavijo pri 90-95% okuženih v 3 mesecih po okužbi, pri 5-9% - po 6 mesecih od trenutka okužbe in pri 0,5-1% - pozneje. Najzgodnejši čas za odkrivanje protiteles je 2 tedna od trenutka okužbe.

Odkrivanje protiteles proti HIV vključuje 2 koraka. Na prvi stopnji Odkrivanje celotnega spektra protiteles proti antigenom HIV se izvaja z različnimi testi: encimski imunski test, aglutinacija, kombinirani, glavnik, membranski filter ali membransko difuzni. Na drugi stopnji imunobloting uporabljamo za določanje protiteles proti posameznim proteinom virusa. Pri delu je dovoljeno uporabljati samo testne sisteme, ki imajo dovoljenje za uporabo Ministrstva za zdravje Ruske federacije. Diagnostične postopke je treba izvajati le v skladu z odobrenimi navodili za uporabo ustreznih testov.

Vzorčenje krvi iz kubitalne vene v čisto, suho epruveto v količini 3-5 ml. Novorojenčkom se lahko odvzame popkovnična kri. Pridobljenega materiala (polne krvi) ni priporočljivo hraniti več kot 12 ur pri sobni temperaturi in več kot 1 dan v hladilniku pri 4-8°C. Prihajajoča hemoliza lahko vpliva na rezultate analize. Serum ločimo s centrifugiranjem ali s sledenjem krvi po steni epruvete s Pasteurjevo pipeto ali stekleno paličico. Izločen serum prenesemo v čisto (po možnosti sterilno) epruveto, vialo ali plastično posodo in ga v takšni obliki hranimo do 7 dni pri temperaturi 4-8°C. Pri delu morate upoštevati varnostna pravila, navedena v "Navodilih o protiepidemičnem režimu v diagnostičnih laboratorijih za aids" št. 42-28 / 38-90 z dne 5. julija 1990.

Določanje skupnih protiteles proti HIV.

Po prejemu prvega pozitivnega rezultata se analiza izvede še 2-krat (z istim serumom in v istem testnem sistemu). Če je bil dosežen vsaj en pozitiven rezultat (dva pozitivna rezultata od treh ELISA testov), ​​se serum pošlje v referenčni laboratorij.

V referenčnem laboratoriju primarno pozitivne serume (tj. tiste, ki so dali dva pozitivna rezultata v prvem testnem sistemu) ponovno pregledamo v ELISA v drugem (drugem) testnem sistemu, izbranem za potrditev.

Po prejemu pozitivnega rezultata analize v drugem testnem sistemu je treba serum pregledati v IS.

Če je v drugem testnem sistemu negativen rezultat, se serum ponovno pregleda v tretjem testnem sistemu.

Če je rezultat testa negativen v drugem in tretjem testnem sistemu, se izda sklep o odsotnosti protiteles proti HIV.

Ko dobimo pozitiven rezultat v tretjem testnem sistemu, se serum pošlje tudi v analizo pri imunskem blotingu.

imunski bloting.

Načelo metode je odkrivanje protiteles proti določenim proteinom virusa, imobiliziranim na nitrocelulozni membrani. Proteini ovojnice (env) HIV-1 se običajno imenujejo glikoproteini ("gp" ali "gp"), z molekulsko maso, izraženo v kilodaltonih (cd): 160 kd, 120 kd, 41 kd. Pri HIV-2 imajo glikoproteini težo 140 kd, 105 kd, 36 kd. Jedrni proteini (gag) (običajno imenovani proteini - "p" ali "r") v HIV-1 imajo molekulsko maso 55 kd, 24 kd, 17 kd, HIV-2 pa -56 kd, 26 kd , 18 kd. Encimi HIV-1 (pol) imajo molekulsko maso 66 kd, 51 kd, 31 kd, HIV-2-68 kd.

Rezultati imunoblotinga se razlagajo kot pozitivni, nedoločeni in negativni.

pozitivno(pozitivni) se štejejo vzorci, v katerih so dokazana protitelesa proti 2 ali 3 glikoproteinom HIV.

negativno(negativni) so serumi, ki ne zaznajo protiteles proti nobenemu od antigenov (proteinov) HIV.

Upoštevani so vzorci, ki zaznajo protitelesa proti enemu glikoproteinu HIV in/ali kateremu koli proteinu HIV. dvomljivo(nedefinirano ali nerazumljivo).

Ko dobimo nedoločen rezultat s protitelesi proti jedrnim proteinom (gag) v imunskem blotu z antigeni HIV-1, opravimo test z antigeni HIV-2.

Po prejemu pozitivnih rezultatov imunskega blotinga se sklepa o prisotnosti protiteles proti HIV v testnem materialu.

Po prejemu negativnega izvida testa IB izda sklep, da protiteles proti HIV ni.

Po prejemu nedoločenega rezultata (če antigen p24 ni bil odkrit) se po 3 mesecih izvedejo ponovni testi za protitelesa proti HIV,

in ob ohranjanju nedoločenih rezultatov po nadaljnjih 3 mesecih. Če je bil odkrit antigen p24, se drugi pregled opravi 2 tedna po prejemu prvega nedoločenega rezultata.

Če se 6 mesecev po prvem pregledu ponovno dobijo nedoločljivi rezultati in bolnik nima dejavnikov tveganja za okužbo in kliničnih simptomov okužbe s HIV, se rezultat šteje za lažno pozitiven. (Če obstajajo epidemiološke in klinične indikacije, se serološke študije ponovijo, kot je predpisano).

Imunski bloting z uporabo rekombinantnih za virus specifičnih polipeptidov "HIV blot" se razlikuje po tem, da ne uporablja samih virusnih proteinov, temveč rekombinantne polipeptide - analoge HIV antigenov ("Env1", "Gag1", "Poll", "Env2"). Rekombinantni polipeptid Env1 zaznava protitelesa neposredno proti HIV-1 gp120 in gp41, polipeptid Gag1 proti antigenoma p17 in p24, polipeptid Po11 proti antigenu p51, polipeptid Env2 proti antigenoma HIV-2 gp110 in gp38. Serum velja za pozitivnega, če reagira z Env1 ali Env2 ali obema Env (dvojna okužba s HIV tipa 1 in 2). Reakcija samo s Poll in Gag se šteje za nedoločen rezultat, v tem primeru se spremljanje izvaja podobno kot pri nedoločenih rezultatih klasičnega imunoblota z uporabo HIV lizata.

Posebnosti serološke diagnoze okužbe s HIV pri otrocih, rojenih od mater, okuženih s HIV, so, da imajo tako okuženi kot neokuženi otroci v prvih 6-12 mesecih življenja protitelesa proti HIV materinega izvora, ki lahko nato izginejo. Kriterij, ki kaže na prisotnost okužbe s HIV pri otroku, je odkritje protiteles proti HIV pri starosti 18 mesecev ali več. Odsotnost protiteles proti HIV pri 18-mesečnem otroku, ki ga je rodila mati okužena s HIV, je merilo proti okužbi s HIV.

Po priporočilu SZO se pri diagnostiki okužbe s HIV uporablja imunobloting (western blot) kot dodatna strokovna metoda, ki naj potrdi rezultate testa ELISA. Ta metoda se običajno uporablja za dvojno preverjanje pozitivnega rezultata ELISA, saj velja za bolj občutljivo in specifično, čeprav je bolj zapletena in dražja.

Imunobloting združuje encimski imunski test (ELISA) s predhodno elektroforetično ločitvijo virusnih proteinov v gelu in njihovim prenosom na nitrocelulozno membrano. Imunoblot postopek je sestavljen iz več korakov (slika 27). HIV, predhodno prečiščen in uničen na sestavne dele, je izpostavljen elektroforezi, medtem ko so vsi antigeni, ki sestavljajo virus, ločeni po molekulski masi. Nato se z blotiranjem antigeni prenesejo iz gela na trak iz nitroceluloze ali najlonski filter, ki zdaj vsebuje očesu neviden spekter proteinov, ki je značilen za HIV. Nato se na trak nanese testni material (serum, plazma bolnika itd.) in če so v vzorcu specifična protitelesa, se vežejo na trakove antigenskih proteinov, ki jim strogo ustrezajo. Kot rezultat kasnejših manipulacij (kot je ELISA) je rezultat te interakcije vizualiziran – viden. Prisotnost trakov na določenih območjih traku potrjuje prisotnost protiteles proti strogo določenim antigenom HIV v preučevanem serumu.

Imunobloting se najpogosteje uporablja za potrditev diagnoze okužbe s HIV. WHO meni, da so serumi pozitivni, če se z imunoblotingom odkrijejo protitelesa proti katerim koli dvema proteinoma ovojnice HIV. V skladu s temi priporočili, če pride do reakcije samo z enim od ovojnih proteinov (