Imunoblotas (imunoblotas) yra labai specifinis ir labai jautrus pamatinis metodas, patvirtinantis diagnozę pacientams, kuriems gauti teigiami arba neapibrėžti tyrimo rezultatai, įskaitant. naudojant RIGA arba ELISA. Imunoblotingas yra heterogeninio imuninio tyrimo tipas.

Šis antikūnų prieš atskirus patogenų antigenus aptikimo metodas pagrįstas ELISA nitroceliuliozės membranose, ant kurių atskirų juostų pavidalu uždedami specifiniai baltymai, atskirti gelio elektroforeze. Jei yra antikūnų prieš tam tikrus antigenus, atitinkamoje juostelės vietoje atsiranda tamsi linija. Imunobloto išskirtinumas slypi dideliu informacijos kiekiu ir gautų rezultatų patikimumu.

Tyrimo medžiaga yra žmogaus serumas arba plazma. Vienos juostelės tyrimui reikia 1,5-2 ml kraujo arba 15-25 µl serumo.

UAB „Laboratorinė diagnostika“ naudoja imunoblotavimo rinkinius, skirtus įmonių „EUROIMMUN“ (Vokietija), „MIKROGEN“ (Vokietija) įvairių ligų sukėlėjų antikūnams nustatyti:

HSV 1 ir HSV 2 IgM/IgG(herpesvirusinė infekcija)

CMV IgM/IgG(citomegalovirusinė infekcija)

Raudonukės IgG

TORCH profilis IgM(Toksoplazmozė, raudonukė, citomegalovirusas, HSV 1 ir HSV 2)

EBV IgMTIgG(Epstein-Barr viruso infekcija)

HCV IgG(virusinis hepatitas C)

Yra dviejų tipų rinkiniai - Western blot ir line blot.

Western blot: Rinkiniuose yra bandomosios membranos juostelės su elektroforetiškai atskirtais atitinkamų infekcijų sukėlėjų natyviniais antigenais, t.y. antigenai yra išdėstyti molekulinės masės tvarka. Ant membranų taip pat galima uždėti 1-2 papildomas linijas su kliniškai reikšmingais antigenais (Western line blot). Tai patikimas patvirtinimo metodas, pašalinantis klaidingus teigiamus rezultatus ir kryžmines reakcijas.

Linijos dėmė:Šiuo atveju tik kliniškai reikšmingi antigenai (natūralūs, sintetiniai arba rekombinantiniai) dedami ant bandymo juostelių tam tikra tvarka. Šis metodas naudojamas kelių infekcijų diferencinei diagnostikai vienoje juostoje.

Jo esmė – bandomosios medžiagos molekulių perkėlimas iš vieno kieto nešiklio, naudojamo biopolimerams frakcionuoti, į kitą, kur jos specialiai aptinkamos imunocheminės reakcijos būdu. Šiuolaikinis labai jautrus metodas yra identifikuoti baltymus, įskaitant virusų antigenus. Metodas pagrįstas gelio elektroforezės ir antigeno-antikūno reakcijos deriniu. Didelė skiriamoji geba pasiekiama dėl elektroforetinio baltymų, gliko- ir lipoproteinų atskyrimo ir didžiausio imuninių serumų arba monokloninių antikūnų aptikimo specifiškumo. Optimaliomis sąlygomis imunoblotavimas gali aptikti antigeną, kurio kiekis yra mažesnis nei 1 ng tiriamajame tūryje. Techniškai imunoblotingas atliekamas trimis etapais:

1) tiriami baltymai yra atskiriami poliakrilamido gelyje, esant denatūruojančioms medžiagoms: natrio dodecilsulfatui arba karbamidui, šis procesas dažnai vadinamas SDS-PAGE; atskirtus baltymus galima vizualizuoti po dažymo ir palyginti su etaloniniais mėginiais;

2) atskirti baltymai perkeliami iš gelio perdengiant (blotinguojant).
nitroceliuliozės filtras ir pritvirtintas prie jo; daugeliu atvejų, bet
ne visada pernešimo metu išsaugomi kiekybiniai baltymų santykiai;

3) filtrai yra padengti detektuojančiu poli- arba monokloniniu
antikūnai, turintys radioizotopo arba fermento žymę; Dėl
surištų antikūnų nustatymas, taip pat naudojama antirūšinė analizė
pažymėtas serumas, kitaip tariant, paskutiniame etape, bloting
panašus į kietosios fazės imunologinius tyrimus.

Reikėtų nepamiršti, kad esant tokiai imunoblotavimo sąlygai, baltymai yra denatūruoti, todėl jų gali neatpažinti antikūnai, būdingi vietiniam baltymui, tačiau esant visų sudedamųjų peptidų serumams, visas antigenas. vienu metu aptinkamas tiriamo baltymo spektras. Imunoblotavimas plačiai naudojamas tiriant hepatito virusų struktūrą, ypač siekiant nustatyti antigeninį ryšį tarp atskirų padermių. Didelė imunoblotavimo skiriamoji geba leidžia gauti gerų rezultatų diagnostikos praktikoje, kai reikia identifikuoti virusą paciento audiniuose ar išskyrose.

Priklausomai nuo tiriamosios medžiagos, išskiriama DNR, RNR ir baltymai – blotavimas.

Imunocheminis antigenų aptikimas gali būti atliekamas naudojant antikūnus, konjuguotus su etikete. Pastaruoju metu radioaktyvieji izotopai arba fermentai (peroksidazė, šarminė fosfatazė, laktamazė ir kt.) buvo plačiai naudojami kaip etiketė.

Difuzinio blotingo laikas yra 36–48 valandos, tačiau greičiausias ir efektyviausias būdas baltymams perkelti iš gelių yra elektroblotavimas, kuris paprastai trunka 1–3 valandas, kai kuriems didelės molekulinės masės baltymams – daugiau nei 12 valandų.

Konkretus sorbentų pasirinkimas įvairių modifikacijų dėmėms (nitroceliuliozei ar atitinkamai apdorotam popieriui), blokavimo ir antigenų imunocheminio nustatymo sąlygų parinkimas visiškai priklauso nuo antigeno, jo kiekio, imunologinio tyrimo metodo, tyrimo tikslų.

Galimybė aptikti antikūnus prieš specifinius patogeno antigenus leidžia įvertinti šių antikūnų reikšmę (specifiškumą tam tikram etiologiniam agentui), atmesti reakciją į kryžminius antigenus. Tuo imunoblotingas skiriasi nuo ELISA, kai kaip antigeną galima naudoti įvairius antigeninių determinantų derinius – tiek specifinius, tiek ne, suteikiančius kryžmines reakcijas su kitais patogenais. Priešingu atveju, kai gaunamas teigiamas ELISA rezultatas, galima tik manyti, kad tai yra kryžminės reakcijos rezultatas, o imunoblotingo atveju tai yra įtikinama.

IB metodas dėl daugelio priežasčių tapo plačiausiai naudojamas metodas, tinkamas naudoti kaip patvirtinimo testas.

Neabejotinas metodo pranašumas yra galimybė ištirti antikūnus prieš silpnai arba visiškai netirpius antigenus ir radioaktyviosios etiketės įvedimo į antigenus etapo pašalinimas.

Jautrumas IB atveju vertinamas pagal ribinį ant gelio nusėdusio antigeno kiekį, kuris frakcionuojant baltymus gali būti aptiktas imunochemiškai po perkėlimo iš gelio į kietąją fazę (nitroceliuliozę). Bendras tyrimo jautrumas priklauso nuo daugelio veiksnių: antigeno frakcionavimo ir imobilizavimo ant kieto nešiklio sąlygų, fono lygio, antikūnų specifiškumo ir afiniteto. Svarbus naudojamos etiketės tipas ir jos aptikimo būdas.

Taigi imunoblotavimo metodas leidžia nustatyti antigeno zonas ant kietos fazės, nesujungiant viso baltymo su specifiniais serumo antikūnais. Imunoblotingas ir jo modifikacijos daugiausia naudojamos bakterijų ir virusų antigenams ir antikūnams tipuoti, ypač esant nepakankamai įprastų sistemų skiriamajai gebai, taip pat imunoglobulinų, nukleorūgščių analizei arba kaip patvirtinimo testas kartu su kitais metodais.

Dideli sunkumai interpretuojant kryžminių reakcijų rezultatus ir pradinių serokonversijos stadijų atvejais. Pirmoje situacijoje, pakartotinai ištyrus po tam tikro laiko, antikūnų neaptinkama, o antruoju imunoblotu atsiranda naujos juostos, rodančios antikūnų prieš ŽIV baltymus ar glikoproteinus atsiradimą, apibūdinančių imuninio atsako atsako dinamiką. viruso antigenams.

Iš tikrųjų tai yra galutinis patikrinimo metodas serologinių tyrimų grandinėje, leidžiantis padaryti galutinę išvadą apie paciento ŽIV užsikrėtimą arba ją atmesti. IB nustatymui naudojamos nitroceliuliozės juostelės, ant kurių iš anksto perkeliami ŽIV baltymai horizontalios, o vėliau vertikalios imunoforezės būdu, didinant jų molekulinę masę. Tirtų serumų antikūnai sąveikauja su baltymais tam tikrose juostelės vietose. Tolesnė reakcijos eiga nesiskiria nuo ELISA, tai yra, juostelės (juostelės) apdorojimas konjugatu ir chromogeno substratu, neprisijungusių komponentų plovimas ir reakcijos sustabdymas distiliuotu vandeniu. Preliminarus elektroforetinis baltymų atskyrimas ir jų fiksavimas ant nitroceliuliozės leidžia nustatyti antikūnus prieš specifinius baltymus pagal atitinkamų juostelės zonų dažymą (arba nebuvimą) (pilkai mėlyna). Imunoblotavimas negali būti naudojamas masiniam atrankos tyrimui dėl didelės kainos ir yra individualaus arbitražo metodas paskutiniame serologinio tyrimo etape.

Yra gana aiški koreliacija tarp serumų tyrimo IB ir ELISA tyrimų rezultatų. Du kartus teigiami ELISA (skirtingose ​​testų sistemose) serumai tada IB interpretuojami kaip ŽIV teigiami 97–98 % atvejų. Serumai, kurių ELISA tyrimo rezultatai yra teigiami tik vienoje iš dviejų naudotų testų sistemų, IB yra teigiami ŽIV ne dažniau kaip 4 % atvejų. Atliekant patvirtinamuosius tyrimus, apie 5% IB gali duoti taip vadinamus „neapibrėžtus“ rezultatus, kurie, kaip taisyklė, atitinka teigiamą ELISA, bet ne RIP. Maždaug 20 % atvejų „neapibrėžtus“ IB sukelia antikūnai prieš ŽIV-1 gag baltymus (p55, p25, p18). Gavus abejotinus imunoblotavimo rezultatus, tyrimą kartoti būtina po 3 mėnesių, o jei rezultato neapibrėžtumas išlieka, po 6 mėn.

Radioimuninis metodas (RIM) (radioimunologinė analizė, RIA) Radioimuninis tyrimas – tai biologiškai aktyvių medžiagų (hormonų, fermentų, vaistų ir kt.) biologiniuose skysčiuose kiekybinio nustatymo metodas, pagrįstas norimų stabilių ir panašių medžiagų, paženklintų radionuklidu, turinčiu specifinių rišamųjų sistemų, konkurenciniu surišimu. Pastarieji dažniausiai yra specifiniai antikūnai. Dėl to, kad pažymėtas antigenas pridedamas tam tikru kiekiu, galima nustatyti medžiagos dalį, kuri prisijungė prie antikūnų, ir dalį, kuri lieka nesurišta dėl konkurencijos su aptinkamu nepažymėtu antigenu. Tyrimas atliekamas in vitro. Dėl R. ir. gaminti standartinius reagentų rinkinius, kurių kiekvienas yra skirtas bet kurios medžiagos koncentracijai nustatyti. Tyrimas atliekamas keliais etapais: biologinė medžiaga sumaišoma su reagentais, mišinys kelias valandas inkubuojamas, atskiriama laisva ir surišta radioaktyvioji medžiaga, atliekama mėginių radiometrija, apskaičiuojami rezultatai. Metodas yra labai jautrus, juo galima diagnozuoti širdies ir kraujagyslių, endokrininės ir kitų sistemų ligas, nustatyti nevaisingumo priežastis, vaisiaus vystymosi sutrikimus, onkologijoje nustatyti naviko žymenis ir stebėti gydymo efektyvumą, nustatyti. imunoglobulinų, fermentų ir vaistinių medžiagų koncentracija. Kai kuriais atvejais tyrimai atliekami funkcinių apkrovos tyrimų fone (pavyzdžiui, insulino kiekio kraujo serume nustatymas gliukozės tolerancijos testo fone) arba dinamikos (pavyzdžiui, lytinių hormonų kiekio kraujyje nustatymas menstruacinis ciklas).

Naudojant komercinį ABBOTT rinkinį – Austria II-I 125, galima aptikti HBsAg, kai koncentracija yra iki 0,1 ng/ml. Metodo pranašumai apima galimybę standartizuoti ir automatizuoti metodą, gavus atsakymus skaitiniais terminais. Metodo trūkumas yra apribojimai, nulemti veikimo su radioaktyviosiomis medžiagomis režimo, ir gana trumpas diagnostikos rinkinio galiojimo laikas, susijęs su radioaktyviosios etiketės irimu.

Diagnostikos rinkinius, skirtus įvairiems hepatito A, B ir D virusų antigenams ir antikūnams prieš juos nustatyti, gamina Isotope (Taškentas) ir kai kurios užsienio kompanijos (pavyzdžiui, ABBOTT). Kaip kietoji fazė naudojami polistireno rutuliukai (ABBOTT) arba mėgintuvėliai (izotopas). Antikūnams ar antigenams žymėti dažniausiai naudojamas izotopas I 125, kurio pusinės eliminacijos laikas yra 60 dienų ir didelis specifinis radioaktyvumas. Radioaktyviosios etiketės, ty spinduliuotės, matavimas atliekamas specialiais skaitikliais – radijo spektrometrais. Radioaktyvių impulsų skaičiavimas tiek kontroliniuose, tiek tiriamuosiuose mėginiuose atliekamas vienu fiksuotu laiku, paprastai per 1 minutę. Analizuojant reakcijos rezultatus, būtina atsižvelgti į radioaktyvumo fono buvimą, kuris gali turėti įtakos galutiniam reakcijos rezultatui. Padidėjusio fono priežastys gali būti: mėginio indo ar lizdo užterštumas; neteisingas įrenginio nustatymas; stiprios spinduliuotės šaltinio buvimas šalia prietaiso.

Norint patvirtinti teigiamą pirminės mėginių patikros rezultatą, rekomenduojama pakartoti RIA arba alternatyvų tyrimą. Jei aptinkamas HBsAg, reikia atlikti patvirtinimo testą.

1 lentelė. Vakcinų klasifikacija

Bibliografija:

Privaloma:

1. Chaitovas R.M., Ignatjeva G.A., Sidorovičius I.G. Imunologija: Vadovėlis.-M.: Medicina, 2000.- 432 p.: Ill.(Mokomoji literatūra medicinos studentams).

2. Kovalchuk L.V. ir kt. Imunologija: seminaras: vadovėlis. pašalpa - M.: GEOTAR-Media, 2012. - 176 p.

3. Pozdejevas O.K. Medicinos mikrobiologija / red. akad. RAMAS V.I. Pokrovskis - M.: GEOTAR-Media, 2001. - 768 p.

4. Borisovas L.B. Praktinių mikrobiologijos pratimų vadovas. M. 1997 m

Papildomas:

1. Genkel P.A., Mikrobiologija su virusologijos pagrindais. M., 1974 m

2. Korotyaev A.I., Babichev S.A. Medicinos mikrobiologija, imunologija ir virusologija: medaus vadovėlis. universitetai.- 3-ias leidimas, pataisytas. ir papildomas - Sankt Peterburgas, SpetsLit. 2002. - 591 p.

3. Borisovas L.B., Smirnova A.M., Medicinos mikrobiologija, virusologija, imunologija, M., Medicina. 1994 m

4. Timakovas V.D., Levašovas V.S., Borisovas L.B. Mikrobiologija. M. 1983 m

Imuninis blotavimas (imunoblotas, Western blot, Western blot)- derina su fermentais susietą imunosorbentinį tyrimą (ELISA) su preliminariu elektroforetiniu viruso antigenų perkėlimu į nitroceliuliozės juostelę (juostelę).

Šiame gražiame moksliniame pavadinime „dėmė“ greičiausiai verčiama kaip „dėmė“, o „vakarinis“ kaip „vakarinis“ atspindi šio „dėmės“ pasiskirstymo popieriuje kryptį iš kairės į dešinę, tai yra, geografiniame žemėlapyje, tai atitinka kryptį iš vakarų į rytus. „Imuninio bloto“ metodo esmė yra ta, kad imunofermentinė reakcija vykdoma ne su antigenų mišiniu, o su ŽIV antigenais, anksčiau imunoforezės būdu paskirstytais į frakcijas, esančias pagal molekulinę masę nitroceliuliozės membranos paviršiuje. Dėl to pagrindiniai ŽIV baltymai, antigeninių determinantų nešiotojai, pasiskirsto paviršiuje atskirų juostų pavidalu, atsirandančių fermento imunologinio tyrimo metu.

Imunoblotas apima kelis etapus:

Juostos paruošimas. Imunodeficito virusas (ŽIV), kuris anksčiau buvo išgrynintas ir sunaikintas iki sudedamųjų dalių, yra veikiamas elektroforezės, o antigenai, sudarantys ŽIV, atskiriami pagal molekulinę masę. Tada blotuojant (analogiškai išspaudžiant rašalo perteklių ant „bloterio“) antigenai perkeliami į nitroceliuliozės juostelę, kurioje dabar yra ŽIV būdingų, akiai nematomų antigeninių juostų spektras.

Pavyzdinis tyrimas. Ant nitroceliuliozės juostelės užtepama tiriamoji medžiaga (serumas, paciento kraujo plazma ir kt.), o jei mėginyje yra specifinių antikūnų, jie jungiasi prie griežtai atitinkamų (papildomų) antigeninių juostų. Dėl vėlesnių manipuliacijų šios sąveikos rezultatas vizualizuojamas – tampa matomas.

Rezultato interpretacija. Juostų buvimas tam tikrose nitroceliuliozės plokštelės vietose patvirtina, kad tiriamame serume yra antikūnų prieš griežtai apibrėžtus ŽIV antigenus.

A juosta – teigiamas valdymas

B juosta – silpna teigiama kontrolė

C juosta – neigiama kontrolė

D juostelė – teigiamas mėginys (aptikti antikūnai prieš ŽIV-1)

Šiuo metu imunoblotavimas (imunoblotas) yra pagrindinis metodas, patvirtinantis virusui specifinių antikūnų buvimą tiriamajame serume. Kai kuriais ŽIV infekcijos atvejais prieš serokonversiją specifiniai antikūnai veiksmingiau nustatomi imunoblotingu nei ELISA. Imuninio blotingo tyrimas atskleidė, kad antikūnai prieš gp 41 dažniausiai aptinkami sergančiųjų AIDS serume, o norint nustatyti p24 profilaktiniais tikslais tirtiems asmenims, reikia atlikti papildomus tyrimus dėl ŽIV infekcijos buvimo. Imunoblotų testų sistemos, pagrįstos genetiškai modifikuotais rekombinantiniais baltymais, pasirodė esančios specifiškesnės nei įprastos sistemos, pagrįstos išgrynintu viruso lizatu. Naudojant rekombinantinį antigeną susidaro ne difuzinė, o aiškiai apibrėžta siaura antigeno juosta, kuri lengvai pasiekiama apskaitai ir įvertinimui.

ŽIV-1 užsikrėtusių asmenų serume aptinkami šių pagrindinių baltymų ir glikoproteinų antikūnai – struktūriniai apvalkalo baltymai (env) – gp160, gp120, gp41; branduoliai (gag) - p17, p24, p55, taip pat viruso fermentai (pol) - p31, p51, p66. ŽIV-2 tipiški antikūnai prieš env – gp140, gp105, gp36; gag - p16, p25, p56; pol-p68.

Tarp laboratorinių metodų, reikalingų reakcijos specifiškumui nustatyti, didžiausią pripažinimą turi ŽIV-1 apvalkalo baltymų – gp41, gp120, gp160 ir ŽIV-2 – gp36, gp105, gp140 antikūnų nustatymas.

PSO mano, kad serumas yra teigiamas, jei imunoblotingu aptinkami antikūnai prieš bet kuriuos du ŽIV glikoproteinus. Remiantis šiomis rekomendacijomis, jei yra reakcija tik su vienu iš apvalkalo baltymų (rp 160, rp 120, rp 41) kartu arba be reakcijos su kitais baltymais, rezultatas laikomas abejotinu ir rekomenduojama atlikti antrą testą naudojant rinkinį. iš kitos serijos ar kitos kompanijos. Jei po to rezultatas išlieka abejotinas, rekomenduojama stebėti 6 mėnesius (tyrimas po 3 mėnesių).

Teigiama reakcija su p24 antigenu gali rodyti serokonversijos laikotarpį, nes kartais pirmiausia atsiranda šio baltymo antikūnai. Tokiu atveju, atsižvelgiant į klinikinius ir epidemiologinius duomenis, tyrimą rekomenduojama pakartoti su serumo mėginiu, paimtu ne vėliau kaip po 2 savaičių, o būtent tuo atveju, kai sergant ŽIV būtini suporuoti serumai.

Teigiamos reakcijos su gag ir pol baltymais be reakcijos su env baltymais gali atspindėti ankstyvos serokonversijos stadiją, taip pat gali rodyti ŽIV-2 infekciją arba nespecifinę reakciją. Asmenys, turintys tokius rezultatus po ŽIV-2 testo, pakartotinai tiriami po 3 mėnesių (per 6 mėnesius).

apibūdinimas

Nustatymo metodas Imunoblotas.

Tiriama medžiaga Serumas

Galimas vizitas į namus

Antibranduoliniai antikūnai yra autoantikūnų, kurie jungiasi su ribonukleino rūgštimis ir su jomis susijusiais baltymais, šeima. Jie atsiranda daugiau nei 90% pacientų, sergančių difuzinėmis jungiamojo audinio ligomis, taip pat dažnai stebimi sergant autoimuninėmis kepenų ligomis ir daugeliu kitų būklių. Iki šiol buvo apibūdinta apie 200 šios autoantikūnų šeimos atmainų, tačiau ne visos jos gali būti naudojamos klinikinėje praktikoje.

Antibranduolinių antikūnų imunoblotas leidžia vienu tyrimu vienu metu ištirti 15 pagrindinių antinuklearinių antikūnų tipų, o tai užtikrina pagrindinių sisteminių reumatinių ligų diferencinę diagnostiką. Kiekvienas imunoblotu aptiktas autoantikūnų tipas dažniausiai stebimas pacientams, turintiems būdingą klinikinį vaizdą, todėl autoantikūnų spektras leidžia ne tik diagnozuoti ligą, bet ir nustatyti tam tikrų klinikinių apraiškų išsivystymo riziką.

Antibranduolinių antikūnų imunoblotą patartina naudoti antrajame serologinio tyrimo etape, kai kitų tyrimų rezultatas yra teigiamas, rodantis, kad tiriamojo serume yra antinuklearinių antikūnų. Šie tyrimai apima antinuklearinių antikūnų nustatymą (ELISA atranka), antibranduolinio faktoriaus (ANF) nustatymą ant Hep2 ląstelių (), antibranduolinių antikūnų ir antikūnų prieš ekstrahuojamą branduolinį antigeną (ENA).

Antinuklearinių antikūnų imunoblotinis metodas diagnozuojant sistemines reumatines ligas pasižymi dideliu klinikiniu specifiškumu. Tačiau ne visada įmanoma nustatyti antibranduolinių antikūnų specifiškumą, net ir esant dideliems ANF titrai (), nes daugelis antibranduolinių antikūnų antigenų vis tiek lieka neapibūdinti. Neigiamas imunobloto rezultatas šiuo atveju neatmeta sisteminių reumatinių ligų diagnozės. Daugelį antinuklearinių antikūnų galima aptikti naudojant imunoblotą – miozitui specifinių autoantikūnų grupę () ir imunoblotą – sklerodermijos autoantikūnų grupę ().

Literatūra

1. Lapinas S.V. Totolyanas A.A. Imunologinė laboratorinė autoimuninių ligų diagnostika / Leidykla "Chelovek", Sankt Peterburgas - 2010. 272 ​​p.
2. Nasonovas E.L., Aleksandrova E.N. Šiuolaikiniai reumatinių ligų laboratorinės diagnostikos standartai. Klinikinės gairės / BHM, M - 2006.
3. Conrad K, Schlosler W., Hiepe F., Fitzler M.J. Autoantikūnai organų specifinėse autoimuninėse ligose: diagnostikos nuoroda/ PABST, Dresdenas – 2011. 300 p.
4. Conrad K, Schlosler W., Hiepe F., Fitzler M.J. Autoantikūnai sisteminėse autoimuninėse ligose: diagnostinė nuoroda / PABST, Dresdenas - 2007. 300 p.
5. Gershvin ME, Meroni PL, Shoenfeld Y. Autoantibodies 2nd ed./ Elsevier Science - 2006. 862 p.
6. Shoenfeld Y., Cervera R, Gershvin ME Diagnostic Criteria in Autoimune Diseases / Humana Press - 2008. 598 p.
7. Reagentų rinkinio instrukcijos.

Paruošimas

Pageidautina atlaikyti 4 valandas po paskutinio valgio, nėra jokių privalomų reikalavimų.

Indikacijos paskyrimui

Tyrimas skirtas šių būklių diagnozei ir diferencinei diagnozei:

• sisteminė raudonoji vilkligė;
• poūmė odos vilkligė ir kitos odos vilkligės rūšys;
• mišri jungiamojo audinio liga;
• Sjögreno sindromas ir susijusios ligos;
• difuzinė ir lokalizuota sklerodermija, CREST sindromas;
• uždegiminės miopatijos (polimiozitas ir dermatomiozitas);
• nepilnamečių lėtinis artritas;
• autoimuninis hepatitas;
• pirminė tulžies cirozė ir sklerozuojantis cholangitas;
• šio tyrimo naudojimas yra skirtas aukštiems antibranduolinio faktoriaus, antibranduolinių antikūnų, antikūnų prieš ekstrahuojamą branduolinį antigeną, antikūnų prieš DNR, antikūnus prieš nukleosomas ir antifosfolipidiniams antikūnams nustatyti.

Rezultatų interpretacija

Tyrimo rezultatų aiškinimas turi informaciją gydančiam gydytojui ir nėra diagnozė. Šiame skyriuje pateikta informacija neturėtų būti naudojama savidiagnostikai ar savęs gydymui. Tikslią diagnozę nustato gydytojas, naudodamasis tiek šio tyrimo rezultatais, tiek reikiama informacija iš kitų šaltinių: istorijos, kitų tyrimų rezultatų ir kt.

Matavimo vienetai: kokybinis testas, rezultatas pateikiamas "aptikta" arba "nerasta" forma.

Kai aptinkama juosta, apibūdinanti bet kokio tipo antikūnų buvimą, juostos spalvos intensyvumas papildomai apibūdinamas pliusų ("kryžių") skaičiumi kiekvienam iš identifikuotų antikūnų tipų. Teigimo laipsnio padidėjimas netiesiogiai atspindi autoantikūnų turinį ir afinitetą.

Pamatinės reikšmės: antikūnai prieš Sm, RNP/Sm, SS-A (60 kDa), SS-A (52 kDa), SS-B, Scl-70, PM-Scl, PCNA, CENP-B, dsDNR, histoną, nukleozomą , Rib P, AMA-M2, Jo-1 nerasta.

Kiekvienam atitinkamam antigenui autoantikūnų nustatymo rezultatas pateikiamas „kryžiukais“. Seropozityvumo laipsnio padidėjimas netiesiogiai atspindi autoantikūnų kiekį ir afinitetą. Seropozityvumo balo parinktys pateikiamos toliau:

1. Antikūnų nerasta.
2. +/- - ribinis rezultatas;
3. + - mažas autoantikūnų prieš specifinį antigeną kiekis;
4. ++ – vidutinis autoantikūnų prieš konkretų antigeną kiekis;
5. +++ - didelis autoantikūnų kiekis konkrečiam antigenui.

Pagrindinės ligos, susijusios su antinuklearinių antikūnų nustatymu:

Antigenas	Reikšmė
Sm (Smitas)	Specifinis sisteminės raudonosios vilkligės žymuo (įtrauktas į 10-ąjį Amerikos reumatologijos koledžo SLE kriterijų, ACR)
SS-A (Ro52)	Jis pastebimas sergant įvairiomis autoimuninėmis ligomis, dažniau sergant sistemine raudonąja vilklige ir jos odos formomis, sisteminėmis reumatinėmis ligomis, reumatoidiniu artritu, autoimuninėmis kepenų ligomis ir kt.
SS-A (Ro60)	Sisteminė raudonoji vilkligė, odos formos raudonoji vilkligė, jautrumas šviesai sergant sistemine raudonąja vilklige, didelė įgimtos raudonosios vilkligės ir vaisiaus širdies ligos rizika. Pagrindinis serologinis Sjögreno sindromo rodiklis. Jis dažnai pastebimas kartu su antikūnais prieš SS-A (Ro52) antigeną.
SS-B	Sjögreno sindromas, sisteminė raudonoji vilkligė.
PCNA	Sisteminė raudonoji vilkligė, vilkligės nefrito rizika.
Ribosomos (Ribo P)	Sisteminė raudonoji vilkligė, centrinės nervų sistemos pažeidimo rizika.
Nukleosomos	Sisteminė raudonoji vilkligė, didelė glomerulonefrito rizika.
dvigrandė DNR	Specifinis sisteminės raudonosios vilkligės žymuo (įtrauktas į 10-ąjį SRV ACR kriterijų), didelė rizika susirgti vilkligės nefritu.
snRNP/Sm	Mišri jungiamojo audinio liga, sisteminė raudonoji vilkligė su maža inkstų pažeidimo rizika, sklerodermija.
Histonai	Sisteminė raudonoji vilkligė, vaistų sukelta vilkligė, sklerodermija.
Scl-70	Sisteminė sklerozė su difuziniais odos ir vidaus organų pažeidimais.
PM-Scl	Sklerodermija su polimiozitu.
CENP-B	CREST sindromas su sklerodaktilija, telangiektazijomis, poodinėmis kalcifikacijomis, Raynaud sindromu, ezofagitu.
Jo-1	Polimiozitas antisintetazės sindromo forma.
AMA-M2	Pirminė tulžies cirozė, Sjögreno sindromas.

Šiuo metu Rusijoje yra standartinė ŽIV infekcijos laboratorinės diagnostikos procedūra antikūnų prieš ŽIV nustatymasnaudojant fermentinį imuninį tyrimą po to patvirtinamas jų specifiškumas reakcijoje imuninis blotingas.

Antikūnai prieš ŽIV atsiranda 90-95% užsikrėtusiųjų per 3 mėnesius nuo užsikrėtimo, 5-9% - po 6 mėnesių nuo užsikrėtimo, o 0,5-1% - vėliau. Ankstyviausias antikūnų aptikimo laikas yra 2 savaitės nuo užsikrėtimo momento.

Antikūnų prieš ŽIV aptikimas apima 2 etapus. Pirmajame etape viso antikūnų prieš ŽIV antigenus spektro nustatymas atliekamas naudojant įvairius testus: fermentinį imuninį tyrimą, agliutinaciją, kombinuotą, šukinį, membraninį filtrą arba membraninį difuzinį. Antrame etape imunoblotingas naudojamas antikūnams prieš atskirus viruso baltymus nustatyti. Darbe leidžiama naudoti tik bandymo sistemas, turinčias Rusijos Federacijos sveikatos apsaugos ministerijos leidimą. Diagnostinės procedūros turėtų būti atliekamos tik pagal patvirtintas atitinkamų tyrimų naudojimo instrukcijas.

Kraujo mėginių ėmimas iš kubitalinės venos gaminamas į švarų, sausą mėgintuvėlį, kurio tūris yra 3-5 ml. Virkštelės kraują galima paimti iš naujagimių. Gautos medžiagos (viso kraujo) nerekomenduojama laikyti kambario temperatūroje ilgiau kaip 12 valandų ir šaldytuve ilgiau kaip 1 parą 4-8°C temperatūroje. Artėjanti hemolizė gali turėti įtakos analizės rezultatams. Serumas atskiriamas centrifuguojant arba nubrėžiant kraują palei mėgintuvėlio sienelę Pasteur pipete arba stikline lazdele. Atskirtas serumas perpilamas į švarų (geriausia sterilų) mėgintuvėlį, buteliuką ar plastikinį indą ir tokioje formoje gali būti laikomas iki 7 dienų 4-8°C temperatūroje. Dirbant reikia laikytis saugos taisyklių, pateiktų 1990-07-05 „Instrukcijos dėl antiepideminio režimo AIDS diagnostikos laboratorijose“ Nr.42-28 / 38-90.

Bendrų antikūnų prieš ŽIV nustatymas.

Gavus pirmąjį teigiamą rezultatą, analizė atliekama dar 2 kartus (su tuo pačiu serumu ir toje pačioje tyrimo sistemoje). Jei gautas bent vienas teigiamas rezultatas (du teigiami rezultatai iš trijų ELISA testų), serumas siunčiamas į etaloninę laboratoriją.

Etaloninėje laboratorijoje pirminiai teigiami serumai (t. y. tie, kurie davė du teigiamus pirmoje bandymų sistemoje rezultatus) pakartotinai tiriami atliekant ELISA antrojoje (kitoje) patvirtinimui pasirinktoje tyrimų sistemoje.

Gavus teigiamą antrojo tyrimo sistemos analizės rezultatą, serumas turi būti tiriamas IS.

Jei antroje bandymų sistemoje gaunamas neigiamas rezultatas, serumas pakartotinai tiriamas trečiojoje bandymo sistemoje.

Jei tiek antroje, tiek trečioje tyrimo sistemoje gaunamas neigiamas tyrimo rezultatas, išduodama išvada dėl antikūnų prieš ŽIV nebuvimo.

Kai trečioje tyrimo sistemoje gaunamas teigiamas rezultatas, serumas taip pat siunčiamas analizei imuninio blotingo metu.

imuninis blotingas.

Metodo principas – aptikti antikūnus prieš tam tikrus viruso baltymus, imobilizuotus ant nitroceliuliozės membranos. ŽIV-1 apvalkalo baltymai (env) paprastai vadinami glikoproteinais ("gp" arba "gp"), kurių molekulinė masė išreiškiama kilodaltonais (cd): 160 kd, 120 kd, 41 kd. ŽIV-2 glikoproteinų svoris yra 140 kd, 105 kd, 36 kd. ŽIV-1 pagrindinių baltymų (gag) (paprastai vadinamų baltymais - "p" arba "r") molekulinė masė yra atitinkamai 55 kd, 24 kd, 17 kd, o ŽIV-2 - 56 kd, 26 kd. , 18 kd. Fermentų ŽIV-1 (pol) molekulinė masė yra 66 kd, 51 kd, 31 kd, ŽIV-2-68 kd.

Imunoblotavimo rezultatai interpretuojami kaip teigiami, neapibrėžti ir neigiami.

teigiamas(teigiami) laikomi mėginiais, kuriuose aptinkami antikūnai prieš 2 arba 3 ŽIV glikoproteinus.

neigiamas(neigiami) yra serumai, kurie neaptinka antikūnų prieš bet kurį iš ŽIV antigenų (baltymų).

Atsižvelgiama į mėginius, kurie aptinka antikūnus prieš vieną ŽIV glikoproteiną ir (arba) bet kurį iš ŽIV baltymų. abejotinas(neapibrėžta arba neinterpretuojama).

Kai imuninėje blotoje su ŽIV-1 antigenais gaunamas neapibrėžtas rezultatas su antikūnais prieš pagrindinius baltymus (gag), atliekamas tyrimas su ŽIV-2 antigenais.

Gavus teigiamus imuninio blotingo rezultatus, daroma išvada apie antikūnų prieš ŽIV buvimą tiriamojoje medžiagoje.

Gavusi neigiamą tyrimo rezultatą, IB išduoda išvadą, kad antikūnų prieš ŽIV nėra.

Gavus neapibrėžtą rezultatą (jei neaptiktas p24 antigenas), po 3 mėnesių atliekami pakartotiniai antikūnų prieš ŽIV tyrimai.

ir išlaikant neapibrėžtus rezultatus po dar 3 mėnesių. Jei buvo aptiktas p24 antigenas, antras tyrimas atliekamas praėjus 2 savaitėms po pirmojo neapibrėžto rezultato.

Jei praėjus 6 mėnesiams po pirmojo tyrimo vėl gaunami neapibrėžti rezultatai, o pacientas neturi infekcijos rizikos veiksnių ir klinikinių ŽIV infekcijos simptomų, rezultatas vertinamas kaip klaidingai teigiamas. (Jei yra epidemiologinių ir klinikinių indikacijų, serologiniai tyrimai kartojami taip, kaip nurodyta).

Imuninis blotavimas naudojant rekombinantinius virusui būdingus polipeptidus „ŽIV blot“ skiriasi tuo, kad naudojami ne patys viruso baltymai, o rekombinantiniai polipeptidai – ŽIV antigenų analogai („Env1“, „Gag1“, „Poll“, „Env2“). Rekombinantinis Env1 polipeptidas aptinka antikūnus tiesiogiai prieš ŽIV-1 gp120 ir gp41, Gag1 polipeptidą prieš p17 ir p24 antigenus, polipeptidą Po11 prieš p51 antigeną, Env2 polipeptidą prieš ŽIV-2 gp110 ir gp38 antigenus. Serumas laikomas teigiamu, jei jis reaguoja su Env1 arba Env2 arba abiem Env (1 ir 2 tipo ŽIV infekcija). Reakcija tik su Poll ir Gag yra laikoma neapibrėžtu rezultatu, tokiu atveju stebėjimas atliekamas panašiai kaip klasikinio imunobloto, naudojant ŽIV lizatą, neapibrėžtų rezultatų atvejais.

Serologinės ŽIV infekcijos diagnostikos ypatumai vaikams, gimusiems iš ŽIV infekuotų motinų, yra tai, kad tiek užsikrėtę, tiek neinfekuoti vaikai per pirmuosius 6-12 gyvenimo mėnesių turi motininės kilmės antikūnų prieš ŽIV, kurie vėliau gali išnykti. Kriterijus, rodantis, kad vaikas yra užsikrėtęs ŽIV, yra antikūnų prieš ŽIV aptikimas sulaukus 18 mėnesių ir vyresni. Antikūnų prieš ŽIV nebuvimas 18 mėnesių vaikui, gimusiam ŽIV infekuotai motinai, yra ŽIV infekcijos kriterijus.

Pagal PSO rekomendaciją imunoblotavimas (Western blot) ŽIV infekcijos diagnozei taikomas kaip papildomas ekspertinis metodas, kuris turėtų patvirtinti ELISA rezultatus. Šis metodas paprastai naudojamas norint dar kartą patikrinti teigiamą ELISA rezultatą, nes jis laikomas jautresniu ir specifiškesniu, nors ir sudėtingesniu ir brangesniu.

Imunoblotingas apjungia fermentinį imuninį tyrimą (ELISA) su preliminariu elektroforetiniu viruso baltymų atskyrimu gelyje ir jų perkėlimu į nitroceliuliozės membraną. Imunobloto procedūra susideda iš kelių etapų (27 pav.). Pirma, iš anksto išgrynintas ir sunaikintas iki sudedamųjų dalių, ŽIV yra veikiamas elektroforezės, o visi virusą sudarantys antigenai yra atskiriami pagal molekulinę masę. Tada blotuojant antigenai iš gelio perkeliami į nitroceliuliozės juostelę arba nailono filtrą, kuriame dabar yra ŽIV būdingas, akiai nematomas baltymų spektras. Toliau ant juostelės uždedama tiriamoji medžiaga (serumas, paciento plazma ir kt.), o jei mėginyje yra specifinių antikūnų, jie jungiasi prie juos griežtai atitinkančių antigeninių baltymų juostelių. Dėl vėlesnių manipuliacijų (pvz., ELISA) šios sąveikos rezultatas vizualizuojamas – tampa matomas. Juostelių buvimas tam tikrose juostelės vietose patvirtina, kad tiriamame serume yra antikūnų prieš griežtai apibrėžtus ŽIV antigenus.

Imunoblotavimas dažniausiai naudojamas ŽIV infekcijos diagnozei patvirtinti. PSO mano, kad serumas yra teigiamas, jei imunoblotavimo būdu aptinkami antikūnai prieš bet kuriuos du ŽIV apvalkalo baltymus. Remiantis šiomis rekomendacijomis, jei yra reakcija tik su vienu iš apvalkalo baltymų (