markery apoptozy. Podstawowe badania

1

Markowa A.A. 1Kashkina E.I. 1 Rubcow V.S. 1 Lakiszewa R.V. 1

1 Państwowy Uniwersytet Medyczny w Saratowie im. V.I. W I. Razumowski, Saratow

Analizowano ekspresję markerów apoptozy i proliferacji u 61 pacjentów z wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego w zależności od czasu trwania, ciężkości choroby i umiejscowienia procesu zapalnego w jelicie grubym. Grupę porównawczą stanowiło 15 praktycznie zdrowych osób. Badanie pacjentów przeprowadzono metodami klinicznymi, laboratoryjnymi, endoskopowymi, morfologicznymi. W próbkach biopsyjnych błony śluzowej okrężnicy oznaczono ekspresję markerów immunohistochemicznych Ki-67, P53, BAX i CEA. Badanie wykazało statystycznie istotny spadek aktywności proliferacyjnej błony śluzowej okrężnicy u pacjentów z wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego w porównaniu z grupą osób zdrowych, a także zmniejszenie procesów proliferacyjnych i wzrost ekspresji markerów apoptozy w zależności od czasu trwania i nasilenia nasilenia objawów klinicznych choroby.

niespecyficzne wrzodziejące zapalenie jelita grubego

markery apoptozy i proliferacji

1. Aruin LI, Kapuller LL, Isakov VA Diagnostyka morfologiczna chorób żołądka i jelit. - M.: Triada-X, 1998. - 496 s.

2. Gastroenterologia i hepatologia: diagnostyka i leczenie: poradnik dla lekarzy / wyd. AV Kalinina, A.F. Loginova, A.I. Chazanow. - wydanie drugie, poprawione. i dodatkowe – M.: MEDpress-inform, 2011. – 864 s.: il.

3. Brown D. Gatter K. Przeciwciało monoklonalne Ki-67: jego zastosowanie w histopatologii // Histopatologia. - 1990. - Nr 17. -

4. Bruno S., Darynkiewicz Z. Zależna od cyklu komórkowego ekspresja i stabilność białka jądrowego wykrywanego przez przeciwciało Ki-67 w komórkach HL-60, Cell. Profil. - 1992. - Nr 25. -

5. Porównanie markerów proliferacji (BrdUrd, Ki-67, PCNA) oznaczonych w każdej pozycji komórkowej w kryptach prawidłowej błony śluzowej okrężnicy ludzkiej / M. Bromley, D. Rew, A. Becciolini

i in. // EUR. J. Histochem. - 1996. - Cz. 40. – s. 89–100.

6. Holt PR, Moss SF, Kapetanakis AM Czy Ki-67 jest lepszym markerem proliferacyjnym w okrężnicy niż antygen jądrowy komórek proliferujących? rak. Epidimiol // Biomarkery. poprzedni - 1997. -

Nr 6. - s. 131-135.

7. McCormick D., Chong C., Hobbs C. et al. Wykrywanie antygenu Ki-67 w utrwalonym i zatopionym w wosku skrawku przeciwciałem monoklonalnym MIB-1 // Histopatologia. - 1993. -

nr 22. - s. 355-360.

8. Reed J. C. Bcl-2 i regulacja zaprogramowanej śmierci komórki // J. Cell. Biol. - 1994. - Cz. 124. – s. 1–6.

Niespecyficzne wrzodziejące zapalenie jelita grubego (NUC) jest jedną z najcięższych chorób przewodu pokarmowego, prowadzącą do inwalidztwa i śmierci pacjentów.

W ostatnich dziesięcioleciach obserwuje się wzrost częstości występowania WZJG w różnych krajach świata, co w dużej mierze wynika z poprawy diagnostyki tego procesu patologicznego.

Obecnie w diagnostyce WZJG stosuje się zintegrowane podejście z wykorzystaniem rentgenowskich, endoskopowych i histologicznych metod badawczych. Jedną z obiecujących metod oceny stanu błony śluzowej jelita grubego jest immunohistochemia z oznaczeniem markerów proliferacji i apoptozy.

Wśród metod badań immunohistochemicznych najszersze zastosowanie znalazły markery apoptozy bcl i p53. Wiadomo, że białka z rodziny bcl są albo induktorami apoptozy (Bad, Bax, Bak, itp.) albo inhibitorami apoptozy (Bcl-2, Bcl-XL, BOO, itp.). Należy zauważyć, że białko p53 jest wykrywane w wielu transformowanych komórkach. Jego funkcje mają na celu zapobieganie przenoszeniu uszkodzonej informacji genetycznej z jednej generacji komórek do drugiej, w tym poprzez inicjację apoptozy. Wysoka zawartość p53 prowadzi do wzrostu stężenia Bax w komórce i spadku stężenia bcl-2, co przyczynia się do śmierci komórki na drodze apoptozy.

Kilka antygenów stosuje się jako markery proliferacji. Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) bierze udział nie tylko w proliferacji komórek, ale także w naprawie DNA po uszkodzeniu, co czyni ten antygen warunkowo specyficznym dla cyklu komórkowego, ponieważ naprawa DNA może być przeprowadzona w fazie spoczynku. Innym antygenem istotnie związanym z fazami cyklu komórkowego jest Ki-67. Ekspresja tego białka zachodzi podczas fazy presyntetycznej, wzrasta podczas cyklu komórkowego i gwałtownie spada podczas fazy mitotycznej. Białko to, w przeciwieństwie do PCNA, nie bierze udziału w naprawie DNA. Ekspresja Ki-67 umożliwia identyfikację komórek znajdujących się we wszystkich fazach cyklu komórkowego, z wyjątkiem fazy spoczynku.

Celem pracy była analiza ekspresji markerów apoptozy i proliferacji u pacjentów z wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego w zależności od czasu trwania, ciężkości choroby i lokalizacji procesu zapalnego.

Materiały i metody badań

Grupę główną stanowiło 61 pacjentów z WZJG w wieku od 19 do 66 lat (27 kobiet i 34 mężczyzn), grupę porównawczą stanowiło 15 osób praktycznie zdrowych. Badanie pacjentów przeprowadzono metodami klinicznymi, laboratoryjnymi, endoskopowymi, morfologicznymi, a także za pomocą badań immunohistochemicznych wycinków biopsyjnych błony śluzowej jelita grubego.

Chorych na WZJG podzielono na grupy w zależności od nasilenia objawów klinicznych, czasu trwania choroby oraz lokalizacji procesu zapalnego.

Aktywność proliferacyjną komórek określono za pomocą wskaźnika proliferacyjnego Ki-67 według wzoru:

Gdzie X to liczba jąder w polu widzenia mikroskopu. Liczenie przeprowadzono w co najmniej 10 polach widzenia.

Apoptozę oceniano na podstawie ekspresji białek p53 i BAX w nabłonku powierzchownym i gruczołowym jelita grubego. W celu oceny procesów regeneracyjnych błony śluzowej okrężnicy w przebiegu WZJG oznaczono ekspresję embrionalnego antygenu nowotworowego (CEA).

Wyniki badań i dyskusja

W badaniu immunohistochemicznym określono zależność ekspresji tych markerów od czasu trwania WZJG, nasilenia jego objawów klinicznych oraz częstości występowania procesu zapalnego w jelicie grubym.

Podczas obróbki statystycznej uzyskanych danych po przetestowaniu równości wariancji i normalności rozkładu wykazano, że próba nie odpowiada prawu rozkładu normalnego, dlatego do porównania grup zastosowano kryteria nieparametryczne. Do opisu cech ilościowych wykorzystano medianę, górny i dolny kwartyl.

Tak więc u osób zdrowych Ki-67 PI wynosił 54 (46; 67), co wskazuje na wysoką aktywność proliferacyjną komórek okrężnicy (tabela).

Wskaźnik proliferacji Ki-67 komórek nabłonkowych błony śluzowej jelita grubego (%) u osób zdrowych i chorych na wrzodziejące zapalenie jelita grubego w zależności od czasu jego trwania, nasilenia i lokalizacji

Analizowane grupy		wartości Ki-67	Wiarygodność różnic
Grupa porównawcza
Czas trwania choroby			p 0 ≤ 0,001 R 1 ≤ 0,02 p 0 ≤ 0,001 R 1 ≥ 0,05
Nasilenie prądu średnio ciężki			p 0 ≤ 0,004 R 2 ≤ 0,05 p 0 ≤ 0,004 R 2 ≤ 0,02
Lokalizacja zmiany dystalny lewostronny całkowity			p 0 ≤ 0,002 R 3 ≥ 0,05 p 0 ≤ 0,002 R 3 ≥ 0,05

Uwagi:

• R 0 - istotność różnic z grupą kontrolną;
• R 1 - istotność różnic z czasem trwania choroby poniżej 1 roku;
• R 2 - wiarygodność różnic przy łagodnym przebiegu choroby;
• R 3 - wiarygodność różnic z dystalną lokalizacją choroby.

Ekspresja BAX u osób zdrowych była nieobecna w 80% przypadków, a niską ekspresję markera stwierdzono u 20%. Ekspresję CEA obserwowano w 50% przypadków i również była ona niska.

Wszystkich chorych, w zależności od czasu trwania choroby, podzielono na 3 grupy: I z WZJG trwającym do 1 roku, II z czasem trwania od 1 do 5 lat i III z ponad 5 latami.

Jak wynika z tabeli, wzrost Ki-67 PI w grupie chorych z czasem trwania choroby od 1 do 5 lat w porównaniu z grupą 1 ( R≤ 0,02) można wytłumaczyć zwiększoną aktywnością proliferacyjną komórek, odzwierciedlającą procesy naprawcze w błonie śluzowej okrężnicy. Niski PI Ki-67 w grupie pacjentów z wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego trwający do 1 roku, wynoszący 31 (25; 36), może świadczyć o wyraźnym zmniejszeniu procesów proliferacyjnych w błonie śluzowej jelit na początku choroby.

Badając wskaźnik p53 w zależności od czasu trwania choroby nie stwierdzono prawidłowości w ekspresji tego białka, jednak istnieje różnica w ekspresji tego markera pomiędzy grupą osób zdrowych a grupą pacjentów z chorobą czas trwania od 1 do 5 lat ( R≤ 0,05) i ponad 5 lat ( R ≤ 0,03).

Ekspresję BAX określono zarówno w nabłonku powierzchownym, jak i gruczołowym okrężnicy. Stwierdzono, że ekspresja tego markera w nabłonku powierzchniowym iw nabłonku gruczołów jest prawie taka sama w każdym indywidualnym przypadku. Ekspresję BAX u pacjentów z WZJG wykryto w 100% przypadków, stwierdzono istotne statystycznie różnice w ekspresji markera między grupą kontrolną a chorymi na WZJG ( R ≤ 0,01).

Porównując intensywność ekspresji CEA, odnotowano istotny wzrost wraz z wydłużeniem czasu trwania choroby. W grupie porównawczej ekspresja CEA przejawiała się tylko w pojedynczych przypadkach ( R ≤ 0,003).

W zależności od nasilenia objawów klinicznych WZJG wykryto również zmianę Ki-67 PI (patrz tabela). Ki-67 PI zmniejszył się u pacjentów z umiarkowaną chorobą ( R≤ 0,05) i ciężka postać ( R≤ 0,02) w porównaniu z pacjentami z łagodnym przebiegiem, istniała również różnica między grupą osób zdrowych a pacjentami z WZJG o dowolnym nasileniu ( R ≤ 0,004).

Zmiana ekspresji markera p53 zależała od ciężkości zaostrzenia (12,5% dla łagodnego przebiegu; 35,7% dla umiarkowanego nasilenia i 50% dla ciężkiego). Uzyskano statystycznie istotne różnice między grupami osób zdrowych i chorych na WZJG o umiarkowanej i ciężkiej postaci choroby ( R ≤ 0,03).

Ekspresję BAX i CEA stwierdzono w 100% przypadków, jednak nie stwierdzono zależności intensywności ekspresji tych markerów od nasilenia objawów klinicznych WZJG. Stwierdzono różnice w ekspresji markerów pomiędzy grupą porównawczą a pacjentami z WZJG niezależnie od nasilenia objawów klinicznych (p≤0,01).

Analizując zależność Ki-67 IP od lokalizacji procesu zapalnego, stwierdzono istotny wzrost ekspresji markera w grupie pacjentów z WZJG w porównaniu z osobami zdrowymi ( R≤ 0,002), jednak w analizie porównawczej w obrębie grupy głównej nie uzyskano statystycznie istotnych różnic między ekspresją markera a różną lokalizacją procesu ( R ≥ 0,05).

Nie u wszystkich pacjentów wykryto ekspresję p53. U pacjentów z dystalnym zapaleniem jelita grubego wynik dodatni uzyskano tylko w 20% przypadków, z lewostronnym zapaleniem jelita grubego u 18% pacjentów. Przy całkowitym uszkodzeniu jelit ekspresję p53 wykryto w 100% przypadków ( R≤ 0,03 w porównaniu z dystalnym zapaleniem jelita grubego). Należy zauważyć, że ekspresja była najbardziej intensywna w obszarach z objawami metaplazji nabłonkowej.

Intensywność ekspresji BAX w grupie z całkowitym zapaleniem jelita grubego była istotnie wyższa niż w grupie z dystalnym zapaleniem jelita grubego ( R ≤ 0,03).

Ekspresja CEA nie zależała od lokalizacji procesu zapalnego, jednak była istotnie wyższa u pacjentów z WZJG w porównaniu z grupą porównawczą ( R ≤ 0,03).

W niespecyficznym wrzodziejącym zapaleniu jelita grubego aktywność proliferacyjna komórek nabłonka błony śluzowej okrężnicy jest znacznie mniejsza, a tempo apoptozy większe niż przy braku jego zmian zapalnych.

Wydłużeniu czasu trwania nieswoistego wrzodziejącego zapalenia jelita grubego towarzyszy niska aktywność proliferacyjna nabłonka błony śluzowej okrężnicy, co może upośledzać jego naprawę.

Wraz ze wzrostem nasilenia objawów klinicznych niespecyficznego wrzodziejącego zapalenia jelita grubego obserwuje się nie tylko spadek stopnia aktywności proliferacyjnej komórek nabłonka okrężnicy, ale także wzrost wskaźników aktywacji apoptozy.

Wraz z rozprzestrzenianiem się procesu zapalnego na proksymalne odcinki jelita grubego stwierdzono wzrost apoptozy.

Recenzenci:

Shvarts Yu.G., doktor nauk medycznych, profesor, kierownik. Katedra Terapii Wydziału, Państwowy Uniwersytet Medyczny w Saratowie imienia V.I. Razumowskiego” Ministerstwa Zdrowia i Rozwoju Społecznego Rosji, Saratów;

Fedorina T.A., doktor nauk medycznych, profesor, kierownik. Katedra Patologii Ogólnej i Klinicznej: Anatomia Patologiczna, Fizjologia Patologiczna, Samarski Państwowy Uniwersytet Medyczny, Ministerstwo Zdrowia i Rozwoju Społecznego Rosji, Samara.

Praca wpłynęła do redakcji w dniu 09.12.2011.

Link bibliograficzny

Markova A.A., Kashkina E.I., Rubtsov V.S., Lyakisheva R.V. CECHY EKSPRESJI MARKERÓW APOPTOZY I PROLIFERACJI U PACJENTÓW Z NIESPECYFICZNYM WRZUCIAJĄCYM ZAPALENIEM Okrężnicy // Badania podstawowe. - 2012. - nr 2. - s. 79-82;
URL: http://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=29400 (data dostępu: 18.07.2019). Zwracamy uwagę na czasopisma wydawane przez wydawnictwo „Akademia Historii Naturalnej” Podział komórki jako całość jest raczej monotonnym procesem zwanym cyklem komórkowym. Znajduje się w nim duża liczba „punktów kontrolnych”, które kontrolują przejście komórki z jednej fazy cyklu do drugiej. Zniszczenie jednego lub więcej „punktów kontrolnych” może prowadzić zarówno do niekontrolowanej proliferacji, jak i śmierci komórki, w szczególności do apoptozy. Morfologiczny obraz apoptozy ze wszystkimi charakterystycznymi cechami (chromatoliza, brak reakcji zapalnej, kanibalizm komórek itp.) został opisany przez L. Grapera i nazwany „fizjologiczną eliminacją komórek”. W 1971 r. J. Kerr zaproponował termin „apoptoza” (z łac. aro – z, ptosis – opadać) przez analogię do spadających tu i ówdzie liści z drzewa. Podczas apoptozy wyróżnia się trzy fazy - wczesną (zmniejszenie rozmiaru komórki, fragmentacja DNA na duże fragmenty), pośrednią (dalsza fragmentacja DNA) i późną (ciałka apoptotyczne). Apoptoza odgrywa ważną rolę w rozwoju ludzkiego łożyska. Wraz z przebiegiem ciąży dochodzi do nasilenia zmian apoptotycznych w prawidłowo funkcjonującym łożysku.

Tertemiz i in.
w swojej pracy wykazali, że apoptoza bierze udział w mechanizmach fizjologicznej regulacji waskulogenezy łożyska. Waskulogeneza łożyska rozpoczyna się w 21. dniu ciąży i obejmuje pojawienie się hemangioblastów i angiogennych wysp komórkowych. Waskulogenezę łożyska badano metodami histologicznymi (preparaty barwione hematoksyliną i eozyną), immunohistochemicznymi (wykrywanie CD31), molekularno-genetycznymi (CD31-TUNEL - TdT-mediated X-dUTP nick end labelling) oraz transmisyjną mikroskopią elektronową. Badanie wykazało, że na angiogennych wyspach komórkowych brakuje komórek CD31-dodatnich. Jednak w komórkach prymitywnych naczyń włosowatych oraz w wielu komórkach zrębowych zlokalizowanych pomiędzy obszarami naczyniowymi wykryto ekspresję CD31. Badanie morfologiczne preparatów barwionych hematoksyliną i eozyną wykazało cechy apoptozy w tych komórkach - kariopyknozę i ciałka apoptotyczne. Nasilenie apoptozy i waskulogenezy w łożysku było wprost proporcjonalne.

Poziom apoptozy jest zwiększony w zaburzeniach ciąży, takich jak przedwczesne zakończenie ciąży, ciąża pozamaciczna, stan przedrzucawkowy.
Proliferacja i różnicowanie cytotrofoblastu oraz rozwój naczyń w zrębie kosmków wymaga odpowiedniego zaopatrzenia w tlen i składniki odżywcze z przestrzeni międzykosmkowej. Wśród powikłań ciąży, wewnątrzmaciczne opóźnienie wzrostu jest jedną z głównych przyczyn śmiertelności okołoporodowej. Rozregulowanie procesu apoptozy prowadzi do zmniejszenia liczby komórek syncytiotrofoblastu, co prowadzi do zmniejszenia dopływu składników odżywczych do płodu i opóźnienia rozwoju wewnątrzmacicznego płodu. Levy i in. kojarzą opóźnienie wzrostu wewnątrzmacicznego ze stanem przedrzucawkowym i paleniem tytoniu - stanami, które prowadzą do głodu tlenu w tkance łożyska. SY Dai i in. Badano łożyska kobiet bez nałogów i stanu przedrzucawkowego, ale z wewnątrzmacicznym opóźnieniem wzrostu. Autorzy zasugerowali, że zmiany apoptotyczne w komórkach łożyska w warunkach niedoboru tlenu mogą być regulowane przez czynniki aktywowane w warunkach hipoksji (czynnik indukowany hipoksją) - HIF-la, HIF-2a, HIF-1 p.

HIF-1 jest głównym czynnikiem zapewniającym adaptację komórek do niedotlenienia.
Może zmieniać ekspresję wielu genów odpowiedzialnych za erytropoezę, glikolizę i angiogenezę. Podczas gdy heterodimer HIF-1p jest wykrywany we wszystkich komórkach łożyska w każdych warunkach, HIF-1a jest wykrywany tylko podczas niedotlenienia. Rzadziej, w warunkach głodu tlenu, w komórkach wykrywany jest HIF-2a, znany również jako EPAS-1. mRNA HIF-la i -2a są obecne w łożysku przez cały okres ciąży, ale ich poziom różni się istotnie w zależności od wieku ciążowego. Jeśli poziom mRNA HIF-la pozostaje stały, to poziom mRNA HIF-2a wzrasta wraz z przebiegiem ciąży. W przeciwieństwie do HIF-1a, HIF-2a ulega ekspresji głównie w komórkach śródbłonka, odgrywając ważną rolę w angiogenezie i hematopoezie. W ludzkim łożysku ekspresja HIF-la i HIF-2a jest maksymalna we wczesnych stadiach, co zapewnia odporność komórek na fizjologiczne niedotlenienie występujące w tym okresie ciąży. Ponadto w stanie przedrzucawkowym odnotowano zwiększoną ekspresję tych czynników.

Konsekwencją stymulującego wpływu tych czynników na apoptozę jest opóźnienie wewnątrzmacicznego rozwoju płodu.
Tak więc w badaniu SY Dai i in. wskaźnik apoptozy w syncytiotrofoblastach kosmków wynosił 1,45±1,26% w grupie z opóźnieniem wzrostu wewnątrzmacicznego i 0,18±0,16 w grupie kontrolnej, w której nie obserwowano opóźnienia wzrostu wewnątrzmacicznego (p
Jednocześnie zawały wykrywalne makroskopowo były istotnie częstsze w łożyskach grupy z opóźnieniem wzrostu wewnątrzmacicznego (50%) niż w grupie kontrolnej (22%). Stopień odkładania fibrynoidów w przestrzeni międzykosmkowej był również nieznacznie wyższy w grupie z wewnątrzmacicznym opóźnieniem wzrastania. Aktywność mitotyczną elementów trofoblastu oraz komórek krwi i naczyń w 6 i 12-14 tygodniu ciąży badali Challier i in. Autorzy odnotowali w 6 tygodniu ciąży obecność figur mitotycznych oraz obecność jąder Kd67-dodatnich w komórkach cytotrofoblastów i erytroblastach. W cytotrofoblastach kosmków liczba jąder Ki67-dodatnich zmniejszała się do 12-14 tygodnia ciąży, pozostając jedynie w wyspach komórkowych pozakosmkowego cytotrofoblastu. W erytroblastach Ki67 nie jest już wykrywany w tym okresie. W komórkach śródbłonka w 6 tygodniu ciąży figury mitotyczne i ekspresja Ki67 były nieobecne; w 12-14 tygodniu ciąży wykryto lektynę UEA1. Brak figur mitotycznych i ekspresji Ki67 w komórkach śródbłonka i okołonaczyniowych w 6 tygodniu ciąży wskazuje na bezpośrednią zależność waskulogenezy od komórek zrębu iw większym stopniu niż od trofoblastu.

Sterowanie cyklem komórkowym komórek eukariotycznych jest realizowane przez rodzinę kinaz, w szczególności kinaz cyklinozależnych. Od pierwszego trymestru ciąży w jądrach cytotrofoblastu i śródbłonku sąsiednich naczyń wykrywana jest cyklina D1, której ekspresja stopniowo wzrasta do trzeciego trymestru ciąży. CDK4 jest wykrywany w jądrach cytotrofoblastów zarówno w pierwszym, jak i trzecim trymestrze ciąży, podczas gdy komórki śródbłonka COC4-dodatnie obserwuje się dopiero pod koniec trzeciego trymestru. Sugeruje to, że kompleks D1/CDK4 bierze udział w regulacji proliferacji komórek cytotrofoblastu w czasie ciąży oraz w kontroli angiogenezy w trzecim trymestrze ciąży. Naruszenie równowagi hormonalnej, immunologicznej, nagromadzenie wolnych rodników prowadzi do wzmożonej apoptozy w tkankach łożyska. Tak więc w stanie przedrzucawkowym zaburzone jest różnicowanie cytotrofoblastu i proces jego inwazji do macicy, co w dużej mierze wynika z apoptozy. Wiadomo, że apoptoza znacznie częściej występuje w dojrzałym łożysku podczas ciąży powikłanej opóźnieniem wzrostu płodu, a białko p53 odgrywa główną rolę w regulacji tego procesu, podczas gdy białko Bcl-2 nie bierze w nim udziału. Liczne badania wskazują na nadekspresję p53, a co za tym idzie na wzrost liczby komórek apoptotycznych w cytotrofoblastach w raku kosmówki i groniaku.

1

Zbadano 45 dzieci w wieku od 3 do 15 lat. Celem pracy było określenie gotowości do apoptozy limfocytów i neutrofili krwi obwodowej poprzez oznaczenie markerów apoptozy - CD95, CD95L, BSL2. Oceniając apoptozę komórek immunokompetentnych stwierdzono spadek gotowości limfocytów do zaprogramowanej śmierci komórkowej oraz wzrost liczby granulocytów obojętnochłonnych. Najbardziej wyraźne zmiany odnotowuje się w grupie wiekowej 7–15 lat z doświadczeniem choroby powyżej 3 lat. Uzyskane dane mogą świadczyć o zahamowaniu programowanej śmierci autoreaktywnych limfocytów w tkance trzustkowej, co przyczynia się do wydłużenia odpowiedzi immunologicznej. Wzrost odsetka leukocytów wykazujących ekspresję CD95L może nasilać procesy programowanej śmierci komórkowej w komórkach β wysp trzustkowych naciekanych komórkami immunokompetentnymi.

apoptoza neutrofili

apoptoza limfocytów

cukrzyca typu 1

1. Pekareva E. V. Markery apoptozy u pacjentów z cukrzycą typu 1 na początku choroby / E. V. Pekareva i wsp. // Cukrzyca. - 2009. - Nr 4. - S. 86-89.

2. Pekareva E. V. Rola apoptozy w patogenezie cukrzycy typu 1 / E. V. Pekareva, T. V. Nikonova, O. M. Smirnova // Cukrzyca. - 2010. - Nr 1. - P.45-48.

3. Adeghate E. Aktualizacja etiologii i epidemiologii cukrzycy / E. Adeghate, P. Schattner, E. Dunn // Ann NY. Acad Sci, 2006. - Cz. 1084. – s. 1–29.

4. Kliniczne znaczenie apoptozy neutrofilów we krwi obwodowej chorych na cukrzycę typu 2 / C. Sudo i in. // Hematol laboratoryjny. 2007; 13(3):108-12 (zredukowany).

5. Filep J. G. Apoptoza neutrofili: cel dla poprawy rozdzielczości stanu zapalnego / J. G. Filep, E. l. Kebir // J. Cell Biochem. - 2009. - Cz. 108. – s. 1039–1046.

6. Reakcje ludzkich wielojądrzastych neutrofili na Burkholderia pseudomallei u osób zdrowych i chorych na cukrzycę / S. Chanchamroen i in. // Zainfekuj odporność. - 2009. - Cz. 77. - P. 456-463 (zmniejszona apoptoza).

7. Wpływ apoptozy limfocytów na cukrzycę / K. Awadhesh i in. // Asian Journal of Medical Sciences. - 2011. - nr 2. - s. 1-6.

8. Zapalenie jest bardziej trwałe u myszy z cukrzycą typu 1 / D. T. Graves i in. // J. Dent. Rez., 2005. Cz. 84. – s. 324–328.

9. Juliana C. Alves Zakażenia u pacjentów z cukrzycą: przegląd patogenezy / C. Juliana, C. Janine, C. Alves // Indian J. Endocrinol. Metab. – marzec 2012 r. – Dodatek l1. – nr 16. – s. 27–36.

10. Luo HR Konstytutywna apoptoza neutrofili: mechanizmy i regulacja / HR Luo, F. Loison // Am. J. Hematol. - 2008. - Cz. 83. – s. 288–295.

Wstęp

Cukrzyca typu 1 (DM1) jest wielogenową, wieloczynnikową chorobą związaną z powstawaniem autoprzeciwciał i autoreaktywnych limfocytów T skierowanych przeciwko komórkom β trzustki.

Wiodącymi ogniwami w patogenezie zmian autoimmunologicznych są dysregulacja immunologiczna i zaprogramowana śmierć komórki.

Kontrolowana apoptoza jest dziś uważana za główny mechanizm utrzymania optymalnej równowagi komórek w ognisku zapalenia, ograniczający ekspansję aktywowanych klonów i zapobiegający rozwojowi reakcji autoimmunologicznych. Jeśli wystąpi defekt w jego realizacji, aktywowane komórki odpornościowe mogą się kumulować, co prowadzi do wystąpienia chorób autoimmunologicznych.

Cel badania: badanie markerów aktywacji apoptozy CD95, CD95L, Bsl2 na limfocytach krwi obwodowej i neutrofilach w cukrzycy typu 1 u dzieci.

Materiał i metody badawcze

Zbadano 45 dzieci z cukrzycą typu 1 w wieku od 3 do 15 lat. Grupa I obejmowała 20 dzieci w wieku 3-6 lat (przedszkolaki), grupa II - 12 dzieci w wieku 7-15 lat (uczniowie) z czasem trwania choroby poniżej 3 lat, grupa III - 13 dzieci w wieku 7-15 lat (uczniowie). z doświadczeniem choroby od ponad 3 lat. Grupę kontrolną stanowiło 30 zdrowych dzieci w wieku 3-6 (15) i 7-15 (15) lat. Badanie przeprowadzono na bazie oddziału endokrynologicznego Miejskiego Szpitala Klinicznego im. GK Filippsky, Stawropol.

Aby ocenić zaprogramowaną śmierć komórki, określono liczbę limfocytów i granulocytów obojętnochłonnych wykazujących ekspresję markerów apoptozy. Limfocyty izolowano w gradiencie gęstości Ficoll-Paque, neutrofile izolowano w gradiencie podwójnej gęstości Ficoll-Paque i ficoll-urografin (GE Healthcare, Szwecja). Zawiesinę komórek przemyto trzykrotnie w pożywce RPMI-1640 (Vector-Best, Rosja). W hodowlach limfocytów i neutrofili liczbę komórek wykazujących ekspresję CD95, CD95L, Bsl2 oszacowano metodą cytometrii przepływowej z użyciem przeciwciał monoklonalnych (Invitrogen, USA).

Do statystycznej analizy danych wykorzystano pakiet oprogramowania „Primer of Biostat 4.0”, Attestat 10.5.1. Aby ocenić różnice międzygrupowe, zastosowano analizę wariancji z powtarzanymi pomiarami z obliczeniem kryteriów Newmana-Keulsa, Dunna.

Wartości ilościowe charakteryzowały się nieprawidłowym rozkładem i zostały przedstawione jako mediana i przedział międzykwantylowy (25. i 75. percentyl) (Me (Q1-Q)). Różnice na str<0,05.

Wyniki i ich dyskusja

W badaniu stwierdzono spadek liczby limfocytów wykazujących ekspresję receptorów Fas (CD95) u pacjentów ze wszystkich grup w porównaniu ze zdrowymi dziećmi (tab. 1). Minimalne wskaźniki odnotowano u dzieci w wieku 7-15 lat z doświadczeniem choroby powyżej 3 lat (tab. 1).

Tabela 1

Wskaźniki apoptozy limfocytów u dzieci z cukrzycą typu 1

	Grupy kliniczne
3-6 lat	DM1 (I) (n=20)	17,7(15,9-19,43) * **	7,4(5,81- 8,94) * **	70,2(68,56-71,76) * **
	Grupa kontrolna	28,0(26,08-30,0)	9,2(8,04- 10,25)	65,9(62,82-69,05)
7-15 lat		20,5(17,94-23,02) * **	11,6(10,12-13,14) * **	70,3(65,72-74,9) * **
		13,9(10,04-17,73) * **	15,6(14,26-16,87) * **	79,5(75,47-83,59) * **
	Grupa kontrolna	26,5 (24,20-28,84)	8,14 (6,49-9,78)	60,3(56,97-63,66)

*- P<0,05 - по сравнению с контрольной группой, **- P<0,05 - по сравнению с группой

Oceniając poziom ekspresji markerów antyapoptotycznych (Bsl2), jego wzrost wykryto na limfocytach dzieci wszystkich grup, bardziej wyraźny u dzieci w wieku szkolnym z czasem trwania choroby dłuższym niż 3 lata, co również wskazuje na naruszenie zależnego od Fas apoptozy u dzieci z cukrzycą typu 1, prowadząc do spowolnienia procesów śmierci komórkowej autoreaktywnych form limfocytów.

Nasze wyniki mogą być pośrednim objawem zahamowania programowanej śmierci aktywowanych limfocytów w tkance trzustki, co przyczynia się do wydłużenia odpowiedzi immunologicznej.

Stopień gotowości apoptotycznej komórek limfoidalnych zależy od czasu trwania choroby i zmniejsza się u dzieci z DM1 powyżej 3 lat.

Wcześniej wykazano, że oporność limfocytów na apoptozę jest wykrywana w cukrzycy, co może wyjaśniać charakter i czas trwania odpowiedzi autoimmunologicznej.

W hodowli limfocytów od dzieci chorych na cukrzycę stwierdzono wzrost odsetka limfocytów z ekspresją CD95L (tab. 1) w porównaniu z grupą dzieci zdrowych. Najwyższe wskaźniki stwierdzono u dzieci w wieku 7-15 lat z doświadczeniem choroby powyżej 3 lat (tab. 1).

Wiadomo, że w DM1 wysepki trzustkowe są naciekane przez komórki odpornościowe wytwarzające szeroki zakres cytokin, czemu towarzyszy nieprawidłowa ekspresja receptorów błonowych. Pod wpływem zwiększonego stężenia glukozy i cytokin, komórki β zaczynają na swojej powierzchni eksprymować CD95, co jest praktycznie nieobecne w normie.

Wzrost ekspresji CD95L na komórkach limfoidalnych prawdopodobnie powoduje wyraźniejszy proces apoptozy w komórkach β trzustki i ich późniejsze usuwanie.

W ostatnich latach wykazano, że granulocyty obojętnochłonne aktywnie uczestniczą w powstawaniu zapalenia o podłożu autoimmunologicznym. Reakcja neutrofili mająca na celu lokalizację i eliminację autoantygenów zależy w dużej mierze od siły i czasu trwania efektu antygenowego na układ odpornościowy, a także od początkowego poziomu funkcjonalnej aktywności komórek.

Stwierdziliśmy, że przebiegowi cukrzycy u dzieci towarzyszy wzrost odsetka neutrofili wykazujących ekspresję markerów apoptozy (CD95) oraz spadek odsetka komórek, które mają na swojej powierzchni białka antyapoptotyczne Bsl2 (tab. 2).

Tabela 2

Wskaźniki apoptozy neutrofili u dzieci z cukrzycą typu 1

	grupy kliniczne
3-6 lat	DM1 (I) (n=20)	75,1(71,49-78,72) * **	9,5 (8,63- 10,32) * **	3,68 (3,46-3,90 * **
	Grupa kontrolna	59,2 (56,31- 62,01)	7,35 (6,58- 8,12)
7-15 lat	DM1, doświadczenie choroby mniej niż 3 lata (II) (n=12)	77,6(71,15-83,99) * **	9,5(8,14-10,92) * **	3,99(2,9- 5,08) * **
	DM1, doświadczenie choroby ponad 3 lata (III) (n=13)	87,9(84,24-91,63) * **	12,1(10,22-13,96) * **	2,78(2,36-3,19) * **
	Grupa kontrolna	58,43(54,95- 1,90)

*- P<0,05 - по сравнению с контрольной группой, **- P<0,05 - по сравнению с группой III (kryterium Newmana-Keulsa, kryterium Dunna).

Przy porównawczej charakterystyce międzygrupowej maksymalne wskaźniki CD95 (s<0,05) и минимальные Bsl2 (p<0,05) отмечены у детей 7-15 лет с длительностью заболевания более 3-х лет.

Stwierdzono wzrost odsetka leukocytów polimorfojądrowych z CD95L na ich powierzchni. Najwyższe wskaźniki odnotowano u dzieci uczniów z doświadczeniem choroby powyżej 3 lat.

Przedstawione w piśmiennictwie wyniki badań nad apoptozą PMNL w cukrzycy są kontrowersyjne. Istnieją dowody na wzrost tempa apoptozy neutrofili krwi obwodowej w DM1 i DM2.

Jednak w wielu badaniach stwierdzono zmniejszenie apoptozy granulocytów obojętnochłonnych u pacjentów z cukrzycą typu 1, zwłaszcza w warunkach hiperglikemii, co prawdopodobnie inicjuje przewlekłe procesy zapalne z uszkodzeniem tkanek, a także predysponuje do przedłużających się infekcji bakteryjnych u pacjentów z cukrzycą typu 1 cukrzyca.

Nasze wyniki sugerują, że pacjenci z DM1 mają zwiększoną predyspozycję PMNL do apoptozy, co może być przejawem reakcji ochronnej mającej na celu eliminację „nadmiaru” aktywnych neutrofili, których powstawanie nasila uszkodzenia tkanek.

Wzrost potencjału apoptotycznego granulocytów obojętnochłonnych jest odzwierciedleniem aktywnego udziału PMNL w immunopatogenezie choroby.

Zwiększenie ekspresji CD95L na granulocytach obojętnochłonnych u pacjentów z cukrzycą prawdopodobnie może przyczynić się do eliminacji nie tylko komórek trzustki, ale także ich własnych leukocytów.

Tak więc, oceniając apoptozę komórek immunokompetentnych u dzieci z cukrzycą typu 1, stwierdzono spadek gotowości limfocytów do zaprogramowanej śmierci komórkowej oraz wzrost liczby leukocytów wielojądrzastych.

Najbardziej wyraźne zmiany odnotowuje się w grupie wiekowej 7-15 lat z doświadczeniem choroby powyżej 3 lat. U dzieci ze wszystkich grup stwierdzono wzrost udziału leukocytów z ekspresją CD95L na ich powierzchni.

Wiadomo, że PMNL są ogniwem łączącym odporność wrodzoną i nabytą oraz odgrywają wiodącą rolę w ochronie przeciwbakteryjnej.

Wzrost ich aktywności apoptotycznej może powodować niską odporność dziecka na wiek i podatność na choroby zakaźne.

Zmniejszenie liczby komórek limfoidalnych wrażliwych na indukcję apoptozy jest pośrednim objawem zahamowania programowanej śmierci komórki i upośledzonej eliminacji aktywowanych form limfocytów.

wnioski

1. U dzieci z cukrzycą typu 1 obserwuje się spadek gotowości limfocytów krwi obwodowej do apoptozy, wzrost granulocytów obojętnochłonnych, któremu towarzyszy zmiana ekspresji CD95 i Bsl2 i zależy od czasu trwania choroby .

2. Wzrost ekspresji CD95L na limfocytach i granulocytach obojętnochłonnych w DM1 może nasilać procesy programowanej śmierci komórkowej w komórkach β wysp trzustkowych naciekanych komórkami immunokompetentnymi.

Recenzenci:

Shchetinin E.V., doktor nauk medycznych, profesor, prorektor ds. badań i innowacji, SSMU, kierownik oddziału HBO HPE „Stawropolski Państwowy Uniwersytet Medyczny” Ministerstwa Zdrowia Federacji Rosyjskiej, Stawropol.

Golubeva M.V., doktor nauk medycznych, profesor, kierownik Kliniki Chorób Zakaźnych Dziecięcych, Stawropolski Państwowy Uniwersytet Medyczny, Stawropolski Państwowy Uniwersytet Medyczny, Stawropol.

Link bibliograficzny

Barycheva L.Yu., Erdni-Goryaeva N.E. MARKERY APOPTOZY KOMÓREK ODPORNOŚCIOWYCH W CUKRZYCY TYPU 1 U DZIECI // Współczesne problemy nauki i edukacji. - 2013 r. - nr 4.;
URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=9953 (data dostępu: 18.07.2019). Zwracamy uwagę na czasopisma wydawane przez wydawnictwo „Akademia Historii Naturalnej”

apoptoza- jest to zaprogramowana, genetycznie zapośredniczona forma śmierci komórki, w której zewnętrzne lub wewnętrzne sygnały dają komórce impuls do tworzenia lub aktywacji enzymów, doprowadzając ją do samozniszczenia. Morfologicznie apoptoza charakteryzuje się kurczeniem się komórki, kondensacją i fragmentacją jądra, zniszczeniem cytoszkieletu i pęcherzowym wysunięciem błony komórkowej. Cechą apoptozy jest to, że umierająca komórka zachowuje integralność swojej błony aż do zakończenia procesu i dopiero wtedy zniszczenie jej błony jest sygnałem dla pobliskich fagocytów do wchłonięcia pozostałych fragmentów i zakończenia procesu degradacji komórki. Komórki apoptotyczne, które nie ulegają natychmiastowej fagocytozie, zamieniają się w małe, związane z błoną fragmenty zwane „ciałkami apoptotycznymi”. Ważną cechą apoptozy jest to, że usuwanie obumierających komórek następuje bez rozwoju stanu zapalnego.

Apoptoza odgrywa ważną rolę w procesach fizjologicznych: organogenezie, rozwoju embrionalnym, regulacji składu i liczby populacji komórek w tkankach dorosłego organizmu, różnych zmianach hormonalnych w organizmie. Rola apoptozy jest również istotna w różnych procesach patologicznych. Najpełniej bada się go we wzroście guza.

Proces apoptozy można podzielić na dwie fazy:

powstawanie i przewodzenie sygnałów apoptotycznych - faza decyzyjna;

rozbiórka struktur komórkowych - faza efektorowa.

Realizacja mechanizmów apoptozy wiąże się z aktywacją endogennych enzymów komórkowych – proteaz cysteinowych (kaspaz). Kaspazy znajdują się w komórkach w stanie nieaktywnym (prokaspazy). Aktywacja następuje przez ich rozszczepienie proteolityczne, a następnie dimeryzację z utworzeniem aktywnych podjednostek. Celem dla kaspaz są białka odpowiedzialne za różne funkcje życiowe komórki. Obecnie opisano 14 typów kaspaz, które ze względu na cechy funkcjonalne można podzielić na 3 grupy:

aktywatory cytokin (kaspazy 1, 4, 5, 13)

kaspazy - induktory aktywacji kaspaz efektorowych (kaspazy 2, 8, 9, 10)

kaspazy efektorowe - wykonawcy apoptozy (3, 6, 7)

Jednym z błonowych receptorów komórkowych odpowiedzialnych za mechanizmy apoptozy jest białko zwane receptorem Fas (CD95/APO1). Ligandem dla receptora Fas jest białko – ligand Fas (Fas-L), który należy do rodziny czynników martwiczych nowotworów i może występować zarówno w postaci białka błonowego, jak i rozpuszczalnej. Związanie receptora Fas z ligandem Fas prowadzi do aktywacji mechanizmów apoptozy z aktywacją induktorów kaspazy. Po kolejnej aktywacji kaspaz efektorowych rozpoczyna się łańcuch reakcji proteolitycznych, których celem jest apoptotyczny „demontaż” komórki: fragmentacja DNA, bezpośrednie rozszczepienie białek strukturalnych komórki i rozregulowanie syntezy białek. Zatem udział kaspaz efektorowych w apoptozie prowadzi do rozerwania komórki apoptotycznej z komórkami otaczającymi, reorganizacji cytoszkieletu, zmniejszenia możliwości naprawy i replikacji DNA, pęknięcia błony jądrowej i zniszczenia DNA, uwolnienia sygnałów oznaczających komórkę do apoptozy i rozwarstwienie komórki na ciałka apoptotyczne. To nie przypadek, że kaspazy efektorowe nazywane są „kaspazami kata”.

Metody badania apoptozy są dość zróżnicowane. Początkowo najpowszechniejszą metodą oznaczania apoptozy była elektroforeza wyekstrahowanej frakcji DNA, która umożliwia ujawnienie odrębności molowej DNA o małej masie cząsteczkowej. masy (w wyniku międzynukleosomalnej degradacji DNA). W badaniach morfologicznych do wykrywania pęknięć DNA wykorzystuje się metodę TUNEL, która polega na tworzeniu znakowanych wstawek oligonukleotydowych w obszarach pęknięć DNA, których tworzenie jest katalizowane przez enzym TdT.

Obecnie do rejestracji apoptozy limfocytów coraz częściej wykorzystuje się metody oparte na cytometrii przepływowej. Do tej grupy należy metoda polegająca na wykrywaniu utraty części DNA przez komórki (komórki hipodiploidalne) za pomocą barwnika fluorescencyjnego – jodku propidyny, którą opisano poniżej. Do określenia apoptozy stosuje się również inne metody oparte na cytometrii przepływowej. Apoptozę limfocytów można wykryć już na wczesnym etapie za pomocą aneksyny V znakowanej fluorochromem, która wiąże się z fosfatydyloseryną pojawiającą się na błonie komórek ulegających apoptozie. Przybliżone wyobrażenie o „tendencji” limfocytów do rozwoju apoptozy można uzyskać określając ekspresję na ich powierzchni receptora Fas (CD95) oraz w mitochondriach protonkogenu bcl-2.

Kliniczne znaczenie oceny apoptozy podczas badania klinicznego i immunologicznego pacjentów jest niewątpliwe, ponieważ z jej naruszeniem wiąże się wiele chorób. Osłabienie apoptozy jest spowodowane powstawaniem chorób autoimmunologicznych (z powodu naruszenia procesu uboju autospecyficznych klonów limfocytów). Dlatego rejestracja osłabienia apoptozy może służyć jako źródło informacji o mechanizmach patogenetycznych takich chorób autoimmunologicznych jak toczeń rumieniowaty układowy, reumatoidalne zapalenie stawów, a także autoimmunologiczny zespół limfoproliferacyjny, który opiera się na mutacjach genów determinujących receptory sygnałów apoptotycznych. Naruszenie apoptozy jest ważnym mechanizmem rozwoju procesów nowotworowych. W komórkach nowotworowych często wykrywana jest mutacja genu p53 kodującego białko odbierające sygnał o obecności nienaprawionych pęknięć w DNA oraz mutacje chromosomalne prowadzące do rozwoju apoptozy. Dzięki temu genetycznie wadliwe komórki nie są odrzucane i stają się źródłem powstawania nowotworów.

Przeciwnie, w wielu innych chorobach obserwuje się wzrost apoptozy. Dzieje się tak w procesach infekcyjnych (przyczyną masowej apoptozy komórek T są często superantygeny drobnoustrojów), posocznicy i różnych chorobach wirusowych, w tym AIDS. Apoptoza nasila się w wielu chorobach krwi i pierwotnych niedoborach odporności, gdy jej przyczyną jest niedostateczna produkcja czynników przeżycia komórek, w której rolę odgrywają cytokiny. Tak więc, w jednej z postaci ciężkiego złożonego niedoboru odporności związanego z mutacją genu IL-7 lub wspólnego łańcucha γ receptorów cytokin, śmierć prekursorów limfoidalnych z powodu niedoboru IL-7 jest.

Jednak najbardziej ogólnie istotna jest ocena „apoptozy aktywacyjnej”, której ulegają limfocyty po stymulacji mitogenami. Faktem jest, że apoptoza, obok proliferacji, jest formą odpowiedzi limfocytów na bodźce aktywacyjne. We wczesnych stadiach różnicowania dominuje odpowiedź apoptotyczna, której skutkiem jest powstanie tolerancji na antygen induktora. Dojrzałe limfocyty reagują na stymulację głównie poprzez proliferację (która jest etapem początkowym i warunkiem rozwoju odpowiedzi immunologicznej), ale pozostaje pewne prawdopodobieństwo ich wejścia w apoptozę aktywacyjną. Ponieważ apoptoza w tym przypadku działa jako proces alternatywny do proliferacji, ich stosunek może służyć jako miara skuteczności odpowiedzi komórki na sygnały aktywujące. Im większy udział apoptozy w odpowiedzi limfocytów na mitogen, tym mniej skuteczna będzie swoista dla antygenu obrona immunologiczna. Zatem określenie apoptozy po aktywacji limfocytów przez mitogeny jest najbardziej pouczające pod warunkiem równoległej oceny odpowiedzi proliferacyjnej komórek na ten sam bodziec.

W procesie apoptozy w komórce zachodzi złożony łańcuch reakcji na poziomie molekularnym, prowadzący do zmiany procesów metabolicznych i cech fenotypowych komórek. Zmiany te można określić metodami biochemicznymi, mikroskopowymi lub cytometrycznymi i są one stosowane jako markery apoptozy.

Jednym z wczesnych markerów apoptozy jest pojawienie się na błonie cytoplazmatycznej komórki receptory aneksyny. W komórkach apoptotycznych fosfolipidowa fosfatyldiseryna (PS) jest przestawiana i lokalizowana na powierzchni błony komórkowej. Obserwuje się lokalizację PS na powierzchni membrany począwszy od
wczesna faza apoptozy do całkowitej degradacji komórki. Rekombinowany
ny aneksyna V-białko (35-36 kDa), które ma wysokie powinowactwo
do PS w obecności jonów Ca +2. Kontakt z FS na powierzchni
służy aneksyna V skoniugowana z fluorochromem
marker apoptozy. Zwykle aneksyna V jest stosowana w połączeniu z
jodek propidyny (PI), który pozwala na jednoczesne rozpoznanie
nienaruszone komórki (ujemne zarówno pod względem aneksyny V, jak i PI), komórki
znajdują się w „wczesnej” apoptozie (pozytywne dla aneksyny V,
ujemne dla PI) i komórki w późnej apoptozie lub
w martwicy (dodatni dla aneksyny V i PI).

CD95 Fas, czyli APO-1, jest transbłonową glikoproteiną o masie cząsteczkowej 45 kDa, która należy do rodziny receptorów czynnika martwicy nowotworu (TNF-α). Antygen CD95 ulega ekspresji w znacznych ilościach na tymocytach, limfocytach CD4+, CD8+ krwi obwodowej, w mniejszym stopniu na limfocytach B i komórkach NK. Antygen ten ulega również ekspresji na granulocytach i monocytach, ale nie występuje na płytkach krwi i erytrocytach. Receptor CD95 obserwuje się także na komórkach tkanek prawidłowych i nowotworowych. Wiązanie CD95 z ligandem Fas (Fas-L, CD95L) indukuje apoptozę w komórkach wyrażających go. Przeciwciała monoklonalne przeciwko CD95 pozwalają za pomocą metody cytometrii przepływowej lub mikroskopii fluorescencyjnej zidentyfikować populację komórek gotowych do apoptozy.

CD95L (Fas-L)– zwany Fas-ligandem, jest białkiem błonowym (40kD). Istnieje również rozpuszczalna postać CD95L (sFas-L), która jest białkiem (26 kD) z rodziny receptorów (TNF-α). Antygen ten jest eksprymowany przez cytotoksyczne limfocyty E i komórki NK, a także znajduje się na wielu komórkach nowotworowych. Wiązanie Fas-L z receptorem CD95 indukuje proces apoptozy w komórkach docelowych. Przeciwciała monoklonalne przeciwko CD95L pozwalają za pomocą metody cytometrii przepływowej lub mikroskopii fluorescencyjnej zidentyfikować populację komórek gotowych do apoptozy.

Bcl-2– białko (26 kDa), którego nadekspresja blokuje apoptozę. Bcl-2 jest białkiem wewnątrzkomórkowym zlokalizowanym na mitochondriach, dlatego do jego oznaczenia za pomocą przeciwciał monoklonalnych konieczne jest wstępne uprzednie przepuszczenie błony komórkowej.

Koniec pracy -

Ten temat należy do:

Metody oceny statusu immunologicznego podręcznika dla studentów kierunków lekarskich, pediatrycznych i medyczno-profilaktycznych

Kursk Państwowy Uniwersytet Medyczny Federalnej Agencji Zdrowia i Rozwoju Społecznego Katedra Immunologii Klinicznej i Alergologii..

Jeśli potrzebujesz dodatkowych materiałów na ten temat lub nie znalazłeś tego, czego szukałeś, polecamy skorzystanie z wyszukiwarki w naszej bazie prac:

Co zrobimy z otrzymanym materiałem:

Jeśli ten materiał okazał się dla Ciebie przydatny, możesz zapisać go na swojej stronie w sieciach społecznościowych:

ćwierkać

Wszystkie tematy w tej sekcji:

Stan odporności i metody jego oceny
Status immunologiczny (IS) to zestaw parametrów laboratoryjnych, które charakteryzują aktywność ilościową i funkcjonalną komórek układu odpornościowego. Wskaźniki IP różnią się dużymi

Przedmioty i metody badań immunologicznych
Przedmiot badań Metody badań Charakterystyka fenotypowa komórek immunokompetentnych Cytofluorometria przepływowa Imm

Limfocyty
Jako część komórek układu odpornościowego, prawdziwe immunocyty są wszystkimi wariantami limfocytów. Inne typy krwinek białych (neutrofile, eozynofile, bazofile, monocyty), makrofagi, płytki krwi, komórki tuczne

Komórki MFS
Monocyty krwi obwodowej i makrofagi tkankowe pochodzą z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Po dostaniu się do krwiobiegu monocyty osadzają się w tkankach w ciągu 2-3 dni, gdzie zamieniają się w tkankę.

Antybakteryjny system zależny od tlenu
zależne od tlenu mechanizmy działania bakteriobójczego glukoza + NADP+ → pentozofosforan + NADPH Cytochrom b245 NADP + O2 ͛

komórki pośredniczące
Granulocyty to leukocyty wielojądrzaste krążące we krwi i powstające, podobnie jak komórki monocytów-makrofagów, z mieloidalnej komórki macierzystej w szpiku kostnym. Istnieją trzy rodzaje zbóż

Metody immunofenotypowania limfocytów
Podczas badania limfocytów ocenia się ich liczbę we krwi obwodowej i aktywność funkcjonalną. Określenie liczby komórek przeprowadza się z uwzględnieniem antygenów różnicowania na i

Izolacja frakcji jednojądrzastej
Metoda izolacji komórek jednojądrzastych opiera się na różnej pływalności różnych komórek krwi. Zastosowanie określonego gradientu gęstości umożliwia oddzielenie komórek jednojądrzastych (limfocytów, monocytów,

Cytometrii przepływowej
Cytometria przepływowa opiera się na pomiarze właściwości optycznych komórek. Komórki są wprowadzane pojedynczo do przepływu laminarnego w kwarcowej komorze przepływowej, gdzie przechodzą przez skupione światło

Metoda immunofluorescencji pośredniej
Immunofluorescencja pośrednia to metoda oparta na wykorzystaniu przeciwciał monoklonalnych znakowanych fluorochromem, z oceną wyników z uwzględnieniem specyficznej luminescencji komórek podczas mikroskopii fluorescencyjnej.

Metoda immunocytochemiczna
Metody immunocytochemiczne opierają się na wykorzystaniu enzymów, takich jak peroksydaza i fosfataza alkaliczna. Obecnie najczęściej stosowaną metodą jest PA (peroksydaza-antyperoksydaza), st

Metody badania czynności funkcjonalnej limfocytów
Funkcjonalną aktywność limfocytów ocenia się na podstawie następujących efektów: zdolność rozpoznawania antygenów, aktywacja, proliferacja i różnicowanie komórek. Zdolność limfocytów do

Reakcja transformacji blastycznej limfocytów
Kontaktowi limfocytu z obcym antygenem lub niespecyficznym mitogenem towarzyszy reakcja aktywacji i transformacji blastycznej (RBTL), tj. proliferacja komórek z przejściem małych limfocytów do wybuchu

Hodowla mieszana limfocytów
Kokultywacja limfocytów z cząsteczkami MHC-II o różnych haplotypach powoduje ich transformację blastyczną i proliferację. Komórki odpowiadające to limfocyty T i są stymulowane przez obce

Białka osocza
W ludzkim osoczu obecnych jest ponad dwieście białek, z których większość została wyizolowana i opisana strukturalnie i funkcjonalnie. Białka osocza to głównie glikoproteiny. Z elektrofotografią

Globuliny
α1-antytrypsyna to α1-globulina, która odpowiada za ponad 80% aktywności antyproteazy w surowicy, jest głównym składnikiem prążka α. W sodzie serwatkowej

Globuliny
Haptoglobina - okres półtrwania 2-4 dni. Zawartość haptoglobiny w surowicy jest prawidłowa 0,3 - 2,0 g/l. Jej główne znaczenie funkcjonalne polega na wiązaniu wolnej hemoglobiny w surowicy

Metody elektroforezy białek
Elektroforeza jest szeroko stosowana do półilościowego oznaczania białek surowicy i wykrywania paraprotein. Elektroforezę wykonuje się z użyciem surowicy, a nie osocza, tzw

Immunoglobuliny
Immunoglobuliny (Ig) to specyficzne białka, które są wytwarzane przez układ odpornościowy w wyniku reakcji na obce antygeny i gromadzą się w surowicy krwi i innych płynach biologicznych.

Ludzkie immunoglobuliny
Właściwość IgM IgG IgA IgD IgE Postać cząsteczkowa Pentamer

Metody oznaczania immunoglobulin
Do ilościowego oznaczania zawartości Ig różnych klas w surowicy krwi i innych płynach biologicznych szeroko stosowano różne możliwości ustawienia reakcji wytrącania w żelu.

paraproteiny
Paraproteiny to immunoglobuliny lub ich fragmenty wytwarzane przez komórki plazmatyczne pochodzące z jednej określonej linii komórkowej limfocytów B (monoklon). Paraproteiny często nie

krioglobuliny
Krioglobuliny to patologiczne białka osocza (10-80 mg / ml), które mają właściwość przekształcania się w stan galaretowaty w temperaturach poniżej 37 ° C. Większość krioglobulin to kompleksy poliklonalne

Metody oznaczania kompleksów immunologicznych
Wiązanie Ig z antygenem jest procesem fizjologicznym prowadzącym do powstania kompleksów immunologicznych (IC) mających na celu eliminację antygenu z organizmu. Jednak pod pewnymi warunkami

Oznaczanie autoprzeciwciał w diagnostyce układowych chorób tkanki łącznej
Według współczesnych koncepcji autoimmunizacja odnosi się do takich stanów, w których w organizmie pojawiają się przeciwciała lub uczulone limfocyty przeciwko normalnym antygenom własnych tkanek.

Główne markery serologiczne chorób autoimmunologicznych
Antygen Oryginalna nazwa Struktura molekularna Funkcja Wartość diagnostyczna

Oznaczanie ANA w reakcji immunofluorescencji pośredniej
W typowym teście surowica pacjenta jest inkubowana z substratami antygenowymi (tkanka wątroby lub nerki zwierzęcej, hodowla komórek Hep-2) w celu wywołania swoistego wiązania

Immunofluorescencja pośrednia
Wzorzec oświetlenia Specyficzność antygenowa Znaczenie kliniczne Obwodowy lub brzeżny dsDNA, l

Oznaczanie ANA i ENA metodą ELISA na fazie stałej
System testowy ANA ELISA (UBI MAGIWELL) - do badań przesiewowych w kierunku przeciwciał przeciwjądrowych umożliwia półilościowe oznaczanie szerokiego zakresu przeciwciał wobec kompleksu adsorbowanego w dołkach

choroby autoimmunologiczne
Typ patologii Wyniki badań immunologicznych. Rodzaj przeciwciał i częstość ich występowania (%)

Układ cytokin
Cytokiny to klasa rozpuszczalnych mediatorów peptydowych układu odpornościowego, niezbędnych do jego rozwoju, funkcjonowania i interakcji z innymi układami organizmu. Definiują

Interleukiny
IL-1 jest mediatorem immunoregulacyjnym uwalnianym podczas reakcji zapalnych, uszkodzeń tkanek i infekcji (cytokina prozapalna). IL-1 stymuluje proliferację i różnicowanie

interferony
Interferon (IFN) został odkryty jako białko o działaniu przeciwwirusowym. Działanie przeciwwirusowe IFN wynika z jego zdolności do zapobiegania wewnątrzkomórkowej replikacji wirusa na etapie

Czynniki martwicy nowotworu
Czynnik martwicy nowotworów (TNF) jest głównym mediatorem wytwarzanym przez organizm w odpowiedzi na bakterie Gram-ujemne. Substancją czynną bakterii Gram-ujemnych jest składnik LPS ściany komórkowej.

czynniki stymulujące kolonie
Szereg cytokin powstających podczas rozwoju odpowiedzi immunologicznej ma stymulujący wpływ na różnicowanie prekursorów szpiku kostnego. Te cytokiny nazywane są stymulującymi kolonie

czynniki wzrostowe
Transformujący czynnik wzrostu (TGFβ) to rodzina pokrewnych peptydów o wielorakim wpływie na ogólne procesy regulacji wzrostu i morfogenezy. TGFβ - główny cytok

Metody oznaczania cytokin
Oznaczanie zawartości cytokin w różnych płynach biologicznych ma ogromne znaczenie w ocenie czynności funkcjonalnej komórek immunokompetentnych i regulacji odpowiedzi immunologicznej. W oddzielnych liniach

Układ uzupełniający
Układ dopełniacza jest kompleksem białek surowicy krwi zdolnych do samoorganizacji i pośredniczenia w odporności humoralnej i reakcjach fagocytozy. Obecnie wiadomo, że

Metody oznaczania aktywności dopełniacza
Całkowitą aktywność (miano) dopełniacza określa się w reakcji hemolizy z użyciem erytrocytów baranich. Dopełniacz zawarty w surowicy testowej powoduje hemolizę u uczulonych tryków.

Miano dopełniacza w 50% HE
Hemoliza, % K Hemoliza, % K Hemoliza, % K Hemoliza, % K

Oznaczanie składników dopełniacza
Do oznaczania składowych dopełniacza stosuje się metodę ELISA oraz metodę turbidymetryczną, których wykonanie opisano w instrukcjach dołączonych do diagnostycznych systemów testowych. W praktyce klinicznej dla

Elementy uzupełniające
Składnik dopełniacza Objawy kliniczne Niedobór C1 Zwykle nie powoduje istotnych klinicznie zaburzeń, gdyż zjada

Metody badania aktywności fagocytarnej granulocytów
Najważniejszą cechą funkcji granulocytów jest ocena ich aktywności fagocytującej. Jego spadek może być wynikiem zarówno niedoboru czynników opsonizujących w surowicy (przeciwciała, dopełniacz

Test NST
Test nitrozynowo-tetrazolowy (test NCT) służy do wykrywania tzw. aktywowanych granulocytów i monocytów. Aktywacja fagocytów opiera się na gwałtownym wzroście reakcji oksydacyjnych

Metodologia Badań
Niezbędne odczynniki i materiały: KN 42 ORO 44 0, Na 42 ORO 44 0, NaCl, glukoza, nitrozyna tetrazolowa, heparyna, alkohol metylowy, 1% wodny roztwór zieleni metylenowej (w przypadku

Oznaczanie mieloperoksydazy
Mielooperoksydaza utlenia szereg substratów (benzydynę, ortofenylepiaminę) w obecności nadtlenku wodoru, czemu towarzyszy reakcja barwna. Mieloperoksydaza – enzym występujący w ziarnistościach faga

Chemiluminescencja
Spontaniczna luminescencja, która występuje podczas reakcji chemicznych pod wpływem energii reagujących substancji, nazywana jest chemiluminescencją (CL). Jest nieodłączny we wszystkich tkankach i komórkach żywego organizmu, o ile są

Oznaczanie zawartości IgE
Wśród immunologicznych metod oceny nieswoistych parametrów stanu immunologicznego w większości chorób atopowych największe znaczenie ma oznaczenie ilości IgE całkowitego. Jednakże

Test degranulacji bazofilów
U pacjentów z alergią znaczna część IgE wiąże się z różnymi leukocytami poprzez ich receptory Fc. Obecność komórek zawierających przeciwciała wskazuje na ich uczulenie na odpowiedni alergen. B

Test stymulacji antygenem komórek bazofilów - CAST
W przypadku reakcji alergicznych IgE-zależnych mechanizm wyzwalający rozpoczyna się od związania alergenu ze swoistymi cząsteczkami IgE na powierzchni bazofili lub komórek tucznych. mi

Reakcja hamowania migracji leukocytów
Reakcja ma na celu identyfikację limfocytów uczulonych na rzekomy alergen. Limfocyty uczulone, wchodząc w interakcję z określonym alergenem, uwalniają mediatory (FPML

Zadanie 1
23-letni pacjent skarży się na nawracające czyraki zlokalizowane na twarzy i nogach. Zauważa częste przeziębienia (do 7-8 razy w roku), opryszczkowe wysypki na ustach.

Zadanie nr 2
Pacjent N., lat 22, zgłosił się do immunologa z powodu nawracających ostrych infekcji wirusowych dróg oddechowych (do 7 razy w roku), często z towarzyszącym zaostrzeniem przewlekłego obturacyjnego zapalenia oskrzeli. Przeprowadzony antybakteryjny

Zadanie nr 3
Pacjent T., lat 27, wielokrotnie konsultował się z lekarzem w związku z nawracającymi ostrymi infekcjami wirusowymi dróg oddechowych, zapaleniem tchawicy i oskrzeli, osłabieniem i złym samopoczuciem. Z wywiadu ustalono, że w ciągu roku miał ARVI sześć razy, dwa razy

Zadanie nr 4
Pacjent K, 45 lat. Diagnoza: toczeń rumieniowaty układowy. Badanie immunologiczne wykazało: Leukocyty - 5,5 x 109/l Limfocyty -37%, abs. 2,03x109

Zadanie numer 5
Dziecko 5-letnie należy do grupy dzieci często i długotrwale chorych, nawroty ostrych infekcji wirusowych dróg oddechowych raz w miesiącu, ogniska przewlekłego zakażenia (przewlekłe zapalenie zatok, zapalenie migdałków), powiększone węzły chłonne szyjne

Na badaniu immunologicznym
Testy poziomu 1 Całkowita liczba białych krwinek. Limfocyty T Leukoformula Limfocyty B

Ogólna analiza krwi
Norma Jednostki SI Hemoglobina M F 130,0-160,0 120,0-140,0 g/l

Główne markery CD komórek układu odpornościowego
Marker CD Populacja komórek % komórek CD2 Komórki T i NK

Subpopulacja limfocytów u dzieci
limfocyty 4-5 dni - 3 miesiące 4-8 miesięcy 1-2 lata 2-5 lat powyżej 5 lat Słońce

Poziom immunoglobulin w surowicy krwi osób dorosłych
IgM IgG IgA IgE 1,3-1,7 g/l 12-14 g/l 2,1-2,9 g/l

Panel alergologiczny MAST (wielokrotny test alergosorbcyjny) do wykrywania swoistych immunoglobulin na alergeny różnych grup
Panel spożywczy Ig E Panel rosyjski rozszerzony Ig E Panel spożywczy Ig G Panel uniwersalny rosyjski Ig E

Słownik terminów
Awidność to siła wiązania antygenu z przeciwciałem, która jest określona przez powinowactwo i wartościowość przeciwciał. Aglutynacja - agregacja do

Wykaz skrótów i konwencji
AG – antygen AFC – komórka wytwarzająca przeciwciała APC – komórka prezentująca antygen AT – przeciwciało VLS – odprowadzające naczynie limfatyczne SVC – zakażony wirus

CAD (DNaza aktywowana kaspazą) na fragmenty o wielokrotnościach 180-200 nukleotydów. W wyniku apoptozy powstają ciałka apoptotyczne - pęcherzyki błonowe zawierające integralne organelle i fragmenty chromatyny jądrowej. Ciała te są pobierane przez sąsiednie komórki lub makrofagi poprzez fagocytozę. Ponieważ enzymy komórkowe nie wpływają na macierz zewnątrzkomórkową, nawet przy dużej liczbie komórek apoptotycznych nie obserwuje się stanu zapalnego.

Proces apoptozy jest niezbędny do fizjologicznej regulacji liczby komórek w organizmie, do niszczenia starych komórek, do tworzenia limfocytów, które nie reagują na swoje antygeny (autoantygeny), do jesiennego opadania liści rośliny, na cytotoksyczne działanie limfocytów T-killer, na embrionalny rozwój organizmu (zanik błon skórnych między palcami u zarodków ptaków) i inne.

Naruszenie normalnej apoptozy komórek prowadzi do niekontrolowanej proliferacji komórek i pojawienia się guza.

1. Znaczenie apoptozy

Apoptoza jest integralną częścią życiowej aktywności większości organizmów wielokomórkowych. Odgrywa szczególnie ważną rolę w procesach rozwojowych. Na przykład kończyny czworonogów układają się, gdy rosną w kształcie łopatek, a tworzenie się palców następuje z powodu śmierci komórek między nimi. Komórki, które nie są już potrzebne, również ulegają apoptozie, dlatego ogon u kijanek jest niszczony zwłaszcza podczas metamorfozy. W tkance nerwowej kręgowców podczas rozwoju embrionalnego ponad połowa neuronów umiera w wyniku apoptozy natychmiast po utworzeniu.

Również apoptoza jest częścią systemu kontroli „jakości” komórek, pozwala niszczyć te, które są nieprawidłowo zlokalizowane, uszkodzone, niefunkcjonalne lub potencjalnie niebezpieczne dla organizmu. Przykładem są limfocyty B, które umierają, jeśli nie mają przydatnych receptorów specyficznych dla antygenu lub są autoreaktywne. W wyniku apoptozy większość limfocytów, które są aktywowane podczas infekcji, umiera również po jej pokonaniu.

W organizmach dorosłych jednoczesna regulacja proliferacji i apoptozy komórek umożliwia zachowanie wielkości całego osobnika i jego poszczególnych narządów. Na przykład, po wszczepieniu leku fenobarbitalu, który stymuluje proliferację hepatocytów, wątroba zwiększa się u szczurów. Jednak natychmiast po ustaniu działania tej substancji wszystkie nadmiarowe komórki ulegają apoptozie, w wyniku czego wielkość wątroby wraca do normy.

Apoptoza występuje również wtedy, gdy komórka „odczuwa” dużą ilość wewnętrznych uszkodzeń, których nie jest w stanie naprawić. Na przykład w przypadku uszkodzenia DNA komórka może przekształcić się w komórkę nowotworową, dzięki czemu tak się nie stanie, w normalnych warunkach „popełnia samobójstwo”. Ponadto duża liczba komórek zakażonych wirusami umiera w wyniku apoptozy.

2. Markery komórek apoptotycznych

Markery apoptozy

Wykrywanie fragmentacji DNA w komórkach apoptotycznych metodą TUNEL Preparacja tkanki wątroby myszy, jądro komórki apoptotycznej ma brązową barwę, mikroskopia optyczna.

Wykrywanie fragmentacji DNA w komórkach apoptotycznych metodą elektroforezy w żelu agarozowym. Po lewej: DNA wyizolowane z komórek apoptotycznych - widoczna „drabina DNA”; środek: znaczniki; przypadek: kontrolna próbka DNA z komórek nietraktowanych. Linia komórkowa H4IIE (wątrobiak szczura), induktor apoptozy - parakwat, wizualizacja bromkiem etydyny.

Góra: Wykrywanie kondensacji i fragmentacji chromatyny przez barwienie barwnikiem fluorescencyjnym (Hoechst 34580). Środek: Wykrywanie translokacji fosfadydyloseryny do zewnętrznej ulotki plazmalemmy przez barwienie aneksyną V. Dół: Mikrofotografia komórek apoptotycznych w jasnym polu. linia komórkowa - Jurkat, induktor apoptozy - TRAIL, konfokalny i mikroskopii optycznej piły świetlnej.

Komórki, które umierają w wyniku apoptozy, można rozpoznać po wielu cechach morfologicznych. Stają się mniejsze i gęstsze (piknoza), zaokrąglają się i tracą pseudopodia, zapada się w nich cytoszkielet, rozpada się błona jądrowa, kondensuje i rozpada się chromatyna. Na powierzchni komórek pojawia się duża liczba pęcherzyków, jeśli komórki są wystarczająco duże, wówczas rozpadają się na fragmenty otoczone błonami – ciała apoptotyczne.

W komórkach apoptotycznych oprócz zmian morfologicznych zachodzi również duża liczba zmian biochemicznych. W szczególności DNA jest cięte przez specjalne nukleazy w regionach łącznikowych między nukleosomami na fragmenty o równej długości. Dlatego podczas rozdzielania całego DNA komórki apoptotycznej za pomocą elektroforezy można zaobserwować charakterystyczną „drabinkę”. Inną metodą wykrywania fragmentacji DNA jest oznaczanie jego wolnych końców metodą TUNEL ( T terminalna transferaza deoksynukleotydylowa d u TP N ck mi nd l abeling ) .

Błona plazmatyczna komórek apoptotycznych również ulega zmianom. W normalnych warunkach ujemnie naładowana fosfolipidowa fosfatydyloseryna zawarta jest tylko w jej wewnętrznej (zawracanej do cytozolu) warstwie, ale podczas apoptozy „wskakuje” do zewnętrznej ulotki. Ta cząsteczka służy jako sygnał „zjedz mnie” dla pobliskich fagocytów. Indukowany fosfatydyloseryną wychwyt komórek apoptotycznych, w przeciwieństwie do innych rodzajów fagocytozy, nie powoduje uwolnienia mediatorów stanu zapalnego. Opisana zmiana w błonie plazmatycznej leży u podstaw innej metody wykrywania komórek umierających na drodze apoptozy – barwienia aneksyną V, która specyficznie wiąże się z fosfatydyloseryną.

3. Kaspaza - mediatory apoptozy

Układy komórkowe zapewniające przejście apoptozy są podobne u wszystkich zwierząt, a rodzina białek kaspaz zajmuje w nich centralne miejsce. Kaspazy to proteazy, które w swoim miejscu aktywnym posiadają resztę cysteiny i tną swoje substraty na określoną resztę kwasu asparaginowego (stąd nazwa: C z cysteina I żmija z kwas asparaginowy). Kaspazy są syntetyzowane w komórce w postaci nieaktywnych prokaspaz, które mogą stać się substratami dla innych już aktywowanych kaspaz, które przecinają je w jednym lub dwóch miejscach przy reszcie asparaginianu. Dwa uformowane fragmenty – większy i mniejszy – są ze sobą połączone, tworząc dimer, który łączy się z tym samym dimmerem. Powstały w ten sposób tetramer jest aktywną proteazą, która może ciąć białka substratowe. Oprócz regionów odpowiadających większym i mniejszym podjednostkom, prokaspazy czasami zawierają również prodomeny hamujące, które po rozszczepieniu ulegają degradacji.

W wyniku rozszczepienia i aktywacji jednych kaspaz przez inne powstaje kaskada proteatyczna, która znacznie wzmacnia sygnał i sprawia, że ​​apoptoza jest procesem nieodwracalnym od pewnego momentu. Te prokaspazy, które rozpoczynają tę kaskadę, nazywane są inicjującymi, a ich substraty efektorowymi. Po aktywacji kaspazy efektorowe mogą rozszczepiać inne prokaspazy efektorowe lub białka docelowe. Celem niszczonych podczas apoptozy kaspaz efektorowych są w szczególności białka blaszki jądrowej, których rozszczepienie prowadzi do rozpadu tej struktury. Rozkłada również białko, w normalnych warunkach hamuje endonukleazy CAD, w wyniku czego rozpoczyna się fragmentacja DNA. Kaspaza oraz cytoszkieletowe i międzykomórkowe białka adhezyjne ulegają rozszczepieniu, w wyniku czego komórki apoptotyczne zaokrąglają się i odrywają od sąsiednich komórek, stając się tym samym łatwiejszym celem dla fagocytów.

Zestaw kaspaz wymaganych do przebiegu apoptozy zależy od typu tkanki i szlaku aktywacji śmierci komórki. Na przykład u myszy, gdy gen kodujący kaspazy efektorowe-3 jest „wyłączony”, apoptoza nie zachodzi w mózgu, ale normalnie postępuje w innych tkankach.

Geny prokaspazy są aktywne w zdrowych komórkach, dlatego białka są niezbędne do zajścia apoptozy i są stale obecne, tylko ich aktywacja jest potrzebna do wywołania samobójstwa komórki. Prokaspazy inicjujące obejmują długą prodomenę zawierającą CARD ( domena rekrutacyjna kaspazy , domena przyciągania kaspazy). CARD umożliwia inicjatorom prokaspazy przyłączanie się do białek adaptorowych w celu utworzenia kompleksów aktywacyjnych, gdy komórka otrzymuje sygnał stymulujący apoptozę. W kompleksach aktywacyjnych kilka cząsteczek pro-kaspazy znajduje się blisko siebie, co wystarczy, aby przeszły w stan aktywny, po czym przecinają się.

Dwa najlepiej poznane szlaki sygnałowe aktywacji kaskady kaspazy w komórkach ssaków nazywane są zewnętrznym i wewnętrznym (mitochondrialnym), z których każdy wykorzystuje własną inicjatorową prokaspazę.

4. Sposoby aktywacji apoptozy

4.1. ścieżka zewnętrzna

Komórka może otrzymać sygnał indukujący apoptozę z zewnątrz, na przykład z limfocytów cytotoksycznych. W takim przypadku aktywowana jest tak zwana ścieżka zewnętrzna ( ścieżka zewnętrzna) Zaczynając od receptorów śmierci. Receptory śmierci to białka transbłonowe należące do rodziny receptorów czynnika martwicy nowotworu (TNF), takie jak sam receptor TNF i receptor śmierci Fas. Tworzą homotrimery, w których każdy monomer ma zewnątrzkomórkową domenę wiążącą ligand, domenę transbłonową i cytoplazmatyczną domenę śmierci, przyciąga i aktywuje prokaspazy poprzez białka adaptorowe.

Ligandy receptora śmierci są również homotrimeramami. Są one ze sobą spokrewnione i należą do rodziny cząsteczek sygnalizujących czynnik martwicy nowotworu. Na przykład limfocyty cytotoksyczne niosą na swojej powierzchni ligandy Fas, które mogą wiązać się z receptorami śmierci Fas na plazmalemmie komórek docelowych. W tym przypadku domeny wewnątrzkomórkowe tych receptorów są połączone z białkiem adaptorowym ( FADD, domena śmierci związana z Fas ), a one z kolei przyciągają inicjacją prokaspazy 8 i/lub 10. W wyniku tej serii zdarzeń powstaje indukujący śmierć kompleks sygnalizacyjny - DISC ( kompleks sygnalizacyjny wywołujący śmierć ). Po aktywacji w tym kompleksie przez kaspazy inicjatorowe rozszczepiają prokaspazy efektorowe i wyzwalają kaskadę apoptozy.

Wiele komórek syntetyzuje cząsteczki, które w pewnym stopniu chronią je przed aktywacją zewnętrznego szlaku apoptozy. Przykładem takiej ochrony byłaby ekspresja tzw. receptorów wabików ( receptory wabika), które mają pozakomórkowe domeny wiążące ligandy, ale nie domeny śmierci cytoplazmatycznej, a zatem nie mogą wywoływać apoptozy i konkurować z konwencjonalnymi receptorami śmierci o ligandy. Komórki mogą również wytwarzać białka, które blokują zewnętrzną ścieżkę apoptozy, takie jak FLIP, który ma podobną strukturę do prokaspaz 8 i 10, ale nie ma aktywności proteolitycznej. Hamuje wiązanie prokaspaz inicjatora z kompleksem DISC.

4.2. Wewnętrzna ścieżka

apoptosom

Apoptozę można również wywołać z wnętrza komórki, na przykład w przypadku uszkodzenia komórki, uszkodzenia DNA, braku tlenu, składników odżywczych lub pozakomórkowych sygnałów przeżycia. U kręgowców ten szlak sygnałowy nazywany jest wewnętrznym ( ścieżka wewnętrzna) Lub mitochondrialne, kluczowym zdarzeniem jest uwolnienie pewnych cząsteczek z przestrzeni międzybłonowej mitochondriów. Cychrom c leży przed taką cząsteczką zocremy, która wchodzi do lancy transportującej elektrony mitochondriów, białko w cytoplazmie pełni inną funkcję - dochodzi do białka adaptera Apaf ( czynnik aktywujący proteazę apoptotyczną l ), powodując jego oligomeryzację w siedmioczłonową strukturę w kształcie koła zwaną apoptosomem. Apoptosom rekrutuje i aktywuje inicjator prokaspazy-9, który może następnie aktywować inicjator prokaspazy.

W niektórych komórkach zewnętrzny szlak apoptozy musi aktywować wewnętrzny szlak, aby skutecznie zniszczyć komórkę. Szlak wewnętrzny jest w dużym stopniu regulowany przez białka z rodziny Bcl-2.

4.2.1. Regulacja szlaku wewnętrznego przez białka z rodziny Bcl-2

Rodzina Bcl-2 obejmuje konserwowane ewolucyjnie białka, których główną funkcją jest regulacja uwalniania cytochromu c i innych cząsteczek z przestrzeni międzybłonowej mitochondriów. Wśród nich są molekuły proapoptotyczne i antyapoptotyczne, które mogą oddziaływać ze sobą w różnych kombinacjach, hamując się nawzajem, zachowując równowagę między swoją aktywnością i determinując losy komórki.

Obecnie znanych jest około 20 białek z tej rodziny, z których wszystkie zawierają co najmniej jedną z czterech alfa-helikalnych domen homologicznych Bcl2 zwanych BH1-4 ( homologia bcl2). Białka antyapoptotyczne z rodziny Bcl2 zawierają wszystkie cztery domeny, w tym sam Bcl-2, a także Bcl-X L, Bcl-w, Mcl-1 i A1. Białka proapoptotyczne dzielą się na dwie grupy, z których pierwsza zawiera trzy domeny BH (BH1-3), są to w szczególności Bak, Bax i Bok (ten ostatni jest wyrażany tylko w tkankach narządów rozrodczych) . Najliczniejsza spośród rodziny Bcl-2 jest druga grupa białek proapoptotycznych, które zawierają tylko domenę BH3 (BH3-only), obejmuje Bim, Bid, Bad, Bik/Nbk, Bmf, Nix/BNIP3, Hrk, Noxa, Puma.

W normalnych warunkach (tj. gdy komórka nie przechodzi apoptozy) białka antyapoptotyczne, takie jak Bcl-2 i Bcl-XL, wiążą się z proapoptotycznymi białkami BH123 (Bax i Bak) i zapobiegają ich polimeryzacji w zewnętrznej błonie mitochondrialnej tworzyć pory. W wyniku działania określonego bodźca apoptotycznego białka proapoptotyczne zawierające tylko domenę BH3 zostają aktywowane lub zaczynają być syntetyzowane w komórce. Te z kolei hamują białka antyapoptotyczne, usuwając hamujący wpływ na Bak i Bax lub oddziałują bezpośrednio z tymi ostatnimi i promują ich oligomeryzację i tworzenie porów. Ze względu na przepuszczalność błony zewnętrznej do cytozolu przedostaje się cytochrom c, podobnie jak inne mediatory apoptozy, takie jak AIF. czynnik indukujący apoptozę ).

Na przykład, gdy w komórce brakuje sygnałów przeżycia, kinaza MAP JNK aktywuje ekspresję białka BH3 Bim, które wyzwala wewnętrzny szlak apoptozy. W przypadku uszkodzenia DNA gromadzi się supresor guza p53, który stymuluje transkrypcję genów kodujących białka BH3 Puma i Noxa, które również zapewniają przejście apoptozy. Inne białko BH3, Bid, zapewnia połączenie między zewnętrznymi i wewnętrznymi szlakami apoptozy. Po aktywacji receptorów śmierci iw efekcie kaspazy-8, ta ostatnia rozszczepia Bid, tworząc okrojoną postać tBid (obcięty Bid), która przemieszcza się do mitochonrii, gdzie hamuje Bcl-2.