Bezpośrednie i pośrednie metody badań wirusologicznych. Metody badań wirusologicznych w mikrobiologii

Metody badań wirusologicznych- metody badania biologii wirusów i ich identyfikacji. W wirusologii szeroko stosowane są metody biologii molekularnej, za pomocą których możliwe było ustalenie struktury molekularnej cząstek wirusa, sposobu ich przenikania do komórki oraz cech reprodukcji wirusów, podstawowej struktury wirusowych kwasów nukleinowych i białka. Opracowywane są metody określania sekwencji elementów składowych wirusowych kwasów nukleinowych i aminokwasów białkowych. Możliwe staje się powiązanie funkcji kwasów nukleinowych i kodowanych przez nie białek z sekwencją nukleotydową oraz ustalenie przyczyn procesów wewnątrzkomórkowych, które odgrywają ważną rolę w zakażeniu e-wirusem.

Metody badań wirusologicznych opierają się również na procesach immunologicznych (oddziaływanie antygenu z przeciwciałami), właściwościach biologicznych wirusa (zdolność do hemaglutynacji, hemolizy, aktywność enzymatyczna), cechach interakcji wirusa z komórką gospodarza (charakter cytopatycznej efekt, powstawanie inkluzji wewnątrzkomórkowych itp.).

W diagnostyce zakażeń wirusowych, w hodowli, izolacji i identyfikacji wirusów, a także w przygotowywaniu preparatów szczepionkowych, szeroko stosowana jest metoda hodowli tkankowych i komórkowych. Stosuje się pierwotne, wtórne, stabilne ciągłe i diploidalne hodowle komórkowe. Hodowle pierwotne uzyskuje się przez dyspersję tkanki za pomocą enzymów proteolitycznych (trypsyna, kolagenaza). Źródłem komórek mogą być tkanki i narządy (częściej nerki) zarodków ludzkich i zwierzęcych. Zawiesinę komórek w pożywce umieszcza się w tzw. materacach, butelkach lub szalkach Petriego, gdzie po przyczepieniu się do powierzchni naczynia komórki zaczynają się namnażać. W przypadku infekcji wirusowej zwykle stosuje się pojedynczą warstwę komórek. Pożywkę odsącza się, wprowadza zawiesinę wirusową w określonych rozcieńczeniach, a po kontakcie z komórkami dodaje świeżą pożywkę, zwykle bez surowicy.

Komórki z większości kultur pierwotnych można hodować podhodowle i są one określane jako kultury wtórne. Wraz z dalszym pasażem komórek tworzy się populacja komórek podobnych do fibroblastów, zdolnych do szybkiego rozmnażania, z których większość zachowuje oryginalny zestaw chromosomów. Są to tak zwane komórki diploidalne. W seryjnej hodowli komórek uzyskuje się stabilne ciągłe hodowle komórkowe. Podczas pasaży pojawiają się szybko dzielące się jednorodne komórki z heteroploidalnym zestawem chromosomów. Stabilne linie komórkowe mogą być jednowarstwowe i zawiesinowe. Kultury jednowarstwowe rosną w postaci ciągłej warstwy na powierzchni szkła, kultury zawiesinowe rosną w postaci zawiesin w różnych naczyniach przy użyciu mieszadeł. Istnieje ponad 400 linii komórkowych pochodzących od 40 różnych gatunków zwierząt (w tym naczelnych, ptaków, gadów, płazów, ryb, owadów) i ludzi.

Kawałki poszczególnych narządów i tkanek (hodowle narządów) można hodować w sztucznych pożywkach. Tego typu hodowle zachowują strukturę tkankową, co jest szczególnie ważne przy izolacji i pasażu wirusów, które nie namnażają się w niezróżnicowanych kulturach tkankowych (np. koronawirusy).

W zainfekowanych hodowlach komórkowych wirusy można wykryć na podstawie zmiany morfologii komórki, działania cytopatycznego, które może być specyficzne, pojawienia się inkluzji, poprzez określenie antygenów wirusowych w komórce iw płynie hodowlanym; określanie właściwości biologicznych potomstwa wirusów w płynach hodowlanych i miareczkowanie wirusów w hodowlach tkankowych, zarodkach kurzych lub zwierzętach wrażliwych; poprzez wykrywanie pojedynczych wirusowych kwasów nukleinowych w komórkach metodą hybrydyzacji molekularnej lub skupisk kwasów nukleinowych metodą cytochemiczną przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.

Izolacja wirusów to żmudny i długotrwały proces. Jest przeprowadzany w celu określenia typu lub wariantu wirusa krążącego w populacji (na przykład w celu identyfikacji serowariantu wirusa a, dzikiego lub szczepionkowego szczepu wirusa a itp.); w przypadkach, gdy jest to niezbędne do podjęcia pilnych działań epidemiologicznych; gdy pojawiają się nowe typy lub warianty wirusów; w razie potrzeby potwierdź wstępną diagnozę; do oznaczania wirusów w obiektach środowiskowych. Przy izolacji wirusów bierze się pod uwagę możliwość ich przetrwania w organizmie człowieka, a także wystąpienie zakażenia mieszanego wywołanego przez dwa lub więcej wirusów. Genetycznie jednorodna populacja wirusa uzyskana z pojedynczego wirionu nazywana jest klonem wirusowym, a proces jej uzyskiwania nazywany jest klonowaniem.

Do izolacji wirusów stosuje się infekcję podatnych zwierząt laboratoryjnych, zarodki kurze, ale najczęściej stosuje się hodowlę tkankową. Obecność wirusa jest zwykle określana przez specyficzną degenerację komórek (efekt cytopatyczny),

tworzenie symplastów i syncytii, wykrywanie inkluzji wewnątrzkomórkowych, a także wykrywanie specyficznego antygenu za pomocą immunofluorescencji, hemadsorpcji, hemaglutynacji (w wirusach hemaglutynujących) itp. Objawy te można wykryć dopiero po 2-3 pasażach wirusa.

Do izolacji wielu wirusów, na przykład wirusów, stosuje się zarodki kurze, do izolacji niektórych wirusów Coxsackie i szeregu arbowirusów - nowonarodzonych myszy. Identyfikacja izolowanych wirusów odbywa się za pomocą testów serologicznych i innych metod.

Podczas pracy z wirusami określa się ich miano. Miareczkowanie wirusów przeprowadza się zwykle w hodowli tkankowej, określając największe rozcieńczenie płynu zawierającego wirusa, przy którym dochodzi do degeneracji tkanki, tworzenia się inkluzji i antygenów specyficznych dla wirusa. Metodę łysinkową można stosować do miareczkowania wielu wirusów. Łysinki lub ujemne kolonie wirusów są ogniskami komórek zniszczonych przez wirusy w jednowarstwowej hodowli tkankowej pod powłoką agarową. Liczenie kolonii umożliwia ilościową analizę zakaźnej aktywności wirusów na podstawie tego, że jedna zakaźna cząsteczka wirusa tworzy jedną łysinę. Płytki identyfikuje się przez barwienie hodowli barwnikami witalnymi, zwykle neutralną czerwienią; płytki nie adsorbują barwnika i dlatego są widoczne jako jasne plamki na tle wybarwionych żywych komórek. Miano wirusa wyraża się jako liczbę jednostek tworzących łysinki w 1 ml.

Oczyszczanie i zatężanie wirusów zwykle prowadzi się przez ultrawirowanie różnicowe, po którym następuje wirowanie w gradiencie stężenia lub gęstości. Do oczyszczania wirusów stosuje się metody immunologiczne, chromatografię jonowymienną, immunosorbenty itp.

Diagnostyka laboratoryjna infekcji wirusowych obejmuje wykrycie patogenu lub jego składników w materiale klinicznym; izolacja wirusa z tego materiału; serodiagnostyka. Wybór metody diagnostyki laboratoryjnej w każdym indywidualnym przypadku zależy od charakteru choroby, okresu jej trwania oraz możliwości laboratorium. Nowoczesna diagnostyka infekcji wirusowych opiera się na ekspresowych metodach, które pozwalają uzyskać odpowiedź w kilka godzin po pobraniu materiału klinicznego we wczesnych stadiach po chorobie, do których należą elektronowa i immunologiczna mikroskopia elektronowa,

a także immunofluorescencja, metoda hybrydyzacji molekularnej, wykrywanie przeciwciał klasy IgM itp.

Mikroskopia elektronowa zabarwionych ujemnie wirusów umożliwia różnicowanie wirusów i określanie ich stężenia. Zastosowanie mikroskopii elektronowej w diagnostyce infekcji wirusowych ogranicza się do przypadków, w których stężenie cząstek wirusowych w materiale klinicznym jest wystarczająco wysokie (10 5 w 1 ml i wyżej). Wadą metody jest brak możliwości rozróżnienia wirusów należących do tej samej grupy taksonomicznej. Ta wada jest eliminowana przez zastosowanie immunologicznej mikroskopii elektronowej. Metoda opiera się na tworzeniu kompleksów immunologicznych w wyniku dodania do cząstek wirusowych swoistej surowicy, przy równoczesnym zatężeniu cząstek wirusowych, co umożliwia ich identyfikację. Metodę stosuje się również do wykrywania przeciwciał. W celu szybkiej diagnostyki przeprowadza się badanie mikroskopem elektronowym ekstraktów tkankowych, kału, płynu z pęcherzyków i wydzielin z nosogardzieli. Mikroskopia elektronowa jest szeroko stosowana do badania morfogenezy wirusa, a jej możliwości są poszerzane o znakowane przeciwciała.

Metoda hybrydyzacji molekularnej, oparta na wykrywaniu specyficznych dla wirusa kwasów nukleinowych, umożliwia wykrywanie pojedynczych kopii genów i nie ma sobie równych pod względem czułości. Reakcja polega na hybrydyzacji komplementarnych nici DNA lub RNA (sondy) i tworzeniu struktur dwuniciowych. Najtańszą sondą jest sklonowany rekombinowany DNA. Sonda jest znakowana radioaktywnymi prekursorami (zwykle radioaktywnym fosforem). Zastosowanie reakcji kolorymetrycznych jest obiecujące. Istnieje kilka wariantów hybrydyzacji molekularnej: hybrydyzacja punktowa, hybrydyzacja blot, hybrydyzacja kanapkowa, hybrydyzacja in situ itp.

Przeciwciała klasy IgM pojawiają się wcześniej niż przeciwciała klasy G (w 3-5 dniu choroby) i znikają po kilku tygodniach, więc ich wykrycie wskazuje na świeżą infekcję. Przeciwciała klasy IgM są wykrywane za pomocą immunofluorescencji lub testu immunoenzymatycznego przy użyciu surowic odpornościowych anty-m (surowice anty-IgM z łańcuchem ciężkim).

Metody serologiczne w wirusologii opierają się na klasycznych reakcjach immunologicznych (zob. Metody badań immunologicznych ): reakcje wiązania dopełniacza

hamowanie hemaglutynacji, neutralizacja biologiczna, immunodyfuzja, hemaglutynacja pośrednia, hemoliza radialna, immunofluorescencja, immunoenzymatyczny test radioimmunologiczny. Opracowano mikrometody wielu reakcji, a ich techniki są stale udoskonalane. Metody te służą do identyfikacji wirusów przy użyciu zestawu znanych surowic oraz do serodiagnostyki w celu określenia wzrostu przeciwciał w drugiej surowicy w porównaniu z pierwszą (pierwszą surowicę pobiera się w pierwszych dniach po chorobie, drugą - po 2-3 tygodnie). Wartość diagnostyczna to nie mniej niż czterokrotny wzrost przeciwciał w drugiej surowicy. Jeśli wykrycie przeciwciał klasy IgM wskazuje na niedawną infekcję, wówczas przeciwciała klasy IgC utrzymują się przez kilka lat, a czasem do końca życia.

Aby zidentyfikować poszczególne antygeny wirusów i przeciwciał przeciwko nim w złożonych mieszaninach bez uprzedniego oczyszczania białek, stosuje się immunoblotting. Metoda łączy frakcjonowanie białek za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z późniejszym oznaczeniem immunologicznym białek za pomocą testu immunoenzymatycznego. Separacja białek zmniejsza wymagania dotyczące czystości chemicznej antygenu i umożliwia identyfikację poszczególnych par antygen-przeciwciało. Zadanie to ma znaczenie np. w serodiagnostyce zakażenia wirusem HIV, gdzie fałszywie dodatnie reakcje immunoenzymatyczne wynikają z obecności przeciwciał przeciwko antygenom komórkowym, które są obecne w wyniku niedostatecznego oczyszczenia białek wirusowych. Identyfikacja przeciwciał w surowicach pacjentów na wewnętrzne i zewnętrzne antygeny wirusowe umożliwia określenie stopnia zaawansowania choroby, aw analizie populacji – zmienności białek wirusowych. Immunoblotting w zakażeniu wirusem HIV jest stosowany jako test potwierdzający wykrywanie poszczególnych antygenów wirusowych i przeciwciał przeciwko nim. Podczas analizy populacji metoda służy do określenia zmienności białek wirusowych. Ogromną wartością metody jest możliwość analizy antygenów syntetyzowanych techniką rekombinacji DNA, określenie ich wielkości oraz obecności determinant antygenowych.

Bibliografia: Bukrinskaja A.G. Wirusologia, M., 1986; Wirusologia, metody, wyd. B. Meikhi, przeł. z angielskiego, M., 1988; Podręcznik mikrobiologicznych i wirusologicznych metod badawczych, wyd. MO Birger, M., 1982.

Badania w diagnostyce chorób o charakterze wirusowym. Jest to konieczne, aby zidentyfikować wirusa, zbadać jego biologię i zdolność do oddziaływania na komórki zwierzęce i ludzkie. W ten sposób możliwe staje się zrozumienie patogenezy chorób wirusowych i odpowiednio dobranie odpowiedniej metody leczenia.

Jaka jest diagnoza?

w żywych komórkach. Aby to zbadać, konieczne jest wyhodowanie go na poziomie organizmu eksperymentalnego lub W tym celu metody badań wirusologicznych są przeprowadzane w praktyce medycznej i ogólnie w mikrobiologii, które mają następujące główne podejścia:

• prosty;
• pośredni;
• serologiczny.

Materiał można zbadać bezpośrednio na obecność kwasów nukleinowych, antygenu wirusowego lub np. w celu wyizolowania i identyfikacji wirusa z materiału klinicznego.

Oprócz możliwości ustalenia etiologii choroby, monitorowania efektu terapeutycznego, ważną rolę w działaniach przeciwepidemicznych odgrywają metody badań wirusologicznych. Do izolacji i wykorzystania zarodków kurzych, zwierząt laboratoryjnych lub kultur komórkowych.

Jak są badane?

Najszybsza jest metoda bezpośrednia. Pozwala wykryć wirusa, antygen lub NA (kwas nukleinowy) w samym materiale klinicznym. Trwa od dwóch godzin do jednego dnia.

1. EM - mikroskopia elektronowa. Wykrywa wirusa bezpośrednio.
2. IEM - immunologiczna mikroskopia elektronowa. Wykorzystuje specyficzne przeciwciała przeciwko wirusom.
3. RIF - reakcja immunofluorescencyjna. Wykorzystuje przeciwciała związane z barwnikiem. Takie metody badań wirusologicznych są szeroko stosowane do szybkiego rozszyfrowania etiologii SARS (ostre wirusowe infekcje dróg oddechowych), gdy pobiera się wymazy z błony śluzowej górnych dróg oddechowych.
4. ELISA - test immunoenzymatyczny - oznaczanie antygenów wirusowych, podobny do RIF, ale oparty na znakowaniu enzymatycznym przeciwciał.
5. RIA - test radioimmunologiczny. Wykorzystuje radioizotopowe znakowanie przeciwciał, aby zapewnić wysoką czułość wykrywania antygenów wirusowych.
6. Hybrydyzacja molekularna - NK lub izolacja genomów wirusów metodą PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy).
7. Cytologia - rzadko stosowana, ale w przypadku niektórych infekcji te wirusologiczne metody badań są bardzo skuteczne. Badane są materiały biopsyjne, sekcje zwłok i rozmazy przygotowane do barwienia i analizy pod mikroskopem.

Jaki jest sens badań?

W celu pomyślnej izolacji wirusów pobiera się materiał kliniczny zgodnie z patogenezą i tak wcześnie, jak to możliwe. Często proces ten wymaga kilku pasaży przed zastosowaniem pewnych testów wirusologicznych.

Mikrobiologia to nauka o mikroskopijnych istotach. A jej dziedzina to nie tylko medycyna. Jest nauką podstawową dla rolnictwa, weterynarii, przemysłu kosmicznego i technicznego oraz geologii.

Ale oczywiście wszystko jest stworzone dla człowieka i jego rozwoju na tej pięknej planecie. Dlatego bardzo ważne jest, aby wykryć zagrożenie na czas i je zneutralizować. Wirusy różnią się od bakterii. Są to struktury, które dostają się do organizmu i powodują powstawanie nowej generacji. Wyglądają jak kryształy i mają na celu kontrolowanie procesu ich rozmnażania, chociaż same nie odżywiają się, nie rosną i nie wydalają produktów przemiany materii.

Wirus może wywołać poważną chorobę w każdym żywym organizmie, do którego się przedostanie. Co więcej, może ewoluować. Dlatego wirusologiczne metody badawcze w mikrobiologii muszą być rozwijane i ulepszane, ponieważ cała cywilizacja ludzka może być zagrożona.

materiały

Aby wykryć i zidentyfikować wirusy w medycynie, z reguły biorą:

• płukanie jamy nosowo-gardłowej (infekcje dróg oddechowych);
• uderzenia gorąca i kał (infekcje enterowirusowe);
• zeskrobiny, zawartość pęcherzyków (zmiany skórne, błony śluzowe, np. opryszczka, ospa wietrzna);
• uderzenia gorąca (zakażenia osutkami, takie jak odra, różyczka);
• krew, płyn mózgowo-rdzeniowy (zakażenia arbowirusowe).

Fazy

Wszystkie etapy metody badań wirusologicznych obejmują:

• gromadzenie materiałów;
• selekcja, uzyskanie systemu testowego, określenie jego żywotności;
• infekcja systemu testowego;
• wskazanie wirusa;
• określenie rodzaju wirusa.

Zasadniczo wirusy chorobotwórcze różnią się obecnością tkanki i specyficznością typu. Weźmy na przykład wirusa polio, który rozmnaża się tylko u naczelnych (w ich komórkach). W związku z tym do wyizolowania określonego wirusa stosuje się określoną hodowlę tkankową. Jeśli mówimy o nieznanym patogenie, wskazane byłoby jednoczesne zakażenie trzech, a najlepiej czterech hodowli komórkowych.

Być może więc któryś z nich będzie wrażliwy. Aby określić obecność wirusa w zainfekowanych hodowlach, należy przyjrzeć się rozwojowi specyficznej degeneracji komórek, inkluzjom wewnątrzkomórkowym, wykryciu określonego antygenu, dodatnim testom hemaglutynacji i hemadsorpcji.

Wszystkie metody badań wirusologicznych (bezpośrednie i pośrednie, serologiczne) powinny być wybrane jako najbardziej odpowiednie dla konkretnego przypadku podejrzenia zakażenia.

Metody pośrednie opierają się na izolacji i identyfikacji wirusa. Są pracochłonne, długie, ale dokładne.

Serodiagnostyka

Diagnoza ta odnosi się do metody opartej na reakcji antygen-przeciwciało. Najczęściej stosuje się sparowane surowice krwi, pobierane w odstępach kilku tygodni. Jeśli wzrost miana przeciwciał jest 4 lub więcej razy, reakcję uważa się za pozytywną. Aby określić specyficzność typu wirusa, stosuje się test neutralizacji wirusa. Aby określić specyficzność grupy, musisz uzyskać reakcję wiązania dopełniacza.

Szeroko stosowane są różne warianty enzymatycznego testu immunologicznego, reakcja hamowania hemaglutynacji, hemaglutynacja pasywna, odwrotna hemaglutynacja pasywna, RIF. Nawet w inżynierii genetycznej opracowano metodę otrzymywania przeciwciał monoklonalnych. Wąską specyficzność monoklonów można przezwyciężyć, stosując kilka przeciwciał monoklonalnych przeciwko różnym determinantom wirusowym. Tym samym zwiększono swoistość i czułość testu z oznaczaniem antygenów.

Niektóre funkcje

Obecnie stworzono wiele różnych systemów testowych do diagnostyki immunologicznej zakażeń powstałych na skutek wniknięcia wirusa do żywego organizmu.

Tak więc wirusologiczne metody badawcze to metody izolowania wirusów, badania ich właściwości i ustalania ich związku etiologicznego z niektórymi chorobami.

Metody badań wirusologicznych— metody badania biologii wirusów i ich identyfikacji. W wirusologii szeroko stosowane są metody biologii molekularnej, za pomocą których możliwe było ustalenie struktury molekularnej cząstek wirusa, sposobu ich przenikania do komórki oraz cech reprodukcji wirusów, podstawowej struktury wirusowych kwasów nukleinowych i białka. Opracowywane są metody określania sekwencji elementów składowych wirusowych kwasów nukleinowych i aminokwasów białkowych. Możliwe staje się powiązanie funkcji kwasów nukleinowych i kodowanych przez nie białek z sekwencją nukleotydową oraz ustalenie przyczyn procesów wewnątrzkomórkowych, które odgrywają ważną rolę w patogenezie infekcji wirusowej.

Metody badań wirusologicznych opierają się również na procesach immunologicznych (oddziaływanie antygenu z przeciwciałami), właściwościach biologicznych wirusa (zdolność do hemaglutynacji, hemolizy, aktywność enzymatyczna), cechach interakcji wirusa z komórką gospodarza (charakter cytopatycznej efekt, powstawanie inkluzji wewnątrzkomórkowych itp.).

W diagnostyce zakażeń wirusowych, w hodowli, izolacji i identyfikacji wirusów, a także w przygotowywaniu preparatów szczepionkowych, szeroko stosowana jest metoda hodowli tkankowych i komórkowych. Stosuje się pierwotne, wtórne, stabilne ciągłe i diploidalne hodowle komórkowe. Hodowle pierwotne uzyskuje się przez dyspersję tkanki za pomocą enzymów proteolitycznych (trypsyna, kolagenaza). Źródłem komórek mogą być tkanki i narządy (częściej nerki) zarodków ludzkich i zwierzęcych. Zawiesinę komórek w pożywce umieszcza się w tzw. materacach, butelkach lub szalkach Petriego, gdzie po przyczepieniu się do powierzchni naczynia komórki zaczynają się namnażać. W przypadku infekcji wirusowej zwykle stosuje się pojedynczą warstwę komórek. Pożywkę odsącza się, wprowadza zawiesinę wirusową w określonych rozcieńczeniach, a po kontakcie z komórkami dodaje świeżą pożywkę, zwykle bez surowicy.

Komórki z większości kultur pierwotnych można hodować podhodowle i są one określane jako kultury wtórne. Wraz z dalszym pasażem komórek tworzy się populacja komórek podobnych do fibroblastów, zdolnych do szybkiego rozmnażania, z których większość zachowuje oryginalny zestaw chromosomów. Są to tak zwane komórki diploidalne. W seryjnej hodowli komórek uzyskuje się stabilne ciągłe hodowle komórkowe. Podczas pasaży pojawiają się szybko dzielące się jednorodne komórki z heteroploidalnym zestawem chromosomów. Stabilne linie komórkowe mogą być jednowarstwowe i zawiesinowe. Kultury jednowarstwowe rosną w postaci ciągłej warstwy na powierzchni szkła, kultury zawiesinowe rosną w postaci zawiesin w różnych naczyniach przy użyciu mieszadeł. Istnieje ponad 400 linii komórkowych pochodzących od 40 różnych gatunków zwierząt (w tym naczelnych, ptaków, gadów, płazów, ryb, owadów) i ludzi.

Kawałki poszczególnych narządów i tkanek (hodowle narządów) można hodować w sztucznych pożywkach. Tego typu hodowle zachowują strukturę tkankową, co jest szczególnie ważne przy izolacji i pasażu wirusów, które nie namnażają się w niezróżnicowanych kulturach tkankowych (np. koronawirusy).

W zainfekowanych hodowlach komórkowych wirusy można wykryć na podstawie zmiany morfologii komórki, działania cytopatycznego, które może być specyficzne, pojawienia się inkluzji, poprzez określenie antygenów wirusowych w komórce iw płynie hodowlanym; określanie właściwości biologicznych potomstwa wirusów w płynach hodowlanych i miareczkowanie wirusów w hodowlach tkankowych, zarodkach kurzych lub zwierzętach wrażliwych; poprzez wykrywanie pojedynczych wirusowych kwasów nukleinowych w komórkach metodą hybrydyzacji molekularnej lub skupisk kwasów nukleinowych metodą cytochemiczną przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.

Izolacja wirusów to żmudny i długotrwały proces. Jest przeprowadzany w celu określenia typu lub wariantu wirusa krążącego w populacji (na przykład w celu identyfikacji serowariantu wirusa grypy, dzikiego lub szczepionkowego szczepu wirusa polio itp.); w przypadkach, gdy jest to niezbędne do podjęcia pilnych działań epidemiologicznych; gdy pojawiają się nowe typy lub warianty wirusów; w razie potrzeby potwierdź wstępną diagnozę; do oznaczania wirusów w obiektach środowiskowych. Przy izolacji wirusów bierze się pod uwagę możliwość ich przetrwania w organizmie człowieka, a także wystąpienie zakażenia mieszanego wywołanego przez dwa lub więcej wirusów. Genetycznie jednorodna populacja wirusa uzyskana z pojedynczego wirionu nazywana jest klonem wirusowym, a proces jej uzyskiwania nazywany jest klonowaniem.

Do izolacji wirusów stosuje się infekcję podatnych zwierząt laboratoryjnych, zarodki kurze, ale najczęściej stosuje się hodowlę tkankową. Obecność wirusa jest zwykle określana przez specyficzną degenerację komórek (efekt cytopatyczny), tworzenie symplastów i syncytii, wykrywanie wtrąceń wewnątrzkomórkowych, a także specyficzny antygen wykrywany za pomocą immunofluorescencji, hemadsorpcji, hemaglutynacji (w wirusach hemaglutynujących) itp. . Objawy te można wykryć dopiero po 2-3 pasażach wirusa.

Do izolacji wielu wirusów, takich jak wirusy grypy, stosuje się zarodki kurze, do izolacji niektórych wirusów Coxsackie i szeregu arbowirusów stosuje się nowonarodzone myszy. Identyfikacja izolowanych wirusów odbywa się za pomocą testów serologicznych i innych metod.

Podczas pracy z wirusami określa się ich miano. Miareczkowanie wirusów przeprowadza się zwykle w hodowli tkankowej, określając największe rozcieńczenie płynu zawierającego wirusa, przy którym dochodzi do degeneracji tkanki, tworzenia się inkluzji i antygenów specyficznych dla wirusa. Metodę łysinkową można stosować do miareczkowania wielu wirusów. Łysinki lub ujemne kolonie wirusów są ogniskami komórek zniszczonych przez wirusy w jednowarstwowej hodowli tkankowej pod powłoką agarową. Liczenie kolonii umożliwia ilościową analizę zakaźnej aktywności wirusów na podstawie tego, że jedna zakaźna cząsteczka wirusa tworzy jedną łysinę. Płytki identyfikuje się przez barwienie hodowli barwnikami witalnymi, zwykle neutralną czerwienią; płytki nie adsorbują barwnika i dlatego są widoczne jako jasne plamki na tle wybarwionych żywych komórek. Miano wirusa wyraża się jako liczbę jednostek tworzących łysinki w 1 ml.

Oczyszczanie i zatężanie wirusów zwykle prowadzi się przez ultrawirowanie różnicowe, po którym następuje wirowanie w gradiencie stężenia lub gęstości. Do oczyszczania wirusów stosuje się metody immunologiczne, chromatografię jonowymienną, immunosorbenty itp.

Diagnostyka laboratoryjna infekcji wirusowych obejmuje wykrycie patogenu lub jego składników w materiale klinicznym; izolacja wirusa z tego materiału; serodiagnostyka. Wybór metody diagnostyki laboratoryjnej w każdym indywidualnym przypadku zależy od charakteru choroby, okresu jej trwania oraz możliwości laboratorium. Nowoczesna diagnostyka zakażeń wirusowych opiera się na metodach ekspresowych, pozwalających na uzyskanie odpowiedzi w kilka godzin po pobraniu materiału klinicznego we wczesnych stadiach choroby, takich jak elektronowa i immunologiczna mikroskopia elektronowa, a także immunofluorescencja, metoda hybrydyzacji molekularnej, wykrywanie przeciwciał klasy IgM itp.

Mikroskopia elektronowa zabarwionych ujemnie wirusów umożliwia różnicowanie wirusów i określanie ich stężenia. Zastosowanie mikroskopii elektronowej w diagnostyce infekcji wirusowych ogranicza się do przypadków, w których stężenie cząstek wirusowych w materiale klinicznym jest wystarczająco wysokie (10 5 w 1 ml i wyżej). Wadą metody jest brak możliwości rozróżnienia wirusów należących do tej samej grupy taksonomicznej. Ta wada jest eliminowana przez zastosowanie immunologicznej mikroskopii elektronowej. Metoda opiera się na tworzeniu kompleksów immunologicznych w wyniku dodania do cząstek wirusowych swoistej surowicy, przy równoczesnym zatężeniu cząstek wirusowych, co umożliwia ich identyfikację. Metodę stosuje się również do wykrywania przeciwciał. W celu szybkiej diagnostyki przeprowadza się badanie mikroskopem elektronowym ekstraktów tkankowych, kału, płynu z pęcherzyków i wydzielin z nosogardzieli. Mikroskopia elektronowa jest szeroko stosowana do badania morfogenezy wirusa, a jej możliwości są poszerzane o znakowane przeciwciała.

Metoda hybrydyzacji molekularnej, oparta na wykrywaniu specyficznych dla wirusa kwasów nukleinowych, umożliwia wykrywanie pojedynczych kopii genów i nie ma sobie równych pod względem czułości. Reakcja polega na hybrydyzacji komplementarnych nici DNA lub RNA (sondy) i tworzeniu struktur dwuniciowych. Najtańszą sondą jest sklonowany rekombinowany DNA. Sonda jest znakowana radioaktywnymi prekursorami (zwykle radioaktywnym fosforem). Zastosowanie reakcji kolorymetrycznych jest obiecujące. Istnieje kilka wariantów hybrydyzacji molekularnej: hybrydyzacja punktowa, hybrydyzacja blot, hybrydyzacja kanapkowa, hybrydyzacja in situ itp.

Przeciwciała klasy IgM pojawiają się wcześniej niż przeciwciała klasy G (w 3-5 dniu choroby) i znikają po kilku tygodniach, więc ich wykrycie wskazuje na świeżą infekcję. Przeciwciała klasy IgM są wykrywane za pomocą immunofluorescencji lub testu immunoenzymatycznego przy użyciu surowic odpornościowych anty-m (surowice anty-IgM z łańcuchem ciężkim).

Metody serologiczne w wirusologii opierają się na klasycznych reakcjach immunologicznych (zob. Metody badań immunologicznych ): reakcje wiązania dopełniacza, hamowanie hemaglutynacji, neutralizacja biologiczna, immunodyfuzja, hemaglutynacja pośrednia, hemoliza radialna, immunofluorescencja, immunotest enzymatyczny, test radioimmunologiczny. Opracowano mikrometody wielu reakcji, a ich techniki są stale udoskonalane. Metody te służą do identyfikacji wirusów przy użyciu zestawu znanych surowic oraz do serodiagnostyki w celu określenia wzrostu przeciwciał w drugiej surowicy w porównaniu z pierwszą (pierwszą surowicę pobiera się w pierwszych dniach po chorobie, drugą - po 2-3 tygodnie). Wartość diagnostyczna to nie mniej niż czterokrotny wzrost przeciwciał w drugiej surowicy. Jeśli wykrycie przeciwciał klasy IgM wskazuje na niedawną infekcję, wówczas przeciwciała klasy IgC utrzymują się przez kilka lat, a czasem do końca życia.

Aby zidentyfikować poszczególne antygeny wirusów i przeciwciał przeciwko nim w złożonych mieszaninach bez uprzedniego oczyszczania białek, stosuje się immunoblotting. Metoda łączy frakcjonowanie białek za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z późniejszym oznaczeniem immunologicznym białek za pomocą testu immunoenzymatycznego. Separacja białek zmniejsza wymagania dotyczące czystości chemicznej antygenu i umożliwia identyfikację poszczególnych par antygen-przeciwciało. Zadanie to ma znaczenie np. w serodiagnostyce zakażenia wirusem HIV, gdzie fałszywie dodatnie reakcje immunoenzymatyczne wynikają z obecności przeciwciał przeciwko antygenom komórkowym, które są obecne w wyniku niedostatecznego oczyszczenia białek wirusowych. Identyfikacja przeciwciał w surowicy pacjentów na wewnętrzne i zewnętrzne antygeny wirusowe umożliwia określenie stadium choroby, aw analizie populacji zmienność białek wirusowych. Immunoblotting w zakażeniu wirusem HIV jest stosowany jako test potwierdzający wykrywanie poszczególnych antygenów wirusowych i przeciwciał przeciwko nim. Podczas analizy populacji metoda służy do określenia zmienności białek wirusowych. Ogromną wartością metody jest możliwość analizy antygenów syntetyzowanych techniką rekombinacji DNA, określenie ich wielkości oraz obecności determinant antygenowych.

metody badania biologii wirusów i ich identyfikacji. W wirusologii szeroko stosowane są metody biologii molekularnej, za pomocą których możliwe było ustalenie struktury molekularnej cząstek wirusa, sposobu ich przenikania do komórki oraz cech reprodukcji wirusów, podstawowej struktury wirusowych kwasów nukleinowych i białka. Opracowywane są metody określania sekwencji elementów składowych wirusowych kwasów nukleinowych i aminokwasów białkowych. Możliwe staje się powiązanie funkcji kwasów nukleinowych i kodowanych przez nie białek z sekwencją nukleotydową oraz ustalenie przyczyn procesów wewnątrzkomórkowych, które odgrywają ważną rolę w patogenezie infekcji wirusowej.

Metody badań wirusologicznych opierają się również na procesach immunologicznych (oddziaływanie antygenu z przeciwciałami), właściwościach biologicznych wirusa (zdolność do hemaglutynacji, hemolizy, aktywność enzymatyczna), cechach interakcji wirusa z komórką gospodarza (charakter cytopatycznej efekt, powstawanie inkluzji wewnątrzkomórkowych itp.).

W diagnostyce zakażeń wirusowych, w hodowli, izolacji i identyfikacji wirusów, a także w przygotowywaniu preparatów szczepionkowych, szeroko stosowana jest metoda hodowli tkankowych i komórkowych. Stosuje się pierwotne, wtórne, stabilne ciągłe i diploidalne hodowle komórkowe. Hodowle pierwotne uzyskuje się przez dyspersję tkanki za pomocą enzymów proteolitycznych (trypsyna, kolagenaza). Źródłem komórek mogą być tkanki i narządy (częściej nerki) zarodków ludzkich i zwierzęcych. Zawiesinę komórek w pożywce umieszcza się w tzw. materacach, butelkach lub szalkach Petriego, gdzie po przyczepieniu się do powierzchni naczynia komórki zaczynają się namnażać. W przypadku infekcji wirusowej zwykle stosuje się pojedynczą warstwę komórek. Pożywkę odsącza się, wprowadza zawiesinę wirusową w określonych rozcieńczeniach, a po kontakcie z komórkami dodaje świeżą pożywkę, zwykle bez surowicy.

Komórki z większości kultur pierwotnych można hodować podhodowle i są one określane jako kultury wtórne. Wraz z dalszym pasażem komórek tworzy się populacja komórek podobnych do fibroblastów, zdolnych do szybkiego rozmnażania, z których większość zachowuje oryginalny zestaw chromosomów. Są to tak zwane komórki diploidalne. W seryjnej hodowli komórek uzyskuje się stabilne ciągłe hodowle komórkowe. Podczas pasaży pojawiają się szybko dzielące się jednorodne komórki z heteroploidalnym zestawem chromosomów. Stabilne linie komórkowe mogą być jednowarstwowe i zawiesinowe. Kultury jednowarstwowe rosną w postaci ciągłej warstwy na powierzchni szkła, kultury zawiesinowe rosną w postaci zawiesin w różnych naczyniach przy użyciu mieszadeł. Istnieje ponad 400 linii komórkowych pochodzących od 40 różnych gatunków zwierząt (w tym naczelnych, ptaków, gadów, płazów, ryb, owadów) i ludzi.

Kawałki poszczególnych narządów i tkanek (hodowle narządów) można hodować w sztucznych pożywkach. Tego typu hodowle zachowują strukturę tkankową, co jest szczególnie ważne przy izolacji i pasażu wirusów, które nie namnażają się w niezróżnicowanych kulturach tkankowych (np. koronawirusy).

W zainfekowanych hodowlach komórkowych wirusy można wykryć na podstawie zmiany morfologii komórki, działania cytopatycznego, które może być specyficzne, pojawienia się inkluzji, poprzez określenie antygenów wirusowych w komórce iw płynie hodowlanym; określanie właściwości biologicznych potomstwa wirusów w płynach hodowlanych i miareczkowanie wirusów w hodowlach tkankowych, zarodkach kurzych lub zwierzętach wrażliwych; poprzez wykrywanie pojedynczych wirusowych kwasów nukleinowych w komórkach metodą hybrydyzacji molekularnej lub skupisk kwasów nukleinowych metodą cytochemiczną przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.

Izolacja wirusów to żmudny i długotrwały proces. Jest przeprowadzany w celu określenia typu lub wariantu wirusa krążącego w populacji (na przykład w celu identyfikacji serowariantu wirusa grypy, dzikiego lub szczepionkowego szczepu wirusa polio itp.); w przypadkach, gdy jest to niezbędne do podjęcia pilnych działań epidemiologicznych; gdy pojawiają się nowe typy lub warianty wirusów; w razie potrzeby potwierdź wstępną diagnozę; do oznaczania wirusów w obiektach środowiskowych. Przy izolacji wirusów bierze się pod uwagę możliwość ich przetrwania w organizmie człowieka, a także wystąpienie zakażenia mieszanego wywołanego przez dwa lub więcej wirusów. Genetycznie jednorodna populacja wirusa uzyskana z pojedynczego wirionu nazywana jest klonem wirusowym, a proces jej uzyskiwania nazywany jest klonowaniem.

Do izolacji wirusów stosuje się infekcję podatnych zwierząt laboratoryjnych, zarodki kurze, ale najczęściej stosuje się hodowlę tkankową. Obecność wirusa jest zwykle określana przez specyficzną degenerację komórek (efekt cytopatyczny), tworzenie symplastów i syncytii, wykrywanie wtrąceń wewnątrzkomórkowych, a także specyficzny antygen wykrywany za pomocą immunofluorescencji, hemadsorpcji, hemaglutynacji (w wirusach hemaglutynujących) itp. . Objawy te można wykryć dopiero po 2-3 pasażach wirusa.

Do izolacji wielu wirusów, takich jak wirusy grypy, stosuje się zarodki kurze, do izolacji niektórych wirusów Coxsackie i szeregu arbowirusów stosuje się nowonarodzone myszy. Identyfikacja izolowanych wirusów odbywa się za pomocą testów serologicznych i innych metod.

Podczas pracy z wirusami określa się ich miano. Miareczkowanie wirusów przeprowadza się zwykle w hodowli tkankowej, określając największe rozcieńczenie płynu zawierającego wirusa, przy którym dochodzi do degeneracji tkanki, tworzenia się inkluzji i antygenów specyficznych dla wirusa. Metodę łysinkową można stosować do miareczkowania wielu wirusów. Łysinki lub ujemne kolonie wirusów są ogniskami komórek zniszczonych przez wirusy w jednowarstwowej hodowli tkankowej pod powłoką agarową. Liczenie kolonii umożliwia ilościową analizę zakaźnej aktywności wirusów na podstawie tego, że jedna zakaźna cząsteczka wirusa tworzy jedną łysinę. Płytki identyfikuje się przez barwienie hodowli barwnikami witalnymi, zwykle neutralną czerwienią; płytki nie adsorbują barwnika i dlatego są widoczne jako jasne plamki na tle wybarwionych żywych komórek. Miano wirusa wyraża się jako liczbę jednostek tworzących łysinki w 1 ml.

Oczyszczanie i zatężanie wirusów zwykle prowadzi się przez ultrawirowanie różnicowe, po którym następuje wirowanie w gradiencie stężenia lub gęstości. Do oczyszczania wirusów stosuje się metody immunologiczne, chromatografię jonowymienną, immunosorbenty itp.

Diagnostyka laboratoryjna infekcji wirusowych obejmuje wykrycie patogenu lub jego składników w materiale klinicznym; izolacja wirusa z tego materiału; serodiagnostyka. Wybór metody diagnostyki laboratoryjnej w każdym indywidualnym przypadku zależy od charakteru choroby, okresu jej trwania oraz możliwości laboratorium. Nowoczesna diagnostyka zakażeń wirusowych opiera się na metodach ekspresowych, pozwalających na uzyskanie odpowiedzi w kilka godzin po pobraniu materiału klinicznego we wczesnych stadiach choroby, takich jak elektronowa i immunologiczna mikroskopia elektronowa, a także immunofluorescencja, metoda hybrydyzacji molekularnej, wykrywanie przeciwciał klasy IgM itp.

Mikroskopia elektronowa zabarwionych ujemnie wirusów umożliwia różnicowanie wirusów i określanie ich stężenia. Zastosowanie mikroskopii elektronowej w diagnostyce infekcji wirusowych ogranicza się do przypadków, w których stężenie cząstek wirusowych w materiale klinicznym jest wystarczająco wysokie (10 5 w 1 ml i wyżej). Wadą metody jest brak możliwości rozróżnienia wirusów należących do tej samej grupy taksonomicznej. Ta wada jest eliminowana przez zastosowanie immunologicznej mikroskopii elektronowej. Metoda opiera się na tworzeniu kompleksów immunologicznych w wyniku dodania do cząstek wirusowych swoistej surowicy, przy równoczesnym zatężeniu cząstek wirusowych, co umożliwia ich identyfikację. Metodę stosuje się również do wykrywania przeciwciał. W celu szybkiej diagnostyki przeprowadza się badanie mikroskopem elektronowym ekstraktów tkankowych, kału, płynu z pęcherzyków i wydzielin z nosogardzieli. Mikroskopia elektronowa jest szeroko stosowana do badania morfogenezy wirusa, a jej możliwości są poszerzane o znakowane przeciwciała.

Metoda hybrydyzacji molekularnej, oparta na wykrywaniu specyficznych dla wirusa kwasów nukleinowych, umożliwia wykrywanie pojedynczych kopii genów i nie ma sobie równych pod względem czułości. Reakcja polega na hybrydyzacji komplementarnych nici DNA lub RNA (sondy) i tworzeniu struktur dwuniciowych. Najtańszą sondą jest sklonowany rekombinowany DNA. Sonda jest znakowana radioaktywnymi prekursorami (zwykle radioaktywnym fosforem). Zastosowanie reakcji kolorymetrycznych jest obiecujące. Istnieje kilka wariantów hybrydyzacji molekularnej: hybrydyzacja punktowa, hybrydyzacja blot, hybrydyzacja kanapkowa, hybrydyzacja in situ itp.

Przeciwciała klasy IgM pojawiają się wcześniej niż przeciwciała klasy G (w 3-5 dniu choroby) i znikają po kilku tygodniach, więc ich wykrycie wskazuje na świeżą infekcję. Przeciwciała klasy IgM są wykrywane za pomocą immunofluorescencji lub testu immunoenzymatycznego przy użyciu antysurowic anty-μ (surowice anty-IgM z łańcuchem ciężkim).

Metody serologiczne w wirusologii opierają się na klasycznych reakcjach immunologicznych (patrz Immunologiczne metody badań) : reakcje wiązania dopełniacza, hamowanie hemaglutynacji, neutralizacja biologiczna, immunodyfuzja, hemaglutynacja pośrednia, hemoliza radialna, immunofluorescencja, immunotest enzymatyczny, test radioimmunologiczny. Opracowano mikrometody wielu reakcji, a ich techniki są stale udoskonalane. Metody te służą do identyfikacji wirusów przy użyciu zestawu znanych surowic oraz do serodiagnostyki w celu określenia wzrostu przeciwciał w drugiej surowicy w porównaniu z pierwszą (pierwszą surowicę pobiera się w pierwszych dniach po chorobie, drugą - po 2-3 tygodnie). Wartość diagnostyczna to nie mniej niż czterokrotny wzrost przeciwciał w drugiej surowicy. Jeśli wykrycie przeciwciał klasy IgM wskazuje na niedawną infekcję, wówczas przeciwciała klasy IgC utrzymują się przez kilka lat, a czasem do końca życia.

Aby zidentyfikować poszczególne antygeny wirusów i przeciwciał przeciwko nim w złożonych mieszaninach bez uprzedniego oczyszczania białek, stosuje się immunoblotting. Metoda łączy frakcjonowanie białek za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z późniejszym oznaczeniem immunologicznym białek za pomocą testu immunoenzymatycznego. Separacja białek zmniejsza wymagania dotyczące czystości chemicznej antygenu i umożliwia identyfikację poszczególnych par antygen-przeciwciało. Zadanie to ma znaczenie np. w serodiagnostyce zakażenia wirusem HIV, gdzie fałszywie dodatnie reakcje immunoenzymatyczne wynikają z obecności przeciwciał przeciwko antygenom komórkowym, które są obecne w wyniku niedostatecznego oczyszczenia białek wirusowych. Identyfikacja przeciwciał w surowicach pacjentów na wewnętrzne i zewnętrzne antygeny wirusowe umożliwia określenie stopnia zaawansowania choroby, aw analizie populacji – zmienności białek wirusowych. Immunoblotting w zakażeniu wirusem HIV jest stosowany jako test potwierdzający wykrywanie poszczególnych antygenów wirusowych i przeciwciał przeciwko nim. Podczas analizy populacji metoda służy do określenia zmienności białek wirusowych. Ogromną wartością metody jest możliwość analizy antygenów syntetyzowanych techniką rekombinacji DNA, określenie ich wielkości oraz obecności determinant antygenowych.

Bibliografia: Bukrinskaja A.G. Wirusologia, M., 1986; Wirusologia, metody, wyd. B. Meikhi, przeł. z angielskiego, M., 1988; Podręcznik mikrobiologicznych i wirusologicznych metod badawczych, wyd. MO Birger, M., 1982.

• - metody unieszkodliwiania odpadów zawierających substancje organiczne, polegające na ich podgrzaniu w wyniku żywotnej aktywności termofilnych mikroorganizmów tlenowych...

  Encyklopedia medyczna

• - histochemiczne metody wykrywania enzymów, oparte na reakcji tworzenia osadów fosforanu wapnia lub magnezu w lokalizacji aktywności enzymatycznej podczas inkubacji skrawków tkanek z organicznymi ...

  Encyklopedia medyczna

• - metody wykrywania histiocytów w preparatach tkanki nerwowej i różnych narządów za pomocą srebra amoniakalnego lub pirydyno-sodowych roztworów srebra ...

  Encyklopedia medyczna

• - metody oceny założeń o charakterze dziedziczenia, oparte na porównaniu obserwowanych i oczekiwanych proporcji osób chorych i zdrowych w rodzinach obciążonych chorobami dziedzicznymi, z uwzględnieniem metody...

  Encyklopedia medyczna

• - służą do badania struktury i funkcji komórek i tkanek ludzi, zwierząt i roślin w warunkach normalnych, patologicznych i doświadczalnych...

  Encyklopedia medyczna

• - metody identyfikacji związków chemicznych w skrawkach histologicznych. Integralną częścią G.m. to metody cytochemiczne wykrywające substancje chemiczne w komórkach przygotowanych rozmazów i odcisków...

  Encyklopedia medyczna

• - metody ilościowego i jakościowego oznaczania glukozy we krwi i moczu, oparte na utlenieniu glukozy tlenem atmosferycznym w obecności enzymu oksydazy glukozowej...

  Encyklopedia medyczna

• - diagnostyczne metody badawcze oparte na specyficznym oddziaływaniu antygenów i przeciwciał...

  Encyklopedia medyczna

• - metody wykrywania struktur włóknistych tkanki łącznej i gleju w preparatach histologicznych na podstawie ich wielobarwnego barwienia...

  Encyklopedia medyczna

• - 1) metoda barwienia preparatów histologicznych skóry właściwej hemalunem Mayera, roztworem ałunu potasowego i rodaminy; Jądra komórkowe zabarwiają się na niebiesko, eledyna zabarwia się na czerwono...

  Encyklopedia medyczna

• - w medycynie - zestaw metod do ilościowego badania i analizy stanu i zachowania się obiektów i systemów związanych z medycyną i ochroną zdrowia...

  Encyklopedia medyczna

• - sposoby badania różnych obiektów za pomocą mikroskopu...

  Encyklopedia medyczna

• - w oparciu o wykorzystanie praw optyki odnoszących się do natury, propagacji i oddziaływania z materią promieniowania elektromagnetycznego w zakresie optycznym...

  Encyklopedia medyczna

• - metody badania i oceny jakości obiektów środowiska za pomocą narządów zmysłów...

  Encyklopedia medyczna

• - ogólna nazwa szeregu metod impregnacji preparatów histologicznych srebrem w celu wykrycia włókien glejowych i innych argyrofilnych ...

  Encyklopedia medyczna

• - są powoływani przez śledczego i sąd do rozstrzygania szczególnych problemów pojawiających się przy badaniu przestępstw i rozpatrywaniu spraw cywilnych. Są też przetrzymywani na polecenie prokuratora...

  Encyklopedia medyczna

„Metody badań wirusologicznych” w książkach

Wściekłość przeciwko maszynie zabijającej w imię (1992)

autor Tsaler Igor

Rage Against The Machine Killing In The Name (1992) Pierwszy album Rage Against The Machine z Los Angeles połączył hip-hop i hard rock, okraszając je aktualnymi manifestami politycznymi i, przyjemnie, sporą dawką gęstego, funkowego rytmu. W utworze „Killing in the name”, zawartym na pierwszym singlu,

James Brown Wstań (Czuję się jakbym był) Sex Machine (1970)

Z książki Muzyka popularna XX wieku: jazz, blues, rock, pop, country, folk, elektronika, soul autor Tsaler Igor

James Brown Get Up (Czuję się jak maszyna do seksu) (1970) Pod koniec lat 60. James Brown zaczął eksperymentować. Rozdzierający serce soul z The Famous Flames ustąpił miejsca skwierczącemu funkowi z The J.B.’s. Jednym z najważniejszych kamieni milowych zbliżającej się ery funku był „Sex Machine”, który w dziesięciominutowej wersji

Wściekłość na maszynę

Z książki Against the Impossible (zbiór artykułów o kulturze) autor Kołtaszow Wasilij Georgiewicz

Rage Against The Machine Tom Morello: „Naszym celem jest pomaganie ludziom w uwolnieniu się z łańcuchów kłamstw i przemocy, które splątały ich z rządami, międzynarodowymi korporacjami, mediami i partiami politycznymi, aby dać ludziom na całym świecie poczucie zaufania do jutro i

Witamy w maszynie

Z książki Czas dzwonka autor Smirnov Ilya

Witamy w maszynie Początek pieriestrojki w naszej historii możemy datować na styczeń 1987 roku. Potem odbyło się liberalne plenum KC i mieliśmy okazję opublikować w Yunost nieedytowaną listę współczesnych „gwiazd” radzieckiego rocka, w tym DDT, CLOUD EDGE i

Fabryka Maszyn Toyoda

Z książki Gemba kaizen. Droga do redukcji kosztów i poprawy jakości przez Imai Masaakiego

Toyoda Machine Works Według Yoshio Shimy, dyrektora Toyoda Machine Works, korzyści płynące z ustanowienia systemu jakości i standardów zapewnienia jakości stały się widoczne w latach 80., kiedy firma wprowadziła koncepcję „totalnego zarządzania opartego na jakości”

Maszyna

Z książki Słownik filozoficzny autor Hrabia Sponville André

Maszyna (Maszyna) „Gdyby czółenka same się tkały”, zauważył kiedyś Arystoteles, „rzemieślnicy nie potrzebowaliby robotników, a panowie nie potrzebowaliby niewolników” („Polityka”, I, 4). To mniej więcej to, co nazywamy maszyną - obiekt zdolny do ruchu, pozbawiony duszy (automat) i

Z książki Inteligencja internetowa [Przewodnik po akcji] autor Juszczuk Jewgienij Leonidowicz

Archiwum stron Internet Archive Wayback Machine Adres e-mail - http://web.archive.org Każdy, kto zbierał informacje na interesujący go problem przez wystarczająco długi czas, wie, jak ważne jest czasem odnalezienie informacji publikowanych na strona kilka lat temu. Czasami jest po prostu

Internet Archive Wayback Machine

Z książki Przeciwdziałanie czarnemu PR w Internecie autor Kuzin Aleksander Władimirowicz

Archiwum stron Internet Archive Wayback Machine Bardzo często atak czarnych PR-owców przychodzi do Ciebie niespodziewanie. W tym przypadku po raz pierwszy stajemy przed koniecznością dokładnego zbadania przeciwnika. Gdyby w ogóle założyć taki rozwój wydarzeń (np

4.9. Tworzenie kopii zapasowych za pomocą Time Machine

autor Skrylina Zofia

4.9. Tworzenie kopii zapasowych za pomocą Time Machine System Mac OS X Leopard umożliwia regularne tworzenie kopii zapasowych komputera za pomocą aplikacji Time Machine. Po odpowiednich ustawieniach aplikacja automatycznie

4.9.2. Utwórz swoją pierwszą kopię zapasową za pomocą Time Machine

Z książki Samouczek dla komputerów Macintosh autor Skrylina Zofia

4.9.2. Tworzenie pierwszej kopii zapasowej za pomocą Time Machine Przed rozpoczęciem tworzenia pierwszej kopii zapasowej należy włożyć dysk zewnętrzny lub mieć wolną partycję dysku twardego przeznaczoną wyłącznie na potrzeby kopii zapasowej.

4.9.4. Korzystanie z wehikułu czasu

Z książki Samouczek dla komputerów Macintosh autor Skrylina Zofia

4.9.4. Korzystanie z Time Machine Po wprowadzeniu niezbędnych ustawień Time Machine i utworzeniu wielu kopii zapasowych możesz rozpocząć wyszukiwanie i przywracanie wcześniejszych wersji plików. Za to: 1. Otwórz okno Findera i wybierz plik, który chcesz przywrócić.2. Jeśli

Wirusy, w przeciwieństwie do bakterii, rozmnażają się tylko w żywych komórkach. W tym zakresie hodowlę wirusów można prowadzić na poziomie ciała zwierzęcia doświadczalnego (zarodek kurzy jako rozwijający się organizm określany jest mianem zwierząt doświadczalnych) lub żywej komórki wyhodowanej poza organizmem, tj. na poziomie hodowli komórkowej.

Wykorzystanie zwierząt laboratoryjnych. Jedną z metod izolacji i hodowli wirusów jest zarażanie zwierząt laboratoryjnych. Służą do izolacji wirusów, które nie powodują rozwoju zmian cytopatycznych w hodowlach komórkowych i nie namnażają się w zarodkach kurzych. Wykorzystanie zwierząt laboratoryjnych umożliwia również identyfikację charakteru infekcji wirusowej na podstawie zespołu objawów klinicznych. Białe myszy, chomiki, świnki morskie i króliki są najczęściej wykorzystywane jako zwierzęta laboratoryjne, w zależności od celu pracy i rodzaju badanych wirusów. Z większych zwierząt wykorzystuje się małpy różnych gatunków i niektóre inne zwierzęta. Od ptaków używaj kurczaków, gęsi, kaczek. W ostatnich latach nowonarodzone zwierzęta (bardziej podatne na wirusy), „zwierzęta bezpłodne” (wydobyte z macicy i trzymane w sterylnych warunkach przy użyciu sterylnego powietrza i wysterylizowanej żywności) oraz zwierzęta z czystych linii o znanej dziedziczności (zwierzęta wsobne lub liniowe) zostały częściej używany.

Do doświadczenia włączane są tylko zdrowe zwierzęta, najlepiej z jednej warchlakarni iz jednej partii. Temperatura ciała jest mierzona w tym samym czasie, ponieważ występują w niej dzienne wahania. Materiał do badań podaje się z uwzględnieniem tropizmu wirusów do określonych tkanek. Tak więc w celu izolacji wirusów neutrotropowych materiał wstrzykuje się do mózgu, w celu izolacji wirusów pneumotropowych - przez nos (w lekkim znieczuleniu eterem).

U zwierząt laboratoryjnych po zakażeniu materiałem zawierającym wirusy ważne jest terminowe i prawidłowe pobranie materiału do dalszych badań oraz zachowanie aseptyki. Wyniki izolacji wirusa uznaje się za pozytywne, jeżeli po odpowiednim okresie inkubacji u zwierzęcia wystąpią objawy zakażenia.

Wykorzystanie zarodków kurzych. W tkankach zarodka, jego błonach, woreczku żółtkowym wiele patogennych wirusów ludzkich i zwierzęcych może się namnażać. W tym przypadku ważna jest selektywność wirusów do określonej tkanki: wirusy ospy dobrze się rozmnażają i gromadzą w komórkach błony kosmówkowo-omoczniowej, wirus świnki w owodniach, wirusy grypy w owodniach i omoczni, a wirus wścieklizny w woreczku żółtkowym.

Hodowla wirusów w rozwijających się zarodkach ma wiele zalet w porównaniu z innymi metodami: gęsta skorupa dość niezawodnie chroni zawartość wewnętrzną przed drobnoustrojami; podczas infekowania zarodków kurzych uzyskuje się większy plon materiału zawierającego wirusy niż przy innych metodach hodowli; metoda zakażenia zarodków kurzych jest prosta i dostępna dla każdego laboratorium wirusologicznego; zarodki mają wystarczającą żywotność i odporność na patogeny czynników zewnętrznych. Jednak zarodki kurze nie zawsze są wolne od utajonych infekcji wirusowych i bakteryjnych. Trudno jest zaobserwować dynamikę zmian patologicznych zachodzących w zarodku po zakażeniu wirusem. Sekcja zwłok zakażonych zarodków często nie ujawnia żadnych widocznych zmian i wykrywa wirusa za pomocą testu hemaglutynacji i innych metod. W zakażonych zarodkach nie można śledzić wzrostu miana przeciwciał. Ta metoda nie jest odpowiednia dla wszystkich wirusów.

Do badań wirusologicznych wykorzystuje się zarodki w wieku 7-12 dni, które pozyskiwane są z ferm drobiu. Zarodki można hodować w konwencjonalnym termostacie, na dnie którego umieszcza się tace z wodą do nawilżania powietrza. Temperatura w termostacie powinna wynosić 37°C, a wilgotność 60-65%. Wybierz duże, czyste (ale niemyte), zapłodnione jaja od kur białych, przechowywane nie dłużej niż 10 dni w temperaturze 5-10°C. Zapłodnione jaja są rozpoznawane po obecności krążka zarodkowego, który po prześwieceniu przez ovoskop wygląda jak ciemna plama.

Podczas pracy z wirusami można stosować różne metody infekowania zarodków, jednak najbardziej praktycznym zastosowaniem jest podanie wirusa na błonę kosmówkowo-omoczniową, wprowadzenie do jamy omoczniowej, owodniowej i woreczka żółtkowego

(Rys. 10.5). Wybór metody zależy od właściwości biologicznych badanego wirusa.

Ryż. 10,5.

Przed infekcją żywotność zarodka określa się na owoskopie. Żywe zarodki są ruchliwe, pulsacja naczyń błon jest wyraźnie widoczna. Podczas świecowania zaznacz prostym ołówkiem na skorupce granice worka powietrznego lub położenie zarodka, które określa jego cień na skorupce.

Zarodki kurze są zakażane w pudełku w ściśle aseptycznych warunkach przy użyciu sterylizowanych narzędzi.

W przypadku zakażenia błony kosmówkowo-omoczniowej najbardziej odpowiednie są 12-dniowe zarodki. Do zakażenia jamy omoczniowej wykorzystuje się zarodki w wieku 10-11 dni, w jamie owodniowej - zarodki w wieku 7-11 dni, w woreczku żółtkowym - zarodki w wieku 7 dni.

Jaja z zakażonymi zarodkami umieszcza się na podstawkach tępym końcem do góry. Reżim temperaturowy i okres inkubacji zależą od właściwości biologicznych zaszczepionego wirusa. Żywotność zarodków jest codziennie monitorowana pod owoskopem. Nie bada się zarodków, które obumarły pierwszego dnia po zakażeniu z powodu urazu.

Przed pobraniem materiału zarodki są schładzane w temperaturze 4°C przez 18-20 godzin w celu zwężenia naczyń i zapobieżenia krwawieniu podczas autopsji. Zarodki otwierane są w pudełku z zachowaniem zasad aseptyki.

Płyn omoczniowy jest zasysany pipetą, sterylność jest kontrolowana przez inokulację w bulionie cukrowym lub mięsno-peptonowym, sprawdzana na obecność wirusa w reakcji hemaglutynacji i przechowywana w temperaturze 4°C w stanie zamrożonym.

W celu uzyskania płynu owodniowego najpierw pobiera się płyn omoczniowy, następnie pęsetą chwyta błonę owodniową, lekko unosi i odsysa płyn owodniowy za pomocą pipety Pasteura.

Podczas badania zmian w błonie kosmówkowo-omoczniowej przecina się ją nożyczkami i całą zawartość wlewa się przez otwór do szalki Petriego. Błona kosmówkowo-omoczniowa pozostaje wewnątrz skorupy i jest usuwana pęsetą na płytkę Petriego z solą fizjologiczną. Tutaj jest myte, prostowane i badany jest charakter zmian ogniskowych na ciemnym tle.

Aby uzyskać błonę owodniową, worek owodniowy, w którym znajduje się zarodek, jest cięty i uwalniany z zarodka, badany pod kątem uszkodzeń.

W celu uzyskania błony żółtkowej nacina się kosmówkę omoczniową, odsysa płyny omoczniowe i owodniowe, płód usuwa pęsetą, oddziela pępowiną, chwyta woreczek żółtkowy i umieszcza na szalce Petriego. Kontrola sterylności, obserwacja obecności zmian chorobowych. W razie potrzeby żółtko można usunąć strzykawką bez usuwania woreczka żółtkowego.

Obecność wirusa w płynie omoczniowym i owodniowym zakażonego zarodka określa się w teście hemaglutynacji. Płyny z zarodków z dodatnim wynikiem hemaglutynacji po badaniu sterylności są łączone i miareczkowane w rozszerzonym teście hemaglutynacji.

W przypadku obecności niewielkiej ilości wirusa lub niemożności wykrycia go w materiale testowym, kolejne pasaże przeprowadza się na zarodkach kurzych. Jeżeli po trzech kolejnych pasażach na zarodkach wirus nie zostanie wykryty w badanym materiale, wynik uważa się za ujemny.

Wykorzystanie kultur komórkowych. Hodowla komórek poza organizmem wymaga spełnienia szeregu warunków. Jednym z nich jest ścisłe przestrzeganie sterylności podczas pracy, ponieważ stosowane pożywki są doskonałym podłożem odżywczym również dla bakterii i grzybów. Komórki tkanek są bardzo wrażliwe na sole metali ciężkich. Dlatego też należy nadać wyjątkowe znaczenie jakości różnych składników, z których składają się roztwory soli i pożywki, a także metodom obróbki naczyń i gumowych korków stosowanych w hodowli komórkowej.

Jednym z warunków udanej pracy z komórkami jest wysoka jakość wody destylowanej (sprawdzana 2 razy w tygodniu). Do pracy z komórkami używana jest woda podwójnie destylowana lub dejonizowana. Najlepsze destylatory to urządzenia wykonane ze szkła lub stali stopowej: toksyczne dla komórek jony metali ciężkich nie są wypłukiwane z takiego sprzętu. Wodę dejonizowaną uzyskuje się w specjalnych instalacjach, w których woda jest oczyszczana z soli podczas jej sukcesywnego przechodzenia przez kolumny z wymieniaczem anionowym i wymieniaczem kationowym.

Podczas hodowli komórek szczególnie wysokie wymagania stawia się przygotowaniu i sterylizacji szalek i korków. W wielu przypadkach to właśnie ich niewłaściwe mycie i sterylizacja powoduje, że komórki nie przyczepiają się do szkła lub następuje szybka degeneracja monowarstwy komórkowej.

Do wzrostu i reprodukcji komórek poza organizmem wymagany jest złożony zestaw czynników fizykochemicznych: określona temperatura, stężenie jonów wodorowych, związków nieorganicznych, węglowodanów, aminokwasów, białek, witamin, tlenu i dwutlenku węgla, dlatego dla do hodowli wirusów w hodowlach komórkowych stosuje się pożywki o złożonym składzie. . Ze względu na charakter składników składających się na ich skład media te dzielą się na dwie grupy.

• 1. Pożywki, które są mieszaninami roztworów soli fizjologicznej (Hanks, Earl itp.) oraz składników naturalnych (surowica krwi zwierzęcej i ludzkiej, hydrolizat albuminy). Ilość każdego z tych składników w różnych formulacjach pożywek jest różna.
• 2. Pożywki syntetyczne i półsyntetyczne składające się z roztworów soli fizjologicznej (Earl, Hanks itp.) z dodatkiem aminokwasów, witamin, koenzymów i nukleotydów (pożywki Eagle, 199 itp.). W syntetycznych pożywkach komórki mogą istnieć w stanie żywotnym przez krótki czas (do 7 dni). Aby utrzymać je w stanie żywym przez dłuższy czas, a także stworzyć lepsze warunki do wzrostu i reprodukcji komórek, do syntetycznych pożywek dodaje się surowicę krwi zwierzęcej (krowy, cielęta itp.).

Do izolowania wirusów można stosować różne metody hodowli komórek poza organizmem. Jednak obecnie największe praktyczne zastosowanie mają jednowarstwowe hodowle pierwotnych trypsynizowanych i przeszczepionych linii komórkowych. Jednowarstwowe hodowle komórkowe hoduje się w szklanych płaskościennych naczyniach-materacach o pojemności 1 l, 250 i 100 ml lub w konwencjonalnych probówkach bakteriologicznych odpowiednio przygotowanych.

W przypadku stosowania pierwotnych kultur komórkowych trypsynizowanych istota metody polega na zniszczeniu wiązań międzykomórkowych w tkankach przez enzymy proteolityczne i rozdzieleniu komórek w celu wyhodowania monowarstwy na powierzchni szkła. Źródłem pozyskiwania komórek mogą być tkanki i narządy zarodków ludzkich i zwierzęcych, zwierząt poddanych ubojowi i ptaków, a także pobrane od ludzi podczas operacji. Użyj normalnych i złośliwych tkanek zdegenerowanych, nabłonkowych, fibroblastycznych i mieszanych. Zdolność reprodukcji komórek pobranych z organizmu jest ściśle związana ze stopniem zróżnicowania tkanek. Im mniej zróżnicowana tkanka, tym większa zdolność jej komórek do proliferacji in vitro. Dlatego komórki tkanek embrionalnych i nowotworowych są znacznie łatwiejsze do hodowli poza organizmem niż normalne komórki dorosłych zwierząt.

Codzienne hodowle ogląda się pod mikroskopem o małym powiększeniu, aby określić charakter ich wzrostu. Jeśli komórki nie namnażają się, są okrągłe, ziarniste, ciemne i łuszczą się na szkle, szkło jest źle przetworzone lub składniki pożywki hodowlanej są toksyczne.

Wraz z pierwotnymi tkankami poddanymi trypsynizacji, przeszczepione hodowle komórkowe są szeroko stosowane do hodowli wirusów; kultury komórkowe zdolne do reprodukcji poza organizmem w nieskończoność. Najczęściej stosuje się hodowle komórkowe pochodzące z normalnych i rakowych tkanek ludzkich. Linia komórkowa HeLa uzyskana z guza szyjki macicy, Hep-2 z raka krtani, KV z tkanki raka jamy ustnej stała się powszechnie znana. Takie hodowle komórkowe są również przygotowywane z normalnych tkanek zwierzęcych - zarodków nerki małpy, królika i świni (Tabela 10.1).

W celu ponownego wysiania przeszczepionych komórek pożywkę odsysa się pipetą i wylewa. Powstałą cienką warstwę komórek niszczy się roztworem trypsyny, a uwolnione w ten sposób komórki przenosi się do nowego naczynia ze świeżą pożywką, gdzie ponownie tworzy się monowarstwa komórek.

Wskaźnikiem obecności wirusa w zainfekowanych hodowlach komórkowych może być:

• a) rozwój określonej degeneracji komórek;
• b) wykrywanie inkluzji wewnątrzkomórkowych;
• c) wykrywanie specyficznego antygenu metodą immunofluorescencji;
• d) dodatnia reakcja hemadsorpcji;
• e) dodatnia reakcja hemaglutynacji;
• e) powstawanie płytek.

Tabela 10.1

Lista najczęściej używanych kultur komórkowych

Aby wykryć specyficzną degenerację w zakażonych kulturach, komórki bada się codziennie pod mikroskopem o małym powiększeniu. Wiele wirusów namnażając się w komórkach powoduje ich degenerację, tj. mają działanie cytopatogenne (CPA) (ryc. 10.6).

Ryż. 10.6.

Czas rozwoju i charakter zmian cytopatycznych w zakażonych hodowlach komórkowych determinują właściwości i dawka zaszczepionego wirusa, a także właściwości i warunki hodowli komórkowej. Niektóre wirusy powodują CPP w ciągu pierwszego tygodnia po zakażeniu (ospa, polio, Coxsackie B itp.), Inne - po 1-2 tygodniach. po infekcji (adenowirusy, wirusy grypy rzekomej, ECHO itp.).

Wirusy powodują zmiany cytopatyczne trzech głównych typów: powstawanie wielojądrzastych komórek olbrzymich i symplastów, które są wynikiem fuzji cytoplazmy wielu komórek; zwyrodnienie komórek okrągłych wynikające z utraty połączeń międzykomórkowych i zaokrąglenia komórek; rozwój ognisk proliferacji komórek, składających się z kilku warstw komórek.

Podczas reprodukcji niektórych wirusów w hodowlach komórkowych w cytoplazmie lub jądrze dotkniętych komórek powstają inkluzje wewnątrzkomórkowe. Hodowle komórkowe do wykrywania inkluzji hoduje się na szklanych płytkach w probówkach, zakażonych wirusem, a po pewnych okresach inkubacji przygotowuje się preparaty, barwiąc je konwencjonalnymi barwnikami.

W celu wykrycia określonego antygenu w zainfekowanych hodowlach komórkowych preparaty przygotowuje się w taki sam sposób, jak w przypadku wykrywania wtrąceń za pomocą MFA.

Metoda łysinkowa polega na tworzeniu w pojedynczej warstwie komórek zakażonych wirusem pod powłoką agarową przebarwionych obszarów składających się ze zdegenerowanych (martwych) komórek. Obszary te, zwane płytkami, to kolonie wirusa, zwykle utworzone z pojedynczej cząsteczki wirusa.

W przypadku braku zmian cytopatycznych, inkluzji wewnątrzkomórkowych, powstawania łysinek, ujemnych reakcji hemadsorpcji i hemaglutynacji w kulturach komórkowych zakażonych materiałem testowym przeprowadza się dwa kolejne pasażowania. W przypadku braku tych zmian w końcowym pasażu wynik izolacji wirusa uważa się za ujemny.

Do wykrywania wirusów w materiale zakaźnym można zastosować następujące metody.

Mikroskopijny:

• a) wiroskopia;
• b) wykrywanie inkluzji wewnątrzkomórkowych.

Immunologiczny:

• a) immunologiczna mikroskopia elektronowa;
• b) immunofluorescencja;
• c) hemaglutynacja;
• d) hemadsorpcja.

Identyfikację wirusów przeprowadza się metodami immunologicznymi, w tym następującymi reakcjami:

• a) hamowanie hemaglutynacji;
• b) opóźnienia hemadsorpcji;
• c) wiązanie dopełniacza;
• d) neutralizacja;
• e) wytrącanie w żelu agarowym.

metody mikroskopowe. Za pomocą mikroskopu świetlnego można wykryć tylko duże wirusy większe niż 150 nm. Rozpoznanie mniejszych wirusów jest możliwe tylko za pomocą mikroskopu elektronowego. Do wykrywania dużych wirusów można stosować mikroskopię świetlną, z kontrastem fazowym i fluorescencyjną.

Podczas infekcji wirusowych w zakażonych komórkach rozwijają się osobliwe inkluzje. Niektórym infekcjom towarzyszy tworzenie się inkluzji w cytoplazmie dotkniętych komórek (wścieklizna, szczepionka przeciwko ospie), innym - w cytoplazmie i jądrze (odra, ospa naturalna i wietrzna, choroby adenowirusowe). Inkluzje mają różny charakter, strukturę, kształt i wielkość od 0,25 do 25 mikronów. Według współczesnych danych, w niektórych inkluzjach inkluzje są miejscem namnażania się wirusa i reprezentują jego nagromadzenie otoczone substancjami komórkowymi, podczas gdy w innych są produktem degeneracji komórek.

Inkluzje można wykryć w wybarwionych odciskach organów i tkanek, zeskrobinach komórek, skrawkach histologicznych dotkniętej tkanki oraz zakażonych wirusem preparatach hodowli komórkowych. Kolorowanie często odbywa się zgodnie z metodą Romanovsky'ego-Giemsy. Do barwienia tą metodą preparaty utrwala się w mieszaninie Dubosque - Brazil - Bouin, składającej się z kwasu pikrynowego, formaliny, alkoholu, kwasu octowego. Wewnątrzkomórkowe inkluzje w większości infekcji wirusowych są oksyfilne i wybarwiają się na różowo lub liliowo zgodnie z metodą Romanovsky'ego-Giemsy.

Immunologiczne metody diagnozowania infekcji wirusowych. W ostatnich latach metody te stały się wiodącymi w laboratoryjnej diagnostyce zakażeń wirusowych. Wynika to w dużej mierze ze względów ekonomicznych, gdyż klasyczne metody analizy wirusologicznej są dość drogie. Ponadto czas trwania badań metodami wirusologicznymi (tygodnie), nawet jeśli są one dość skuteczne, czyni je retrospektywnymi.

Metody immunologiczne stosuje się zarówno do wykrywania antygenów wirusowych w różnych biosubstratach i obiektach środowiskowych, jak i do serodiagnostyki - wykrywania przeciwciał przeciwko antygenom wirusowym w surowicy krwi chorych ludzi i zwierząt laboratoryjnych. Ponadto metody badań immunologicznych są niezbędne do identyfikacji wirionów.

Oddziałując z organizmem, wirusy powodują powstawanie przeciwciał, które adsorbując się na wirionach, zapobiegają przenikaniu wirionów do komórek i rozwojowi działania cytopatycznego (CPE); zneutralizować śmiertelne działanie wirusów podczas ich rozmnażania w zarodkach kurzych i zwierzętach; dezaktywują hemaglutyniny wirionu i neuraminidazę, zapobiegając reakcji hemaglutynacji (RGA) i reakcji hemadsorpcji (RGads) na komórkach dotkniętych wirusem. Te przeciwciała neutralizujące wirusy powodują również aglutynację i wytrącanie cząstek wirusowych, a powstałe w ten sposób kompleksy immunologiczne wiążą dopełniacz. Dlatego do identyfikacji wirionów wykorzystuje się klasyczną reakcję neutralizacji (PH) na kulturach komórkowych, zarodkach kurzych i zwierzętach oraz jej modyfikacje: reakcję hamowania hemaglutynacji (HITA); reakcja hamowania hemadsorpcji (RTGads). Te same reakcje są stosowane w serodiagnostyce infekcji wirusowych w celu wykrycia przeciwciał neutralizujących wirusa w surowicy pacjentów zgodnie ze znanym antygenem wirusowym (diagnosticum).

Metoda mikroskopii immunoelektronowej (IEM). Mikroskopia elektronowa odgrywa obecnie ważną rolę w badaniu wirusów. To dane z mikroskopii elektronowej służą jako podstawa współczesnej klasyfikacji wirusów.

Nowym etapem w rozwoju badań wirusów pod mikroskopem elektronowym jest wykorzystanie technik mikroskopii immunoelektronowej. Dzięki tej metodzie możliwe stało się nie tylko bezpośrednie wykrywanie wirusów, ale także ich identyfikacja, a także szybkie serotypowanie szczepów wirusowych i miareczkowanie przeciwciał przeciwko nim. IEM zyskała duże znaczenie w określaniu lokalizacji antygenów wirusowych wewnątrz komórek makroorganizmu.

Niewątpliwą zaletą IEM jest wysoka czułość w porównaniu z konwencjonalnymi metodami mikroskopii elektronowej.

Kiedy antygen wirusa lub składnik wirusa wchodzi w kontakt z homologiczną surowicą odpornościową, tworzy się kompleks przeciwciało-antygen. Zjawisko to jest podstawą techniki stosowanej do wykrywania i identyfikacji antygenów wirusowych lub przeciwciał przeciwko nim. To właśnie te kompleksy antygenów z przeciwciałami po negatywnym barwieniu można obserwować w mikroskopie elektronowym. W diagnostyce klinicznej materiał antygenowy nie wymaga dokładnego oczyszczania. Tak więc, jeśli zostanie wykryty wirus grypy, można zbadać nieoczyszczony płyn omoczniowy. Obecnie uważa się, że prawie każdy rodzaj materiału klinicznego nadaje się do IEM. Do celów diagnostycznych można wykorzystać zarówno surowice zwykłe niefrakcjonowane, jak i surowice rekonwalescentów. Należy zauważyć, że stosunek ilości antygenu do przeciwciał ma duży wpływ na końcowe wyniki. Przy nadmiarze antygenu obserwuje się obfitość cząstek; aglomeratów w tym przypadku będzie niewiele. Przy nadmiarze przeciwciał cząsteczki wirusa są otoczone grubą warstwą, prawie niemożliwe jest ujawnienie drobnych szczegółów strukturalnych wirionu; agregaty są również nieliczne. Dzięki optymalnemu stosunkowi antygenu i przeciwciał agregaty są powiększone z dobrym obrazem szczegółów wirionów. Z powyższych rozważań wynika, że ​​pożądane jest stosowanie surowicy odpornościowej w kilku rozcieńczeniach.

Na siatkę nośną nakłada się folię nośną wykonaną z palladu. W przypadku stosowania niskich stężeń palladu oraz w celu poprawy właściwości adsorpcyjnych podłoża wzmacnia się go węglem. W tym celu węgiel jest natryskiwany na gotową suchą warstwę-podłoże na siatce mikroskopu elektronowego w próżni. Grubość folii-podłoża oraz wzmacniającej warstwy węglowej ma znaczący wpływ na kontrast i obraz drobnych szczegółów przedmiotu. Każdy badacz indywidualnie określa specyficzną grubość warstw podłoża i warstwy węglowej, opierając się na fakcie, że węgiel jest bardziej przezroczysty elektronowo niż pallad.

Wirusy i przeciwciała do nich mają niską gęstość elektronową. Dlatego obiektów biologicznych nie można wykryć za pomocą mikroskopu elektronowego bez wstępnej obróbki. Wirusy są wizualizowane przy użyciu techniki kontrastu ujemnego (lub barwienia ujemnego). Do negatywnego barwienia wirusów i kompleksów wirus-przeciwciało stosuje się różne sole metali ciężkich. Środki kontrastowe (atomy metali ciężkich) wnikają w hydrofilowe obszary przedmiotów i zastępują w nich wodę. W rezultacie gęstość elektronowa obiektu wzrasta i staje się możliwa jego obserwacja w mikroskopie elektronowym.

Bezpośrednia metoda IEM znalazła największe zastosowanie w praktyce. Zawiesinę wirusa miesza się z nierozcieńczoną surowicą odpornościową. Po energicznym mieszaniu mieszaninę inkubuje się przez 1 godzinę w temp

37°C, następnie przez noc w 4°C. Następnego dnia mieszaninę odwirowuje się w celu wytrącenia kompleksów immunologicznych. Osad ponownie zawiesza się w kropli wody destylowanej i poddaje działaniu kontrastu ujemnego.

Podczas oceny wyników IEM produkty interakcji między antygenem a przeciwciałem w mikroskopie elektronowym mogą mieć różny wygląd (pojedyncza cząsteczka wirusa pokryta przeciwciałami w całości lub w części; skupiska cząstek wirusa). Aglomeraty mogą zajmować inną powierzchnię, mieć inny wygląd i zawierać różną liczbę cząstek. Dlatego wraz z eksperymentalnymi konieczne jest badanie preparatów kontrolnych (z roztworem buforowym lub heterologiczną surowicą odpornościową).

Kryterium oceny wyników uzyskanych przy użyciu IEM jest obecność lub brak w preparatach skupisk cząstek wirusowych zagregowanych przez surowicę odpornościową. Obecność aglomeratów antygenu i swoistych przeciwciał surowicy odpornościowej jest oznaką pozytywnej reakcji. Niemniej jednak należy wziąć pod uwagę możliwość niespecyficznej agregacji cząstek antygenu pod wpływem wirowania z dużą prędkością. Z tego powodu wielu autorów zaleca rozpatrywanie wyników w skali warunkowej od 0 do 4+. Polega ona na ocenie stopnia pokrycia zagregowanych cząstek przeciwciałami surowicy.

Metody hemaglutynacji i hemadsorpcji. Wiele wirusów ma zdolność aglutynacji erytrocytów ściśle określonych gatunków ssaków i ptaków. Tak więc wirusy grypy i świnki aglutynują erytrocyty kurczaków, świnek morskich i ludzi; wirus kleszczowego zapalenia mózgu - erytrocyty owiec; Wirusy japońskiego zapalenia mózgu - erytrocyty jednodniowych kurcząt i gęsi; adenowirusy - erytrocyty szczurów, myszy, małp. Materiałem do badań w reakcji hemaglutynacji (HA) są płyny omoczniowe, owodniowe, zawiesina błon kosmówkowo-omoczniowych zarodków kurzych, zawiesiny i ekstrakty z hodowli komórek lub narządów zwierząt zakażonych wirusami. Reakcję hemaglutynacji można ustawić metodą kroplową na szkle oraz w rozszerzonym rzędzie w probówkach lub dołkach płytek polistyrenowych. Pierwsza metoda ma charakter orientacyjny.

Będąc specyficzną dla grupy, RGA nie pozwala na określenie gatunku wirusów. Identyfikuje się je za pomocą testu hamowania hemaglutynacji (HITA). Do jego formułowania stosuje się znane immunologiczne surowice przeciwwirusowe. Do każdego rozcieńczenia dodaje się taką samą ilość płynu zawierającego wirusy. Kontrolą jest zawiesina wirusa.

Mieszaninę trzyma się w termostacie, następnie dodaje się zawiesinę erytrocytów. Po kilku minutach oznacza się miano surowicy neutralizującej, tj. jego maksymalnego rozcieńczenia, co powodowało opóźnienie aglutynacji erytrocytów.

W diagnostyce serologicznej chorób wirusowych zaleca się stosowanie RTHA z parą surowic, z których jedną uzyskuje się na początku choroby, a drugą po 1-2 tygodniach lub dłużej. Czterokrotny wzrost miana przeciwciał w drugiej surowicy potwierdza postawioną diagnozę.

Reakcja hemadsorpcji (RGads) służy do wykrywania w zakażonych hodowlach komórkowych wirusa o aktywności hemaglutynującej. Istota reakcji polega na tym, że erytrocyty wrażliwe na hemaglutynujące działanie wirusów są adsorbowane na powierzchni komórek zakażonych wirusami. Na przykład erytrocyty kurczaka są adsorbowane na komórkach zakażonych wirusem ospy wietrznej; wirus odry - erytrocyty małp; adenowirusy - małpy i szczury itp.

Reakcja neutralizacji (PH). Rozmnażające się w hodowlach komórkowych wirusy powodują różnego rodzaju CPD, wyrażające się zaokrąglaniem, marszczeniem, redukcją lub odwrotnie, wzrostem wielkości komórek, ich fuzją i tworzeniem symplastów, niszczeniem cytoplazmy i jądra. Wreszcie w monowarstwie komórek zakażonych wirusami, w wyniku zniszczenia przez nie pewnych fragmentów warstwy komórkowej, mogą pojawić się „sterylne plamki” lub blaszki, które są klonem cząsteczki wirusowej, co umożliwia nie tylko wyizolować wirusa, ale także określić jego miano.

Bardzo trudno jest zidentyfikować wirusa na podstawie charakteru łysinek, dlatego uciekają się do ustalania PH wyizolowanego wirusa za pomocą znanych surowic neutralizujących wirusy. W tym celu wirusa uzyskanego od pacjenta gromadzi się w hodowli komórkowej, a jego różne rozcieńczenia miesza się z nierozcieńczoną surowicą przeciwwirusową.

Mieszanka wirusów i surowic może zainfekować zarodki kurcząt lub wrażliwe zwierzęta. W takich przypadkach o aktywności neutralizującej przeciwciał decyduje najczęściej neutralizacja wirusowych hemaglutynin w płynach zarodka i wyeliminowanie śmiertelnego wpływu wirusa na zarodki i zwierzęta. Jednocześnie obliczany jest wskaźnik neutralizacji, który wyraża maksymalną liczbę śmiertelnych dawek wirusa, które są neutralizowane przez tę surowicę, w porównaniu z wynikami eksperymentu kontrolnego, traktowanymi jako jeden.

Podobnie za pomocą PH ​​identyfikuje się wirusy wyizolowane z materiału pacjentów, gdy zakażają zarodki kurze i zwierzęta. W tym celu do surowic neutralizujących wirusy dodaje się zawierające wirusy płyny zarodków i zawiesiny dotkniętych narządów zwierząt. Po pewnym czasie inkubacji mieszaninami zakaża się hodowle komórkowe, zarodki kurcząt i zwierzęta.

W serodiagnostyce infekcji wirusowych określa się dynamikę wzrostu miana przeciwciał neutralizujących wirusa dla znanego wirusa. Jednocześnie ustala się PH parą surowic pobranych od pacjentów na początku i na końcu choroby. Diagnostycznym będzie 4-krotny wzrost miana immunoglobulin w drugim z nich.

PH opiera się na zdolności specyficznych przeciwciał do wystarczająco silnego wiązania się z cząsteczką wirusa. W wyniku interakcji między wirusem a przeciwciałem dochodzi do zneutralizowania zakaźnej aktywności wirusa w wyniku zablokowania determinant antygenowych odpowiedzialnych za łączenie cząsteczki wirusa z wrażliwymi komórkami. W efekcie wirus traci zdolność do namnażania się w wrażliwym układzie biologicznym in vitro lub in vivo.

Wyniki PH stają się widoczne po wprowadzeniu mieszaniny wirusa i jego homologicznych przeciwciał, po określonej ekspozycji, do wrażliwego systemu biologicznego (hodowla komórek tkankowych, zarodek kurzy, podatny organizm zwierzęcia), gdzie wirus może się namnażać i powodować mierzalne zmiany, które zostaną częściowo lub całkowicie stłumione w obecności przeciwciał.

W PH zaangażowane są trzy elementy:

• 1) wirus;
• 2) surowica zawierająca przeciwciała;
• 3) obiekt biologiczny (zwierzęta laboratoryjne, rozwijające się zarodki kurze, hodowle tkankowe), którego wybór uzależniony jest od rodzaju wirusa, z jakim mają być prowadzone badania.

PH stosuje się albo do identyfikacji izolowanego patogenu, albo do wykrywania i miareczkowania przeciwciał w surowicach. W pierwszym przypadku stosuje się surowice specjalnie immunizowanych zwierząt laboratoryjnych lub osób wyzdrowiałych. W drugim przypadku wykorzystuje się surowice pobrane w początkowej fazie choroby oraz w okresie rekonwalescencji.

Przeciwciała neutralizujące wirusy w surowicach osób, które wyzdrowiały, w przeciwieństwie do antyhemaglutynin lub przeciwciał wiążących dopełniacz, utrzymują się przez wiele lat, aw niektórych infekcjach wirusowych (np. odrze) nawet do końca życia. Pozwala to w niektórych przypadkach na wykorzystanie puli surowic wielu rekonwalescentów jako leku referencyjnego, który po napełnieniu ampułek i liofilizacji nadaje się do pracy diagnostycznej przez długi czas.

Do identyfikacji izolowanych patogenów stosuje się wstępnie przygotowane surowice hiperimmunologiczne różnych zwierząt: królików, białych szczurów i myszy, świnek morskich, małp, owiec, koni itp. Aktywność surowic hiperimmunizowanych na PH zależy od metody immunizacji zwierząt.

Przed rozpoczęciem każdego eksperymentu neutralizacji wirus jest wstępnie miareczkowany, określając ostateczne rozcieńczenie, które powoduje uszkodzenie kultury tkankowej lub zakażenie zwierząt laboratoryjnych (lub zarodków kurzych). Miano wirusa wyraża się jako dawkę 50% (TCID50 - 50% dawka zakaźna dla hodowli tkankowej).

Molekularne metody diagnostyki genetycznej w praktyce wirusologicznej. Metody biologii molekularnej zostały opracowane w latach 50. XX wiek. Stało się to możliwe dzięki temu, że w genomie każdego wirusa znajdują się unikalne, specyficzne dla gatunku sekwencje nukleotydowe, dzięki wykryciu, który czynnik zakaźny można zidentyfikować. Metody te są najważniejsze w identyfikacji mikroorganizmów, które są długotrwałe lub trudne do hodowli metodami konwencjonalnymi. W latach siedemdziesiątych XX wieku do wykrywania czynnika zakaźnego lub mutacji stosowano wykrywanie za pomocą sondy DNA w oparciu o hybrydyzację specyficznych sond oligonukleotydowych znakowanych radioaktywnym izotopem (lub fluorochromem) z wyizolowaną próbką DNA. Analiza hybrydyzacji wykorzystuje zdolność kwasów nukleinowych w określonych warunkach do tworzenia specyficznych kompleksów z kwasami nukleinowymi, które mają sekwencje do nich komplementarne. Metoda wykrywania zakaźnych patogenów metodą hybrydyzacji DNA okazała się niezwykle pracochłonna, czasochłonna i kosztowna. Ponadto jego czułość jest niewystarczająca do identyfikacji mikroorganizmów w materiałach klinicznych, takich jak kał i mocz.

Hybrydyzacja DNA została zastąpiona metodą naśladującą naturalną replikację DNA i pozwalającą na wykrycie i wielokrotne kopiowanie określonego fragmentu DNA za pomocą termofilnej polimerazy DNA. Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) to elegancka metoda, która naśladuje naturalną replikację DNA i umożliwia wielokrotne wykrywanie i kopiowanie określonego fragmentu DNA przy użyciu termofilnej polimerazy DNA.

Ze względu na swoje wysokie walory diagnostyczne PCR jest powszechnie uznawanym uzupełnieniem tradycyjnych metod stosowanych w wirusologii: namnażania wirusa w hodowli komórkowej, immunologicznej detekcji antygenów wirusowych oraz mikroskopii elektronowej. Istotną zaletą tej metody jest możliwość wykrywania wirusów w infekcjach utajonych (wirus cytomegalii, wirus opryszczki) oraz wirusów trudnych lub jeszcze niemożliwych do wyhodowania (ludzki wirus niedoboru odporności, wirus Epsteina-Barra, wirus brodawczaka ludzkiego, wirus zapalenia wątroby typu Vidr). Z metodą PCR wiążą się perspektywy badania chorób takich jak choroba Creutzfeldta-Jakoba, choroba Alzheimera czy stwardnienie rozsiane.