इम्यूनोब्लॉटिंग (इम्यूनोब्लॉट) एक अत्यधिक विशिष्ट और अत्यधिक संवेदनशील संदर्भ विधि है जो प्राप्त सकारात्मक या अनिश्चित परीक्षण परिणामों वाले रोगियों के निदान की पुष्टि करती है। रीगा या एलिसा का उपयोग करना। इम्यूनोब्लॉटिंग एक प्रकार का विषम प्रतिरक्षा परीक्षण है।

व्यक्तिगत रोगज़नक़ एंटीजन के प्रति एंटीबॉडी का पता लगाने की यह विधि नाइट्रोसेल्यूलोज़ झिल्ली पर एलिसा पर आधारित है, जिस पर विशिष्ट प्रोटीन को जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा अलग किए गए अलग-अलग बैंड के रूप में लागू किया जाता है। यदि कुछ एंटीजन के विरुद्ध एंटीबॉडी हैं, तो संबंधित पट्टी स्थान पर एक गहरी रेखा दिखाई देती है। इम्युनोब्लॉट की विशिष्टता इसकी उच्च सूचना सामग्री और प्राप्त परिणामों की विश्वसनीयता में निहित है।

अध्ययन के लिए सामग्री मानव सीरम या प्लाज्मा है। एक पट्टी पर शोध के लिए 1.5-2 मिली रक्त या 15-25 μl सीरम की आवश्यकता होती है।

LLC "प्रयोगशाला डायग्नोस्टिक्स" कंपनी "EUROIMMUN" (जर्मनी), "MIKROGEN" (जर्मनी) के विभिन्न रोगों के रोगजनकों के प्रति एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए इम्युनोब्लॉटिंग किट का उपयोग करती है:

एचएसवी 1 और एचएसवी 2 आईजीएम/आईजीजी(हर्पीसवायरस संक्रमण)

सीएमवी आईजीएम/आईजीजी(साइटोमेगालोवायरस संक्रमण)

रूबेला आईजीजी

टॉर्च प्रोफ़ाइल IgM(टोक्सोप्लाज्मोसिस, रूबेला, साइटोमेगालोवायरस, एचएसवी 1 और एचएसवी 2)

ईबीवी आईजीएमटीआईजीजी(एपस्टीन-बार वायरस संक्रमण)

एचसीवी आईजीजी(वायरल हेपेटाइटिस सी)

किट दो प्रकार की होती हैं - वेस्टर्न ब्लॉट और लाइन ब्लॉट।

पश्चिमी ब्लॉट:किट में संबंधित संक्रामक एजेंटों के इलेक्ट्रोफोरेटिक रूप से अलग किए गए देशी एंटीजन के साथ परीक्षण झिल्ली स्ट्रिप्स होते हैं, अर्थात। एंटीजन को आणविक भार के क्रम में व्यवस्थित किया जाता है। चिकित्सकीय रूप से महत्वपूर्ण एंटीजन (वेस्टर्न लाइन ब्लॉट) वाली 1-2 अतिरिक्त लाइनें भी झिल्लियों पर लगाई जा सकती हैं। यह एक विश्वसनीय पुष्टिकरण विधि है, जो गलत सकारात्मकताओं और परस्पर-प्रतिक्रियाओं को समाप्त करती है।

रेखा धब्बा:इस मामले में, केवल चिकित्सकीय रूप से महत्वपूर्ण एंटीजन (देशी, सिंथेटिक या पुनः संयोजक) को एक विशिष्ट क्रम में परीक्षण स्ट्रिप्स पर लागू किया जाता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग एक पट्टी पर कई संक्रमणों के विभेदक निदान में किया जाता है।

इसका सार बायोपॉलिमर के विभाजन के लिए उपयोग किए जाने वाले एक ठोस वाहक से परीक्षण पदार्थ के अणुओं को दूसरे में स्थानांतरित करने में निहित है, जहां उन्हें विशेष रूप से एक इम्यूनोकेमिकल प्रतिक्रिया का उपयोग करके पता लगाया जाता है। वायरल एंटीजन सहित प्रोटीन की पहचान करना एक आधुनिक अत्यधिक संवेदनशील तरीका है। यह विधि जेल वैद्युतकणसंचलन और एंटीजन-एंटीबॉडी प्रतिक्रिया के संयोजन पर आधारित है। प्रोटीन, ग्लाइको- और लिपोप्रोटीन के इलेक्ट्रोफोरेटिक पृथक्करण और प्रतिरक्षा सीरा या मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का पता लगाने की अधिकतम विशिष्टता के कारण उच्च स्तर का रिज़ॉल्यूशन प्राप्त किया जाता है। इष्टतम परिस्थितियों में, इम्युनोब्लॉटिंग परीक्षण मात्रा में 1 एनजी से कम मात्रा में एंटीजन का पता लगा सकता है। तकनीकी रूप से, इम्युनोब्लॉटिंग तीन चरणों में की जाती है:

1) विश्लेषण किए जाने वाले प्रोटीन को विकृतीकरण करने वाले पदार्थों की उपस्थिति में पॉलीएक्रिलामाइड जेल में पृथक्करण के अधीन किया जाता है: सोडियम डोडेसिल सल्फेट या यूरिया, इस प्रक्रिया को अक्सर एसडीएस-पेज के रूप में जाना जाता है; अलग किए गए प्रोटीन को धुंधला होने के बाद देखा जा सकता है और संदर्भ नमूनों के साथ तुलना की जा सकती है;

2) अलग किए गए प्रोटीन को जेल से ओवरलेइंग (ब्लोटिंग) द्वारा स्थानांतरित किया जाता है
नाइट्रोसेल्यूलोज फ़िल्टर और उस पर स्थिर; कई मामलों में, लेकिन
स्थानांतरण के दौरान हमेशा प्रोटीन का मात्रात्मक अनुपात संरक्षित नहीं रहता;

3) फिल्टर को पॉली- या मोनोक्लोनल का पता लगाने के साथ लेपित किया जाता है
रेडियोआइसोटोप या एंजाइम लेबल युक्त एंटीबॉडी; के लिए
बाध्य एंटीबॉडी का पता लगाने, प्रजाति-विरोधी विश्लेषण का भी उपयोग किया जाता है
लेबल सीरम, दूसरे शब्दों में, अंतिम चरण में, सोखना
ठोस-चरण इम्यूनोपरख के समान।

यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि इम्युनोब्लॉटिंग की इस सेटिंग में, प्रोटीन विकृत अवस्था में होते हैं, और इसलिए उन्हें मूल प्रोटीन के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी द्वारा नहीं पहचाना जा सकता है, लेकिन सभी घटक पेप्टाइड्स, संपूर्ण एंटीजेनिक में सीरा की उपस्थिति में परीक्षण किए गए प्रोटीन के स्पेक्ट्रम का एक साथ पता लगाया जाता है। इम्यूनोब्लॉटिंग का व्यापक रूप से हेपेटाइटिस वायरस की संरचना के अध्ययन में उपयोग किया जाता है, विशेष रूप से, व्यक्तिगत उपभेदों के बीच एंटीजेनिक संबंध स्थापित करने के लिए। इम्युनोब्लॉटिंग का उच्च रिज़ॉल्यूशन नैदानिक ​​​​अभ्यास में अच्छे परिणाम प्राप्त करना संभव बनाता है, जब रोगी के ऊतकों या उत्सर्जन में वायरस की पहचान करना आवश्यक होता है।

परीक्षण पदार्थ के आधार पर, डीएनए, आरएनए और प्रोटीन को प्रतिष्ठित किया जाता है - ब्लॉटिंग।

एक लेबल के साथ संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग करके एंटीजन का इम्यूनोकेमिकल पता लगाया जा सकता है। हाल ही में, रेडियोधर्मी आइसोटोप या एंजाइम (पेरोक्सीडेज, क्षारीय फॉस्फेट, लैक्टामेज, आदि) का व्यापक रूप से लेबल के रूप में उपयोग किया गया है।

डिफ्यूजन ब्लॉटिंग का समय 36-48 घंटे है। लेकिन जैल से प्रोटीन को स्थानांतरित करने का सबसे तेज़ और सबसे कुशल तरीका इलेक्ट्रोब्लॉटिंग है, जो आम तौर पर 1-3 घंटे है, कुछ उच्च आणविक भार प्रोटीन के लिए 12 घंटे से अधिक।

ब्लॉट्स के विभिन्न संशोधनों (तदनुसार उपचारित नाइट्रोसेल्यूलोज या पेपर) के लिए शर्बत की विशिष्ट पसंद, एंटीजन को अवरुद्ध करने और इम्यूनोकेमिकल का पता लगाने के लिए स्थितियों का चुनाव पूरी तरह से एंटीजन, इसकी मात्रा, इम्यूनोएसे की विधि और अध्ययन के उद्देश्यों पर निर्भर करता है।

विशिष्ट रोगज़नक़ एंटीजन के प्रति एंटीबॉडी का पता लगाने की क्षमता, क्रॉस एंटीजन की प्रतिक्रिया को बाहर करने के लिए, इन एंटीबॉडी (किसी दिए गए एटियोलॉजिकल एजेंट के लिए विशिष्टता) के महत्व का आकलन करना संभव बनाती है। यही बात इम्युनोब्लॉटिंग को एलिसा से अलग करती है, जहां एंटीजेनिक निर्धारकों के विभिन्न संयोजनों को एंटीजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है - विशिष्ट और गैर दोनों, जो अन्य रोगजनकों के साथ क्रॉस-रिएक्शन देते हैं। अन्यथा, जब एक सकारात्मक एलिसा परिणाम प्राप्त होता है, तो कोई केवल यह मान सकता है कि यह एक क्रॉस-रिएक्शन का परिणाम है, और इम्युनोब्लॉटिंग के मामले में, यह निर्णायक है।

आईबी विधि, कई कारणों से, पुष्टिकरण परीक्षण के रूप में उपयोग के लिए उपयुक्त विधि के रूप में सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि बन गई है।

विधि का निस्संदेह लाभ कमजोर या पूरी तरह से अघुलनशील एंटीजन के लिए एंटीबॉडी का परीक्षण करने की संभावना है और एंटीजन में रेडियोधर्मी लेबल पेश करने के चरण का बहिष्कार है।

आईबी के मामले में संवेदनशीलता को जेल पर जमा एंटीजन की सीमित मात्रा से आंका जाता है, जो प्रोटीन को विभाजित करते समय, जेल से ठोस चरण (नाइट्रोसेल्यूलोज) में स्थानांतरित होने के बाद प्रतिरक्षा रासायनिक रूप से पता लगाया जा सकता है। परख की समग्र संवेदनशीलता कई कारकों पर निर्भर करती है: एक ठोस वाहक पर एंटीजन के विभाजन और स्थिरीकरण की स्थितियां, पृष्ठभूमि स्तर, एंटीबॉडी की विशिष्टता और आत्मीयता। उपयोग किए गए लेबल का प्रकार और इसका पता कैसे लगाया जाता है यह महत्वपूर्ण है।

इस प्रकार, इम्युनोब्लॉटिंग की विधि पूरे प्रोटीन को विशिष्ट सीरम एंटीबॉडी से बांधे बिना ठोस चरण पर एंटीजन के क्षेत्रों की पहचान करना संभव बनाती है। इम्युनोब्लॉटिंग और इसके संशोधनों का उपयोग मुख्य रूप से बैक्टीरिया और वायरल एंटीजन और एंटीबॉडी टाइप करने के लिए किया जाता है, विशेष रूप से पारंपरिक प्रणालियों के अपर्याप्त रिज़ॉल्यूशन के मामले में, साथ ही इम्युनोग्लोबुलिन, न्यूक्लिक एसिड के विश्लेषण में, या अन्य तरीकों के संयोजन में एक पुष्टिकरण परीक्षण के रूप में।

क्रॉस-प्रतिक्रियाओं के परिणामों की व्याख्या करने और सेरोकनवर्जन के प्रारंभिक चरणों के मामलों में बड़ी कठिनाई। पहली स्थिति में, जब एक निश्चित अवधि के बाद दोबारा जांच की जाती है, तो एंटीबॉडी का पता नहीं चलता है, और दूसरी इम्युनोब्लॉट में, नए बैंड दिखाई देते हैं, जो एचआईवी प्रोटीन या ग्लाइकोप्रोटीन के प्रति एंटीबॉडी की उपस्थिति का संकेत देते हैं, जो प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की प्रतिक्रिया गतिशीलता को दर्शाते हैं। वायरस एंटीजन के लिए.

यह वास्तव में सीरोलॉजिकल परीक्षणों की श्रृंखला में अंतिम सत्यापन विधि है, जो रोगी की एचआईवी सकारात्मकता के बारे में अंतिम निष्कर्ष निकालने या इसे अस्वीकार करने की अनुमति देती है। आईबी की स्थापना के लिए, नाइट्रोसेल्यूलोज स्ट्रिप्स का उपयोग किया जाता है, जिस पर एचआईवी प्रोटीन को उनके आणविक भार को बढ़ाने के क्रम में क्षैतिज और फिर ऊर्ध्वाधर इम्यूनोफोरेसिस की विधि द्वारा अग्रिम रूप से स्थानांतरित किया जाता है। परीक्षण किए गए सीरा के एंटीबॉडी पट्टी के कुछ क्षेत्रों में प्रोटीन के साथ परस्पर क्रिया करते हैं। प्रतिक्रिया का आगे का कोर्स एलिसा से अलग नहीं है, यानी, इसमें एक संयुग्म और क्रोमोजेन-सब्सट्रेट के साथ एक पट्टी (पट्टी) का उपचार, अनबाउंड घटकों को धोना और आसुत जल के साथ प्रतिक्रिया को रोकना शामिल है। प्रोटीन का प्रारंभिक इलेक्ट्रोफोरेटिक पृथक्करण और नाइट्रोसेल्यूलोज पर उनका निर्धारण पट्टी के संबंधित क्षेत्रों के धुंधलापन (भूरा-नीला) की उपस्थिति (या अनुपस्थिति) के अनुसार विशिष्ट प्रोटीन के प्रति एंटीबॉडी की पहचान करना संभव बनाता है। इम्यूनोब्लॉटिंग का उपयोग इसकी उच्च लागत के कारण बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग अध्ययन के लिए नहीं किया जा सकता है और यह सीरोलॉजिकल अध्ययन के अंतिम चरण में व्यक्तिगत मध्यस्थता की एक विधि है।

आईबी और एलिसा में सीरा के अध्ययन के परिणामों के बीच काफी स्पष्ट संबंध है। एलिसा (विभिन्न परीक्षण प्रणालियों में) सीरा में दो बार सकारात्मक होने पर 97-98% मामलों में आईबी में एचआईवी पॉजिटिव के रूप में व्याख्या की जाती है। उपयोग की जाने वाली दो परीक्षण प्रणालियों में से केवल एक में एलिसा पॉजिटिव सीरम आईबी में 4% से अधिक मामलों में एचआईवी पॉजिटिव निकलते हैं। पुष्टिकरण अध्ययन करते समय, लगभग 5% आईबी तथाकथित "अनिश्चित" परिणाम दे सकते हैं, जो, एक नियम के रूप में, सकारात्मक एलिसा के अनुरूप होते हैं, लेकिन आरआईपी के अनुरूप नहीं। लगभग 20% मामलों में, "अनिश्चित" आईबी एचआईवी-1 गैग प्रोटीन (पी55, पी25, पी18) के प्रति एंटीबॉडी के कारण होता है। इम्युनोब्लॉटिंग के संदिग्ध परिणाम प्राप्त होने पर, अध्ययन को 3 महीने के बाद दोहराना आवश्यक है और, यदि परिणाम की अनिश्चितता बनी रहती है, तो 6 महीने के बाद।

रेडियो-प्रतिरक्षा विधि (आरआईएम) (रेडियोइम्यूनोलॉजिकल विश्लेषण, आरआईए)रेडियोइम्यूनोएसे जैविक तरल पदार्थों में जैविक रूप से सक्रिय पदार्थों (हार्मोन, एंजाइम, ड्रग्स, आदि) के मात्रात्मक निर्धारण के लिए एक विधि है, जो विशिष्ट बाइंडिंग सिस्टम के साथ रेडियोन्यूक्लाइड के साथ लेबल किए गए वांछित स्थिर और समान पदार्थों के प्रतिस्पर्धी बंधन पर आधारित है। उत्तरार्द्ध अक्सर विशिष्ट एंटीबॉडी होते हैं। इस तथ्य के कारण कि लेबल किए गए एंटीजन को एक निश्चित मात्रा में जोड़ा जाता है, पदार्थ के उस हिस्से को निर्धारित करना संभव है जो एंटीबॉडी से बंधा हुआ है, और वह हिस्सा जो बिना लेबल वाले एंटीजन के साथ प्रतिस्पर्धा के परिणामस्वरूप अनबाउंड रहता है। अध्ययन इन विट्रो में किया जाता है। आर और के लिए. अभिकर्मकों के मानक किट तैयार करें, जिनमें से प्रत्येक को किसी एक पदार्थ की सांद्रता निर्धारित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। अध्ययन कई चरणों में किया जाता है: जैविक सामग्री को अभिकर्मकों के साथ मिलाया जाता है, मिश्रण को कई घंटों तक ऊष्मायन किया जाता है, मुक्त और बाध्य रेडियोधर्मी पदार्थ को अलग किया जाता है, नमूनों की रेडियोमेट्री की जाती है, और परिणामों की गणना की जाती है। विधि अत्यधिक संवेदनशील है, इसका उपयोग हृदय, अंतःस्रावी और अन्य प्रणालियों के रोगों के निदान में, बांझपन के कारणों को निर्धारित करने के लिए, भ्रूण के विकास संबंधी विकारों को निर्धारित करने के लिए, ऑन्कोलॉजी में ट्यूमर मार्करों को निर्धारित करने और उपचार की प्रभावशीलता की निगरानी करने के लिए किया जा सकता है। इम्युनोग्लोबुलिन, एंजाइम और औषधीय पदार्थों की एकाग्रता। कुछ मामलों में, अध्ययन कार्यात्मक लोडिंग परीक्षणों की पृष्ठभूमि के खिलाफ किया जाता है (उदाहरण के लिए, ग्लूकोज सहिष्णुता परीक्षण की पृष्ठभूमि के खिलाफ रक्त सीरम में इंसुलिन सामग्री का निर्धारण) या गतिशीलता में (उदाहरण के लिए, रक्त में सेक्स हार्मोन का निर्धारण) मासिक धर्म चक्र)।

ABBOTT - ऑस्ट्रिया II-I 125 की एक वाणिज्यिक किट की मदद से, 0.1 एनजी/एमएल तक की सांद्रता पर HBsAg का पता लगाना संभव है। विधि के फायदों में संख्यात्मक शब्दों में उत्तर प्राप्त करने के साथ विधि के मानकीकरण और स्वचालन की संभावना शामिल है। विधि का नुकसान रेडियोधर्मी सामग्री के साथ संचालन के तरीके द्वारा निर्धारित सीमाएं और डायग्नोस्टिक किट का अपेक्षाकृत कम शेल्फ जीवन है, जो रेडियोधर्मी लेबल के क्षय से जुड़ा हुआ है।

हेपेटाइटिस ए, बी और डी वायरस के विभिन्न एंटीजन और उनके प्रति एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए डायग्नोस्टिक किट आइसोटोप (ताशकंद) और कुछ विदेशी कंपनियों (उदाहरण के लिए, एबीबीओटीटी) द्वारा उत्पादित की जाती हैं। पॉलीस्टाइरीन मोतियों (ABBOTT) या टेस्ट ट्यूब (आइसोटोप) का उपयोग ठोस चरण के रूप में किया जाता है। एंटीबॉडी या एंटीजन को लेबल करने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला आइसोटोप I 125 है, जिसका आधा जीवन 60 दिनों और उच्च विशिष्ट रेडियोधर्मिता है। रेडियोधर्मी लेबल, यानी विकिरण का मापन विशेष काउंटरों - रेडियो स्पेक्ट्रोमीटर पर किया जाता है। नियंत्रण और परीक्षण दोनों नमूनों में रेडियोधर्मी दालों की गिनती एक निश्चित समय पर की जाती है, आमतौर पर 1 मिनट के भीतर। प्रतिक्रिया के परिणामों का विश्लेषण करते समय, रेडियोधर्मिता की पृष्ठभूमि की उपस्थिति को ध्यान में रखना आवश्यक है, जो प्रतिक्रिया के अंतिम परिणाम को प्रभावित कर सकता है। बढ़ी हुई पृष्ठभूमि के कारण हो सकते हैं: नमूना कंटेनर या घोंसले का संदूषण; डिवाइस की गलत सेटिंग; उपकरण के पास तीव्र विकिरण के स्रोत की उपस्थिति।

नमूनों की प्रारंभिक जांच से प्राप्त सकारात्मक परिणाम की पुष्टि करने के लिए, दोबारा आरआईए या वैकल्पिक परीक्षण की सिफारिश की जाती है। यदि HBsAg का पता चलता है, तो एक पुष्टिकरण परीक्षण किया जाना चाहिए।

तालिका 1. टीकों का वर्गीकरण

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इम्यून ब्लॉटिंग (इम्यूनोब्लॉट, वेस्टर्न ब्लॉट, वेस्टर्न ब्लॉट)- एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट परख (एलिसा) को नाइट्रोसेल्यूलोज स्ट्रिप (स्ट्रिप) में वायरस एंटीजन के प्रारंभिक इलेक्ट्रोफोरेटिक ट्रांसफर के साथ जोड़ता है।

इस सुंदर वैज्ञानिक नाम में, "ब्लॉट" का अनुवाद संभवतः "ब्लॉट" के रूप में किया जाता है, और "वेस्टर्न" का अनुवाद "वेस्टर्न" के रूप में किया जाता है, जो इस "ब्लॉट" के वितरण की दिशा को कागज पर बाएं से दाएं, यानी भौगोलिक मानचित्र पर दर्शाता है। यह पश्चिम से पूर्व की दिशा के अनुरूप है।" "इम्यून ब्लॉट" विधि का सार यह है कि इम्यूनोएंजाइमैटिक प्रतिक्रिया एंटीजन के मिश्रण के साथ नहीं की जाती है, बल्कि एचआईवी एंटीजन के साथ की जाती है, जो पहले नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली की सतह पर आणविक भार के अनुसार स्थित अंशों में इम्यूनोफोरेसिस द्वारा वितरित की जाती थी। परिणामस्वरूप, एचआईवी के मुख्य प्रोटीन, एंटीजेनिक निर्धारकों के वाहक, अलग-अलग बैंड के रूप में सतह पर वितरित होते हैं, जो एंजाइम इम्यूनोएसे के दौरान दिखाई देते हैं।

इम्यूनोब्लॉट में कई चरण शामिल हैं:

पट्टी की तैयारी.इम्युनोडेफिशिएंसी वायरस (एचआईवी), जिसे पहले शुद्ध किया गया है और इसके घटक घटकों को नष्ट कर दिया गया है, को इलेक्ट्रोफोरेसिस के अधीन किया जाता है, जबकि एचआईवी बनाने वाले एंटीजन को आणविक भार से अलग किया जाता है। फिर, ब्लॉटिंग द्वारा ("ब्लॉटर" पर अतिरिक्त स्याही को निचोड़ने के समान), एंटीजन को नाइट्रोसेल्यूलोज की एक पट्टी में स्थानांतरित कर दिया जाता है, जिसमें अब एचआईवी की विशेषता वाले एंटीजेनिक बैंड का एक स्पेक्ट्रम होता है, जो आंखों के लिए अदृश्य है।

नमूना अध्ययन.परीक्षण सामग्री (सीरम, रोगी का रक्त प्लाज्मा, आदि) को नाइट्रोसेल्यूलोज स्ट्रिप पर लगाया जाता है, और यदि नमूने में विशिष्ट एंटीबॉडी हैं, तो वे कड़ाई से संबंधित (पूरक) एंटीजेनिक बैंड से बंध जाते हैं। बाद के जोड़-तोड़ के परिणामस्वरूप, इस अंतःक्रिया के परिणाम की कल्पना की जाती है - दृश्यमान बनाया जाता है।

परिणाम की व्याख्या.नाइट्रोसेल्यूलोज प्लेट के कुछ क्षेत्रों में बैंड की उपस्थिति कड़ाई से परिभाषित एचआईवी एंटीजन के लिए अध्ययन किए गए सीरम में एंटीबॉडी की उपस्थिति की पुष्टि करती है।

लेन ए - सकारात्मक नियंत्रण

लेन बी - कमजोर सकारात्मक नियंत्रण

लेन सी - नकारात्मक नियंत्रण

स्ट्रिप डी - सकारात्मक नमूना (एचआईवी-1 के प्रति एंटीबॉडी का पता चला)

वर्तमान में, परीक्षण सीरम में वायरस-विशिष्ट एंटीबॉडी की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए इम्यून ब्लॉटिंग (इम्यूनोब्लॉट) मुख्य विधि है। एचआईवी संक्रमण के कुछ मामलों में, सेरोकनवर्जन से पहले, एलिसा की तुलना में इम्युनोब्लॉटिंग द्वारा विशिष्ट एंटीबॉडी का अधिक प्रभावी ढंग से पता लगाया जाता है। एक इम्यून ब्लॉटिंग अध्ययन से पता चला है कि जीपी 41 के प्रति एंटीबॉडी अक्सर एड्स रोगियों के सीरा में पाए जाते हैं, और रोगनिरोधी उद्देश्यों के लिए जांच किए गए व्यक्तियों में पी 24 का पता लगाने के लिए एचआईवी संक्रमण की उपस्थिति के लिए अतिरिक्त अध्ययन की आवश्यकता होती है। आनुवंशिक रूप से इंजीनियर किए गए पुनः संयोजक प्रोटीन पर आधारित इम्युनोब्लॉट परीक्षण प्रणालियाँ शुद्ध वायरस लाइसेट पर आधारित पारंपरिक प्रणालियों की तुलना में अधिक विशिष्ट साबित हुईं। पुनः संयोजक एंटीजन का उपयोग करते समय, एक फैलाना नहीं, बल्कि एंटीजन का एक स्पष्ट रूप से परिभाषित संकीर्ण बैंड बनता है, जो लेखांकन और मूल्यांकन के लिए आसानी से सुलभ है।

एचआईवी-1 से संक्रमित व्यक्तियों का सीरम, निम्नलिखित प्रमुख प्रोटीन और ग्लाइकोप्रोटीन के प्रति एंटीबॉडी का पता लगाता है - संरचनात्मक लिफाफा प्रोटीन (एनवी) - जीपी160, जीपी120, जीपी41; नाभिक (गैग) - पी17, पी24, पी55, साथ ही वायरस एंजाइम (पोल) - पी31, पी51, पी66। एचआईवी-2 के लिए, एनवी के प्रति एंटीबॉडी विशिष्ट हैं - जीपी140, जीपी105, जीपी36; गैग - पी16, पी25, पी56; पोल-पी68.

प्रतिक्रिया की विशिष्टता स्थापित करने के लिए आवश्यक प्रयोगशाला विधियों में, एचआईवी-1 लिफ़ाफ़ा प्रोटीन - जीपी41, जीपी120, जीपी160, और एचआईवी-2 - जीपी36, जीपी105, जीपी140 के प्रति एंटीबॉडी का पता लगाना सबसे बड़ी मान्यता है।

यदि इम्यूनोब्लॉटिंग द्वारा किन्हीं दो एचआईवी ग्लाइकोप्रोटीन के प्रति एंटीबॉडी का पता लगाया जाता है तो डब्ल्यूएचओ सीरा पॉजिटिव मानता है। इन सिफारिशों के अनुसार, यदि अन्य प्रोटीनों के साथ संयोजन में या बिना प्रतिक्रिया के केवल एक लिफाफा प्रोटीन (आरपी ​​160, आरपी 120, आरपी 41) के साथ प्रतिक्रिया होती है, तो परिणाम को संदिग्ध माना जाता है और एक किट का उपयोग करके दूसरे परीक्षण की सिफारिश की जाती है किसी अन्य श्रृंखला से या किसी अन्य कंपनी से। यदि इसके बाद भी परिणाम संदिग्ध रहता है, तो 6 महीने तक निगरानी (3 महीने के बाद शोध) की सिफारिश की जाती है।

पी24 एंटीजन के साथ एक सकारात्मक प्रतिक्रिया की उपस्थिति सेरोकनवर्जन की अवधि का संकेत दे सकती है, क्योंकि इस प्रोटीन के एंटीबॉडी कभी-कभी पहले दिखाई देते हैं। इस मामले में, नैदानिक ​​और महामारी विज्ञान के आंकड़ों के आधार पर, कम से कम 2 सप्ताह बाद लिए गए सीरम नमूने के साथ अध्ययन को दोहराने की सिफारिश की जाती है, और यह बिल्कुल वैसा ही मामला है जब एचआईवी संक्रमण में युग्मित सीरा आवश्यक होता है।

एनवी प्रोटीन के साथ प्रतिक्रिया की उपस्थिति के बिना गैग और पोल प्रोटीन के साथ सकारात्मक प्रतिक्रियाएं प्रारंभिक सेरोकनवर्जन के चरण को प्रतिबिंबित कर सकती हैं, और एचआईवी -2 संक्रमण या एक गैर-विशिष्ट प्रतिक्रिया का संकेत भी दे सकती हैं। एचआईवी-2 के परीक्षण के बाद ऐसे परिणाम वाले व्यक्तियों की 3 महीने के बाद (6 महीने के भीतर) दोबारा जांच की जाती है।

विवरण

निर्धारण की विधिइम्यूनोब्लॉट।

अध्ययनाधीन सामग्रीसीरम

घर का दौरा उपलब्ध है

एंटीन्यूक्लियर एंटीबॉडीज स्वप्रतिपिंडों का एक परिवार है जो राइबोन्यूक्लिक एसिड और उनके संबंधित प्रोटीन से बंधते हैं। वे फैलने वाले संयोजी ऊतक रोगों वाले 90% से अधिक रोगियों में होते हैं, और अक्सर ऑटोइम्यून यकृत रोगों और कई अन्य स्थितियों में भी देखे जाते हैं। आज तक, ऑटोएंटीबॉडी के इस परिवार की लगभग 200 किस्मों की पहचान की गई है, लेकिन उनमें से सभी का उपयोग नैदानिक ​​​​अभ्यास में नहीं किया जा सकता है।

एंटीन्यूक्लियर एंटीबॉडी का इम्युनोब्लॉट एक परीक्षण में 15 मुख्य प्रकार के एंटीन्यूक्लियर एंटीबॉडी का एक साथ अध्ययन करने की अनुमति देता है, जो मुख्य प्रणालीगत आमवाती रोगों का विभेदक निदान सुनिश्चित करता है। इम्युनोब्लॉट द्वारा पता लगाए गए प्रत्येक प्रकार के ऑटोएंटीबॉडी आमतौर पर एक विशिष्ट नैदानिक ​​​​तस्वीर वाले रोगियों में देखे जाते हैं, इसलिए ऑटोएंटीबॉडी का स्पेक्ट्रम न केवल बीमारी का निदान करने की अनुमति देता है, बल्कि कुछ नैदानिक ​​​​अभिव्यक्तियों के विकास के जोखिम को भी स्थापित करने की अनुमति देता है।

एंटीन्यूक्लियर एंटीबॉडी के एक इम्युनोब्लॉट को सीरोलॉजिकल परीक्षा के दूसरे चरण में उपयोग करने की सलाह दी जाती है, जबकि अन्य परीक्षणों के सकारात्मक परिणाम से विषय के सीरम में एंटीन्यूक्लियर एंटीबॉडी की उपस्थिति का संकेत मिलता है। इन परीक्षणों में एंटीन्यूक्लियर एंटीबॉडीज (एलिसा स्क्रीनिंग) का निर्धारण, हेप2 कोशिकाओं पर एंटीन्यूक्लियर फैक्टर (एएनएफ) का पता लगाना, एंटीन्यूक्लियर एंटीबॉडीज और एक्सट्रेक्टेबल न्यूक्लियर एंटीजन (ईएनए) के लिए एंटीबॉडीज शामिल हैं।

प्रणालीगत आमवाती रोगों के निदान में एंटीन्यूक्लियर एंटीबॉडी की इम्युनोब्लॉट विधि उच्च नैदानिक ​​विशिष्टता की विशेषता है। लेकिन एएनएफ () के उच्च अनुमापांक पर भी, एंटीन्यूक्लियर एंटीबॉडी की विशिष्टता स्थापित करना हमेशा संभव नहीं होता है, क्योंकि कई एंटीन्यूक्लियर एंटीबॉडी एंटीजन अभी भी अप्रचलित रहते हैं। इस मामले में एक नकारात्मक इम्युनोब्लॉट परिणाम प्रणालीगत आमवाती रोगों के निदान को बाहर नहीं करता है। एक इम्युनोब्लॉट - मायोसिटिस-विशिष्ट ऑटोएंटीबॉडीज़ का एक पैनल () और एक इम्युनोब्लॉट - स्क्लेरोडर्मा में ऑटोएंटीबॉडीज़ का एक पैनल - का उपयोग करके कई एंटीन्यूक्लियर एंटीबॉडी का पता लगाया जा सकता है।

साहित्य

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7. अभिकर्मक किट निर्देश.

तैयारी

अंतिम भोजन के 4 घंटे बाद तक इसे झेलना बेहतर है, कोई अनिवार्य आवश्यकता नहीं है।

नियुक्ति के लिए संकेत

परीक्षण को निम्नलिखित स्थितियों के निदान और विभेदक निदान के लिए संकेत दिया गया है:

• प्रणालीगत एक प्रकार का वृक्ष;
• सबस्यूट क्यूटेनियस ल्यूपस और अन्य प्रकार के क्यूटेनियस ल्यूपस;
• मिश्रित संयोजी ऊतक रोग;
• स्जोग्रेन सिंड्रोम और संबंधित रोग;
• फैलाना और स्थानीयकृत स्क्लेरोडर्मा, क्रेस्ट सिंड्रोम;
• सूजन संबंधी मायोपैथी (पॉलीमायोसिटिस और डर्माटोमायोसिटिस);
• किशोर जीर्ण गठिया;
• ऑटोइम्यून हेपेटाइटिस;
• प्राथमिक पित्त सिरोसिस और स्केलेरोजिंग पित्तवाहिनीशोथ;
• इस परीक्षण का उपयोग एंटीन्यूक्लियर फैक्टर के उच्च अनुमापांक, एंटीन्यूक्लियर एंटीबॉडी, निकालने योग्य परमाणु एंटीजन के लिए एंटीबॉडी, डीएनए के लिए एंटीबॉडी, न्यूक्लियोसोम के लिए एंटीबॉडी और एंटीफॉस्फोलिपिड एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए संकेत दिया गया है।

परिणामों की व्याख्या

परीक्षण परिणामों की व्याख्या में उपस्थित चिकित्सक के लिए जानकारी शामिल है और यह निदान नहीं है। इस अनुभाग की जानकारी का उपयोग स्व-निदान या स्व-उपचार के लिए नहीं किया जाना चाहिए। इस परीक्षा के परिणामों और अन्य स्रोतों से आवश्यक जानकारी का उपयोग करके डॉक्टर द्वारा एक सटीक निदान किया जाता है: इतिहास, अन्य परीक्षाओं के परिणाम, आदि।

माप की इकाइयाँ: गुणात्मक परीक्षण, परिणाम "पता चला" या "नहीं मिला" के रूप में प्रस्तुत किया जाता है।

जब किसी प्रकार के एंटीबॉडी की उपस्थिति को दर्शाने वाले बैंड का पता लगाया जाता है, तो बैंड की रंग तीव्रता को प्रत्येक पहचाने गए प्रकार के एंटीबॉडी के लिए प्लस ("क्रॉस") की संख्या द्वारा अतिरिक्त रूप से वर्णित किया जाता है। सकारात्मकता की डिग्री में वृद्धि अप्रत्यक्ष रूप से ऑटोएंटीबॉडी की सामग्री और आत्मीयता को दर्शाती है।

संदर्भ मान: एसएम, आरएनपी/एसएम, एसएस-ए (60 केडीए), एसएस-ए (52 केडीए), एसएस-बी, एससीएल-70, पीएम-एससीएल, पीसीएनए, सीईएनपी-बी, डीएसडीएनए, हिस्टोन, न्यूक्लियोसोम के प्रति एंटीबॉडी , रिब पी, एएमए-एम2, जो-1 नहीं मिले।

ऑटोएंटीबॉडी के निर्धारण का परिणाम प्रत्येक संबंधित एंटीजन के लिए "क्रॉस" में प्रस्तुत किया गया है। सेरोपोसिटिविटी की डिग्री में वृद्धि अप्रत्यक्ष रूप से ऑटोएंटीबॉडी की सामग्री और आत्मीयता को दर्शाती है। सेरोपोसिटिविटी स्कोर विकल्प नीचे सूचीबद्ध हैं:

1. एंटीबॉडीज नहीं मिलीं.
2. +/- - सीमा रेखा परिणाम;
3. + - एक विशिष्ट एंटीजन के लिए स्वप्रतिपिंडों की कम सामग्री;
4. ++ एक विशिष्ट एंटीजन के लिए स्वप्रतिपिंडों की औसत सामग्री है;
5. +++ - एक विशिष्ट एंटीजन के लिए स्वप्रतिपिंडों की उच्च सामग्री।

एंटीन्यूक्लियर एंटीबॉडी का पता लगाने से जुड़ी मुख्य बीमारियाँ:

एंटीजन	अर्थ
एसएम (स्मिथ)	सिस्टमिक ल्यूपस एरिथेमेटोसस के लिए विशिष्ट मार्कर (अमेरिकन कॉलेज ऑफ रुमेटोलॉजी, एसीआर के एसएलई के लिए 10वें मानदंड में शामिल)
एसएस-ए (Ro52)	यह विभिन्न ऑटोइम्यून बीमारियों में देखा जाता है, अधिक बार प्रणालीगत ल्यूपस एरिथेमेटोसस और इसके त्वचा रूपों, प्रणालीगत गठिया रोगों, संधिशोथ, ऑटोइम्यून यकृत रोगों आदि में।
एसएस-ए (Ro60)	सिस्टमिक ल्यूपस एरिथेमेटोसस, ल्यूपस एरिथेमेटोसस के त्वचीय रूप, सिस्टमिक ल्यूपस एरिथेमेटोसस में प्रकाश संवेदनशीलता, जन्मजात ल्यूपस एरिथेमेटोसस और भ्रूण के हृदय रोग का उच्च जोखिम। Sjögren सिंड्रोम में मुख्य सीरोलॉजिकल संकेतक। इसे अक्सर SS-A (Ro52) एंटीजन के एंटीबॉडी के साथ नोट किया जाता है।
एसएस-बी	स्जोग्रेन सिंड्रोम, सिस्टमिक ल्यूपस एरिथेमेटोसस।
पीसीएनए	सिस्टमिक ल्यूपस एरिथेमेटोसस, ल्यूपस नेफ्रैटिस का खतरा।
राइबोसोम (राइबो पी)	सिस्टमिक ल्यूपस एरिथेमेटोसस, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र को नुकसान का खतरा।
nucleosomes	सिस्टमिक ल्यूपस एरिथेमेटोसस, ल्यूपस ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस का उच्च जोखिम।
डबल स्ट्रैंडेड डीएनए	सिस्टमिक ल्यूपस एरिथेमेटोसस का विशिष्ट मार्कर (एसएलई एसीआर के 10वें मानदंड में शामिल), ल्यूपस नेफ्रैटिस का उच्च जोखिम।
एसएनआरएनपी/एस.एम	मिश्रित संयोजी ऊतक रोग, गुर्दे की क्षति के कम जोखिम के साथ प्रणालीगत ल्यूपस एरिथेमेटोसस, स्क्लेरोडर्मा।
हिस्टोन्स	सिस्टमिक ल्यूपस एरिथेमेटोसस, दवा-प्रेरित ल्यूपस, स्क्लेरोडर्मा।
एससीएल-70	त्वचा और आंतरिक अंगों के व्यापक घावों के साथ प्रणालीगत स्केलेरोसिस।
पीएम-एससीएल	पॉलीमायोसिटिस के साथ स्क्लेरोडर्मा।
CENP-बी	स्क्लेरोडैक्टली, टेलैंगिएक्टेसियास, चमड़े के नीचे के कैल्सीफिकेशन, रेनॉड सिंड्रोम, एसोफैगिटिस के साथ क्रेस्ट सिंड्रोम।
जो-1	एंटीसिंथेटेज़ सिंड्रोम के रूप में पॉलीमायोसिटिस।
एएमए-एम2	प्राथमिक पित्त सिरोसिस, स्जोग्रेन सिंड्रोम।

रूस में, वर्तमान में, एचआईवी संक्रमण के प्रयोगशाला निदान के लिए मानक प्रक्रिया है एचआईवी के प्रति एंटीबॉडी का पता लगानाएंजाइम इम्यूनोपरख का उपयोग करनाइसके बाद प्रतिक्रिया में उनकी विशिष्टता की पुष्टि की गई प्रतिरक्षा धब्बा.

एचआईवी के प्रति एंटीबॉडी 90-95% संक्रमित लोगों में संक्रमण के 3 महीने के भीतर, 5-9% में - संक्रमण के 6 महीने बाद, और 0.5-1% में - बाद की तारीख में दिखाई देते हैं। एंटीबॉडी का पता लगाने का शुरुआती समय संक्रमण के क्षण से 2 सप्ताह है।

एचआईवी के प्रति एंटीबॉडी का पता लगाने में 2 चरण शामिल हैं। पहले चरण मेंएचआईवी एंटीजन के खिलाफ एंटीबॉडी के कुल स्पेक्ट्रम का पता विभिन्न परीक्षणों का उपयोग करके किया जाता है: एंजाइम इम्यूनोएसे, एग्लूटिनेशन, संयुक्त, कंघी, झिल्ली-फ़िल्टर या झिल्ली-फैलाना। दूसरे चरण मेंइम्युनोब्लॉटिंग का उपयोग वायरस के व्यक्तिगत प्रोटीन के प्रति एंटीबॉडी निर्धारित करने के लिए किया जाता है। कार्य में, केवल उन परीक्षण प्रणालियों का उपयोग करने की अनुमति है जिनके पास रूसी संघ के स्वास्थ्य मंत्रालय द्वारा उपयोग की अनुमति है। नैदानिक ​​प्रक्रियाएं केवल उचित परीक्षणों के उपयोग के लिए अनुमोदित निर्देशों के अनुसार ही की जानी चाहिए।

रक्त नमूनाकरण इसे क्यूबिटल नस से 3-5 मिलीलीटर की मात्रा में एक साफ, सूखी टेस्ट ट्यूब में बनाया जाता है। नवजात शिशुओं से गर्भनाल रक्त लिया जा सकता है। प्राप्त सामग्री (संपूर्ण रक्त) को कमरे के तापमान पर 12 घंटे से अधिक और रेफ्रिजरेटर में 4-8 डिग्री सेल्सियस पर 1 दिन से अधिक संग्रहीत करने की अनुशंसा नहीं की जाती है। आगामी हेमोलिसिस विश्लेषण के परिणामों को प्रभावित कर सकता है। सीरम को सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा या पाश्चर पिपेट या ग्लास रॉड के साथ टेस्ट ट्यूब की दीवार के साथ रक्त का पता लगाकर अलग किया जाता है। अलग किए गए सीरम को एक साफ (अधिमानतः बाँझ) टेस्ट ट्यूब, शीशी या प्लास्टिक कंटेनर में स्थानांतरित किया जाता है, और इस रूप में इसे 4-8 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर 7 दिनों तक संग्रहीत किया जा सकता है। काम करते समय, आपको "एड्स निदान प्रयोगशालाओं में महामारी विरोधी व्यवस्था पर निर्देश" संख्या 42-28/38-90 दिनांक 5 जुलाई 1990 में दिए गए सुरक्षा नियमों का पालन करना चाहिए।

एचआईवी के प्रति कुल एंटीबॉडी का निर्धारण।

पहला सकारात्मक परिणाम प्राप्त होने पर, विश्लेषण 2 बार (एक ही सीरम के साथ और एक ही परीक्षण प्रणाली में) किया जाता है। यदि कम से कम एक सकारात्मक परिणाम प्राप्त हुआ (तीन एलिसा परीक्षणों में से दो सकारात्मक परिणाम), तो सीरम को संदर्भ प्रयोगशाला में भेजा जाता है।

संदर्भ प्रयोगशाला में, प्राथमिक सकारात्मक सीरा (यानी, जिन्होंने पहले परीक्षण प्रणाली में दो सकारात्मक परिणाम दिए) की पुष्टि के लिए चयनित दूसरी (अन्य) परीक्षण प्रणाली में एलिसा में फिर से जांच की जाती है।

दूसरे परीक्षण प्रणाली में विश्लेषण का सकारात्मक परिणाम प्राप्त होने पर, सीरम की आईएस में जांच की जानी चाहिए।

यदि दूसरी परीक्षण प्रणाली में नकारात्मक परिणाम प्राप्त होता है, तो तीसरी परीक्षण प्रणाली में सीरम की दोबारा जांच की जाती है।

यदि दूसरे और तीसरे दोनों परीक्षण प्रणालियों में एक नकारात्मक परीक्षण परिणाम प्राप्त होता है, तो एचआईवी के प्रति एंटीबॉडी की अनुपस्थिति पर एक निष्कर्ष जारी किया जाता है।

जब तीसरे परीक्षण प्रणाली में सकारात्मक परिणाम प्राप्त होता है, तो सीरम को इम्यून ब्लॉटिंग में विश्लेषण के लिए भी भेजा जाता है।

प्रतिरक्षा धब्बा.

विधि का सिद्धांत नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली पर स्थिर वायरस के कुछ प्रोटीनों के प्रति एंटीबॉडी का पता लगाना है। एचआईवी-1 के आवरण प्रोटीन (एनवी) को आमतौर पर ग्लाइकोप्रोटीन ("जीपी" या "जीपी") कहा जाता है, जिसका आणविक भार किलोडाल्टन (सीडी) में व्यक्त किया जाता है: 160 केडी, 120 केडी, 41 केडी। एचआईवी-2 में ग्लाइकोप्रोटीन का वजन 140 kd, 105 kd, 36 kd होता है। एचआईवी-1 में कोर प्रोटीन (गैग) (आमतौर पर प्रोटीन के रूप में जाना जाता है - "पी" या "आर") का आणविक भार क्रमशः 55 केडी, 24 केडी, 17 केडी है, और एचआईवी-2 -56 केडी, 26 केडी है। , 18 के.डी. एंजाइम एचआईवी-1 (पीओएल) का आणविक भार 66 केडी, 51 केडी, 31 केडी, एचआईवी-2-68 केडी है।

इम्यूनोब्लॉटिंग परिणामों की व्याख्या सकारात्मक, अनिश्चित और नकारात्मक के रूप में की जाती है।

सकारात्मक(पॉजिटिव) ऐसे नमूने माने जाते हैं जिनमें 2 या 3 एचआईवी ग्लाइकोप्रोटीन के प्रति एंटीबॉडी पाए जाते हैं।

नकारात्मक(नकारात्मक) सीरा हैं जो एचआईवी के किसी भी एंटीजन (प्रोटीन) के प्रति एंटीबॉडी का पता नहीं लगाते हैं।

ऐसे नमूने जो एक एचआईवी ग्लाइकोप्रोटीन और/या किसी भी एचआईवी प्रोटीन के प्रति एंटीबॉडी का पता लगाते हैं, उन पर विचार किया जाता है संदिग्ध(अपरिभाषित या व्याख्या योग्य नहीं)।

जब एचआईवी-1 एंटीजन के साथ प्रतिरक्षा धब्बा में कोर प्रोटीन (गैग) के एंटीबॉडी के साथ एक अनिश्चित परिणाम प्राप्त होता है, तो एचआईवी-2 एंटीजन के साथ एक परीक्षण किया जाता है।

इम्यून ब्लॉटिंग के सकारात्मक परिणाम प्राप्त होने पर, परीक्षण सामग्री में एचआईवी के प्रति एंटीबॉडी की उपस्थिति के बारे में निष्कर्ष निकाला जाता है।

नकारात्मक परीक्षण परिणाम प्राप्त होने पर, आईबी एक निष्कर्ष जारी करता है कि एचआईवी के प्रति कोई एंटीबॉडी नहीं हैं।

अनिश्चित परिणाम प्राप्त होने पर (यदि पी24 एंटीजन का पता नहीं चला), एचआईवी के प्रति एंटीबॉडी के लिए बार-बार परीक्षण 3 महीने के बाद किए जाते हैं,

और अगले 3 महीनों के बाद अनिश्चित परिणाम बनाए रखते हुए। यदि पी24 एंटीजन का पता चला है, तो पहला अनिश्चित परिणाम प्राप्त होने के 2 सप्ताह बाद दूसरी परीक्षा की जाती है।

यदि, पहली परीक्षा के 6 महीने बाद, अनिश्चित परिणाम फिर से प्राप्त होते हैं, और रोगी में संक्रमण के जोखिम कारक और एचआईवी संक्रमण के नैदानिक ​​लक्षण नहीं होते हैं, तो परिणाम को गलत सकारात्मक माना जाता है। (यदि महामारी विज्ञान और नैदानिक ​​​​संकेत हैं, तो सीरोलॉजिकल अध्ययन निर्धारित अनुसार दोहराया जाता है)।

पुनः संयोजक वायरस-विशिष्ट पॉलीपेप्टाइड्स "एचआईवी ब्लॉट" का उपयोग करके प्रतिरक्षा सोख्ता इस मायने में भिन्न है कि यह स्वयं वायरल प्रोटीन का उपयोग नहीं करता है, बल्कि पुनः संयोजक पॉलीपेप्टाइड्स - एचआईवी एंटीजन के एनालॉग्स ("Env1", "Gag1", "Poll", "Env2") का उपयोग करता है। पुनः संयोजक Env1 पॉलीपेप्टाइड सीधे HIV-1 gp120 और gp41 के प्रति एंटीबॉडी का पता लगाता है, Gag1 पॉलीपेप्टाइड p17 और p24 एंटीजन का, Po11 पॉलीपेप्टाइड p51 एंटीजन का, Env2 पॉलीपेप्टाइड HIV-2 gp110 और gp38 एंटीजन का पता लगाता है। सीरम को सकारात्मक माना जाता है यदि यह Env1 या Env2 या दोनों Env (एचआईवी प्रकार 1 और 2 दोहरे संक्रमण) के साथ प्रतिक्रिया करता है। केवल पोल और गैग के साथ एक प्रतिक्रिया को एक अनिश्चित परिणाम माना जाता है, जिस स्थिति में एचआईवी लाइसेट का उपयोग करके क्लासिक इम्युनोब्लॉट के अनिश्चित परिणामों के मामलों के समान ही अनुवर्ती कार्रवाई की जाती है।

एचआईवी संक्रमित माताओं से पैदा हुए बच्चों में एचआईवी संक्रमण के सीरोलॉजिकल निदान की ख़ासियत यह है कि जीवन के पहले 6-12 महीनों में संक्रमित और असंक्रमित दोनों बच्चों में मातृ उत्पत्ति के एचआईवी के प्रति एंटीबॉडी होते हैं, जो बाद में गायब हो सकते हैं। एक बच्चे में एचआईवी संक्रमण की उपस्थिति का संकेत देने वाला मानदंड 18 महीने या उससे अधिक की उम्र में एचआईवी के प्रति एंटीबॉडी का पता लगाना है। एचआईवी संक्रमित मां से पैदा हुए 18 महीने के बच्चे में एचआईवी के प्रति एंटीबॉडी की अनुपस्थिति एचआईवी संक्रमण के खिलाफ एक मानदंड है।

डब्ल्यूएचओ की सिफारिश के अनुसार, इम्युनोब्लॉटिंग (वेस्टर्न ब्लॉट) का उपयोग एचआईवी संक्रमण के निदान में एक अतिरिक्त विशेषज्ञ विधि के रूप में किया जाता है, जिसे एलिसा के परिणामों की पुष्टि करनी चाहिए। इस पद्धति का उपयोग आमतौर पर सकारात्मक एलिसा परिणाम की दोबारा जांच करने के लिए किया जाता है, क्योंकि इसे अधिक संवेदनशील और विशिष्ट माना जाता है, हालांकि यह अधिक जटिल और महंगा है।

इम्यूनोब्लॉटिंग एक जेल में वायरस प्रोटीन के प्रारंभिक इलेक्ट्रोफोरेटिक पृथक्करण और नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली में उनके स्थानांतरण के साथ एंजाइम इम्यूनोएसे (एलिसा) को जोड़ती है। इम्युनोब्लॉट प्रक्रिया में कई चरण होते हैं (चित्र 27)। सबसे पहले, इसके घटक घटकों को पूर्व-शुद्ध और नष्ट कर दिया जाता है, एचआईवी को वैद्युतकणसंचलन के अधीन किया जाता है, जबकि वायरस बनाने वाले सभी एंटीजन को आणविक भार द्वारा अलग किया जाता है। फिर, ब्लॉटिंग द्वारा, एंटीजन को जेल से नाइट्रोसेल्यूलोज की एक पट्टी या नायलॉन फिल्टर में स्थानांतरित किया जाता है, जिसमें अब प्रोटीन का एक स्पेक्ट्रम होता है जो एचआईवी की विशेषता है, जो आंखों के लिए अदृश्य है। इसके बाद, परीक्षण सामग्री (सीरम, रोगी का प्लाज्मा, आदि) को पट्टी पर लगाया जाता है, और यदि नमूने में विशिष्ट एंटीबॉडी हैं, तो वे एंटीजन प्रोटीन की पट्टियों से बंध जाते हैं जो सख्ती से उनके अनुरूप होते हैं। बाद के जोड़-तोड़ (एलिसा की तरह) के परिणामस्वरूप, इस इंटरैक्शन के परिणाम की कल्पना की जाती है - दृश्यमान बनाया जाता है। पट्टी के कुछ क्षेत्रों में धारियों की उपस्थिति कड़ाई से परिभाषित एचआईवी एंटीजन के लिए अध्ययन किए गए सीरम में एंटीबॉडी की उपस्थिति की पुष्टि करती है।

एचआईवी संक्रमण के निदान की पुष्टि के लिए इम्यूनोब्लॉटिंग का सबसे अधिक उपयोग किया जाता है। यदि इम्यूनोब्लॉटिंग द्वारा एचआईवी आवरण प्रोटीनों में से किन्हीं दो के प्रति एंटीबॉडी का पता लगाया जाता है तो डब्ल्यूएचओ सीरा पॉजिटिव मानता है। इन सिफ़ारिशों के अनुसार, यदि आवरण प्रोटीनों में से केवल एक के साथ प्रतिक्रिया होती है (