שיטות לחקר חילוף החומרים של חלבון. שיטות לחקר חילוף החומרים של חלבון בכבד, ערך אבחון

מחקר מטבוליזם של חלבונים

פעילות ליפאז בלבלב

ערך קליני ודיאגנוסטי של ההגדרה

הַעֲלָאָהפעילות ליפאז לבלבבסרום דם עם דלקת לבלבמכל מוצא, במיוחד דלקת לבלב חריפה, שבה פעילות האנזים עולה גם בנוזל מיימת. בחולים עם דלקת הלבלב, רצוי לחקור בו זמנית את פעילות הליפאז בדם ובשתן, שכן אצל האחרונים מתברר שהיא מוגברת לעתים קרובות יותר מאשר בדם. תרופות המעוררות עווית של הסוגר של אודי (תרופות נרקוטיות, משככי כאבים, סיקטין), הפרין (מעורר שחרור ליפאז) מפעילות אנזים זה.

רמות נמוכות של פעילות ליפאז נמצאו בחולים עם שחפת, עגבת, סרטן ומחלות זיהומיות שונות, וככל שהתהליך הפתולוגי מתקדם, פעילות האנזים פוחתת יותר ויותר.

חלבונים הם חומרים המכילים חנקן במשקל מולקולרי גבוה. ישנם חלבונים פשוטים - חלבונים המורכבים מ-20 חומצות אמינו שונות, וחלבונים מורכבים - חלבונים, המורכבים מחלבון ומרכיב תותב (לא חלבון). רכיבים תותבים כוללים חומצות גרעין, heme, ליפידים, חומצה זרחתית וכו'. חלבונים מורכבים כוללים נוקלאופרוטאין, כרומופרוטאינים, ליפופרוטאינים ופוספופרוטאינים.

ניתוח ביוכימי מתחיל בדרך כלל בקביעת התוכן סך החלבון בדם הפלזמה (סרום)..

שינויים ברמת החלבון הכוללים הם מוחלטים ויחסיים כאחד. האחרונים נצפים בדרך כלל עם עלייה (ירידה) בנפח הדם (פלזמה). לפיכך, הידרמיה מובילה להיפופרוטינמיה יחסית, והתייבשות מובילה להיפרפרוטינמיה יחסית. בהקשר זה, כאשר מפרשים את האינדיקטורים של החלבון הכולל בסרום (פלזמה) של הדם, יש צורך לקחת בחשבון הפרות של חילוף החומרים במים.

התייבשות יכולה להסתיר היפופרוטאינמיה מוחלטת, שכן בשילוב זה ריכוז החלבון בפלסמת הדם אינו תמיד שונה מהנורמה. מכאן נובע שהגורם להיפו-והיפרפרוטינמיה יכול להיות לא רק חוסר איזון בין צריכת חלבון, ביוסינתזה, קטבוליזם והסרה שלו, אלא גם שינוי בנפח החלל התוך-וסקולרי עקב החלק הנוזלי (המים) של הדם. ברור שהפתוגנזה של שינויים אלה שונה.

כדי להבדיל בין שינויים מוחלטים ויחסיים בתכולת חלבון הפלזמה, מספיק לבדוק את ההמטוקריט או לקבוע את נפח הפלזמה (דם).

ברוב המכריע של המחלות הכרוניות של האיברים הפנימיים, המלוות בשינויים בחילוף החומרים של חלבון, מתגלה היפופרוטינמיה, שהיא בדרך כלל משנית.

היפופרוטאינמיה מוחלטתמתגלה בתסמונות פתופיזיולוגיות, המתבטאות בירידה בביו-סינתזה, קטבוליזם מוגבר, הפסדים חריגים, הפצה פתולוגית של חלבון בין מגזרים בודדים של הגוף. הגורמים להיפופרוטאינמיה מוחלטת הם:

1. צריכה לא מספקת של חלבון מהמזון עקב רעב, תת תזונה, היצרות (היצרות) של הוושט (עקב כוויות, גידולים), הפרות בשלמות ובתפקוד של מערכת העיכול עם תהליכים דלקתיים ממושכים בדופן המעי ועוד. מצבים המלווים בהידרדרות בעיכול וספיגת חלבון ירידה ברמת החלבון הכולל בפלזמה (או נטייה לפתח היפופרוטאינמיה) מצוינת גם בתסמונת של פגיעה בספיגה של מזונות חלבוניים וחוסר איזון בהרכב חומצות האמינו שלו.

2. דיכוי התפקוד הפרוטאו-סינתטי של הכבד, הנצפה בדלקת כבד פרנכימלית, שחמת הכבד, כמו גם שיכרון הנגרמות על ידי תהליכים ממושכים של תרופות ממאירות, ניאופלסמות ממאירות, תירוטוקסיקוזיס והשפעות רעילות של כימיקלים מסוימים.

3. הפירוק המוגבר של חלבונים בגוף, הנגרם מהצורך לפצות על עלויות אנרגיה גדולות, קשור למחסור במשאבי פלסטיק. זה ציין כוויות תרמיות ומחלות כוויות, ניאופלזמות ממאירות.

4. איבוד חלבון בגוף: עם דם במקרה של דימום חריף וכרוני, עם שתן במקרה של תסמונת נפרוטית (נפרוזיס, עמילואידוזיס של הכליות).

5. מעבר לרקמות אחרות עם חדירות מוגברת בחדות של דופן הנימים: היווצרות בצקת נרחבת, המעבר לחלל השלישי - עם היווצרות של exudates, ספיגה לחללים הסרוסיים, לתוך לומן המעי (עם volvulus, דלקת הצפק ).

6. Defectoproteinemias, ᴛ.ᴇ. הפרעות תורשתיות נדירות יחסית (קבועות גנטית) בסינתזה של חלבוני הדם.

7. תכונות של המצב הפיזיולוגי של הגוף . כמות מופחתת של חלבון בפלסמה בדם צוינה גם במצבים פיזיולוגיים מסוימים: למשל, בנשים בחודשי ההריון האחרונים ובמהלך ההנקה.

היפופרוטאינמיה יחסית.ידוע כי זלוף בשפע של תמיסת גלוקוז ונוזלים פיזיולוגיים אחרים מוביל לירידה בריכוז החלבון עקב עלייה בנפח החלק הנוזלי בדם.

יותר ממחצית מהכמות הכוללת של חלבוני הפלזמה (35-55 גרם/ליטר) מקורה באלבומין. אלבומין פלזמה מתעדכן במהירות: במהלך היום, 10-16 גרם של חלבון זה מסונתז ומתפרק. בשל הריכוז הגבוה שלו, ההידרופיליות הגבוהה וגודלו המולקולרי הקטן, אלבומין מבצע תפקיד חשוב בשמירה על הלחץ האוסמוטי הקולואידי של הדם. לפיכך, הוא לוקח חלק בחילופי המים בין הדם למרחב הביניים. כאשר תכולת האלבומין נמוכה מ-30 גרם/ליטר, הלחץ האונקוטי יורד עד כדי כך שהמים עוברים מבפנים למגזר החוץ-וסקולרי.

קביעת רמת האלבומין בפלזמה ממלאת תפקיד חיוני בהערכת חומרת מהלך המחלות המלוות בהיפואלבומינמיה.

ערך אבחוני חשוב לא פחות הוא קביעת ריכוז האלבומין בשתן.

ירידה ברמת האלבומין נצפתה במחלות כליה כרוניות - תסמונת נפרוטית, כמו גם כוויות, איבוד דם, מחלות זיהומיות, תהליכים מוגלתיים, דלקת ריאות לא ספציפית, שחפת ריאתית ואיברים אחרים, פוליארתריטיס חריפה ומצבים דלקתיים אחרים, גידולים ממאירים ( קכקסיה סרטנית), לוקמיה, אנמיה, אי ספיקת לב, אוטם שריר הלב, אובדן מאסיבי של חלבון דרך המעיים.

הופעת חלבון בשתן (פרוטאינוריה) נצפית במספר מחלות כליה. נהוג לבודד פרוטאינוריה אורגנית (הנגרמת על ידי נגעים של הפרנכימה של הכליה - מחלות דלקתיות, תסמונת נפרוטית, לעיתים פגמים מולדים של הנפרון) ותפקודית הקשורה לעלייה בחדירות מסנן הכליות או האטה בזרימת הדם ב. הגלומרולי (בהשפעת היפותרמיה, עומס יתר פיזי ונפשי).

פרוטאינוריה פרה-כליתית קשורה לפירוק מוגבר של חלבוני רקמה, המוליזה חמורה; כליות - עקב פתולוגיה של הכליות (גלומרולרית וצינורית); postrenal - נגרמת על ידי פתולוגיה של דרכי השתן ולרוב - הפרשה דלקתית.

נהוג להבדיל שלוש רמות של פרוטאינוריה: בינוני - עם אובדן יומי של חלבון עד 1 גרם, בינוני - מ-1 עד 3 גרם ובולט - יותר מ-3 גרם ליום.

הגורמים העיקריים לפרוטאינוריה הם:

1. חדירות מוגברת של המסנן הגלומרולרי לחלבוני פלזמה (גלומרולרית פרוטאינוריה);

2. הפרה של ספיגה חוזרת צינורית של חלבונים מסוננים (פרוטאינוריה צינורית);

3. paraproteinemia ו / או עלייה בתכולת החלבונים בדם;

4. שינויים בהמודינמיקה הכלייתית;

עמוד 66 מתוך 76

וידאו: קביעת חלבון תגובתי בסרום

אינדיקטורים של סך חלבון הפלזמה בדם ושברים בודדים שלו חשובים באבחון של מחלות רבות.
קביעת סך החלבון בסרום הדם. ניתן לייצר אותו במספר שיטות (אזומטריות, גרבימטריות, נפלומטריות, שבירה, ספקטרופוטומטריות וכו'). מבין השיטות הקולורימטריות, שיטת הביורט היא הספציפית ביותר, רגישה למדי, מדויקת ונגישה מעשית. שיטה זו מוצגת כשיטה מאוחדת לקביעת סך החלבון בסרום הדם. זה מבוסס על העיקרון הבא: חלבונים מגיבים בסביבה בסיסית עם נחושת גופרתית, ויוצרים תרכובות בצבע סגול.
הטכניקה לקביעת החלבון הכולל היא כדלקמן. ל-5 מ"ל מתמיסת העבודה של מגיב הביורט (4.5 גרם של מלח של רושל מומס ב-40 מ"ל של 0.2 N NaOH, 1.5 גרם של C11SO4 5H2O ו-0.5 גרם של K1 מתווספים ומוסיפים עד 100 מ"ל של 0.2 N NaOH) הוסף 0.1 מ"ל של סרום דם. לאחר 30 דקות, המדגם קולורימטרי על FEK בקובטה של ​​10 מ"מ עם מסנן אור ירוק נגד בקרה. כדי להכין בקרה, מוסיפים 0.1 מ"ל של 0.9% NaCl ל-5 מ"ל מגיב הביורט. החישוב מתבצע בהתאם ללוח הזמנים של הכיול.
הריכוז התקין של החלבון הכולל במבוגרים נע בין 62 ל-82 גרם/ליטר. נתונים לפי גיל בילדים מוצגים בטבלה. 49.
Tab.g 49. תכולת שברי החלבון כאחוז מסך כמות החלבון (נתונים ממוצעים) לפי גיל (על פי Yu. E. Veltishchev, 1979)

הסיבות השכיחות ביותר להיפופרוטאינמיה הן צריכה לא מספקת של חלבונים בגוף עם מזון (רעב חלבון), איבודים משמעותיים של חלבון ועיכוב ביוסינתזה של חלבון בדם.
צריכה לא מספקת של חלבונים בגוף נצפתה בהפרות של מערכת העיכול (היצרות של הוושט, פילורוספאזם והיצרות פילורית, גידולים, דלקת במערכת העיכול וכו'), תכולת חלבון נמוכה בתזונה או הרכב חומצות אמינו לא מאוזן, וכו '
מחלות כליות המתרחשות עם פרוטאינוריה, דימום חריף וכרוני, יציאות ופליטים נרחבים בחללים סרואיים, כוויות וכו' מובילות לאיבוד חלבון על ידי הגוף.
היפופרוטאינמיה הקשורה לירידה בביו-סינתזה של חלבונים בכבד מתרחשת בדלקת כבד כרונית, שיכרון, שחמת, תהליכים ממושכים, גידולים ממאירים וכו'.
היפרפרוטינמיה היא תופעה נדירה יחסית. נצפה עם אקסיקוזיס, סוכרת אינספידוס, חסימת מעיים, דלקת צפק כללית, מיאלומה (מתמשכת עד 120 גרם/ליטר).
שיטות לקביעת שברי חלבון בסרום הדם. חקר הקשר הכמותי בין שברי חלבון בודדים הוא בעל ערך אבחנתי רב, שכן הוא מאפשר להבדיל בין סוגים מסוימים של היפו-והיפרפרוטינמיה, כמו גם מספר מחלות שאינן מלוות בשינוי בתכולת החלבון הכוללת.
עבור חלוקה של חלבוני פלזמה, המלחה עם מלחים ניטרליים, חלוקה אלקטרופורטית, שיטות אימונולוגיות ושקיעה, משקעים עם אלכוהול אתילי בטמפרטורה נמוכה, כרומטוגרפיה, סינון ג'ל משמשים. השיטות הנפוצות ביותר בשימוש הן שיטות אלקטרופורטיות המבוססות על מהירות התנועה השונה של חלבונים בשדה חשמלי, בהתאם למטען החשמלי שלהם ולתכונות פיסיקליות וכימיות אחרות.
שיטות של אלקטרופורזה על נייר וג'לים - אגר, עמילן ואחרות, בעיקר על ג'ל פוליאקרילאמיד, שניתן להשתמש בו כדי להשיג כ-30 שברי חלבון, נמצאות בשימוש נרחב. לעתים קרובות יותר, החלו להשתמש באלקטרופורזה על סרטי אצטט תאית. עם זאת, במעבדות אבחון קליניות משתמשים בעיקר בשיטת האלקטרופורזה על נייר (V. G. Kolb, V. S. Kamyshnikov, 1976). שיטה זו מבוססת על העיקרון הבא: בהשפעת שדה חשמלי קבוע, חלבוני סרום בעלי מטען חשמלי נעים לאורך נייר הלח בתמיסת חיץ במהירות שתלויה בגודל המטען ובמשקל המולקולרי. במקרה זה, חלבוני סרום הדם מחולקים לחמישה חלקים: אלבומינים וגלובולינים a1, a2, b, y.
היחס התקין בין אלבומין וגלובולינים (יחס אלבומין-גלובולין) הוא בערך 2:1. אחוז השברים הבודדים של חלבונים במבוגרים וילדים, בהתאם לגיל, מוצג בטבלה. 49. הכמות הכוללת של חלבונים ושברי חלבון בדם משתנה עם מחלות שונות בילדים.
אצל מבוגרים וילדים גדולים יותר, מבחינים בין הסוגים הבאים של אלקטרופרוגרמות: I) תהליך דלקתי חריף - 2) דלקת כרונית תת-חריפה - 3) קומפלקס סימפטומים נפרוטי - 4) ניאופלזמה ממאירה - 5) הפטיטיס - 6) שחמת כבד - 7) צהבת חסימתית - 8) ב- ו-p-globulin plasmacytomas.

בסוג הראשון קיימת ירידה ברמת האלבומין ועלייה ב-a1, a2-גלובולינים, ובשלבים מאוחרים יותר, ו-y-גלובולינים; בשני, ירידה מתונה בשברי אלבומין ועלייה בולטת ב-a2 -, שברי y-גלובולינים; בשלישי, ירידה משמעותית באלבומינים, עלייה ב-a-גלובולינים עם ירידה מתונה ב-y-גלובולינים; ברביעי - ירידה באלבומינים ועלייה משמעותית בכל חלקי הגלובולינים; חמישית - ירידה מתונה באלבומינים ועלייה ב-y- ו-(3-גלובולינים; בששי - ירידה באלבומינים עם עלייה חזקה בשבריר ה-y-גלובולין, שבסיסו מורחב; בשביעית - ירידה באלבומינים ועלייה מתונה ב-CC2-, P- ו-y-גלובולינים; בשמיני - סך החלבון גדל בחדות, אלבומינים ורוב הגלובולינים מופחתים, תלוי בסוג, y- או β-גלובולינים מוגברים יותר - בולינים.
אצל תינוקות קיים חוסר פיזיולוגי בביו-סינתזה של y-גלובולינים. לכן, במחלות זיהומיות, ה-b-ו-a2-גלובולינים שלהם עולים בצורה משמעותית יותר מאשר אצל ילדים גדולים יותר ומבוגרים. עלייה מתמדת ב-y-globulins בילדים צעירים עשויה להעיד על מצב ספטי.

חלבון הוא החומר האורגני העיקרי המכיל חנקן. גרם אחד של חנקן כלול ב-6.25 גרם חלבון (יחס חנקן), כלומר חלבון הוא כ-16% חנקן. לכן, על ידי בחינת חילופי החנקן בגוף, ניתן להעריך את מצב חילוף החומרים של החלבון. ניתן לשפוט את עוצמת סינתזת החלבון לפי כמות החנקן הנכנסת לגוף, את פירוק החלבונים ניתן להעריך לפי כמות החנקן המופרשת בשתן ובזיעה (כמות החנקן שאבדה בזיעה זניחה בתנאים רגילים, ולכן לרוב לא נלקח בחשבון חנקן זיעה). ניתן להשוות את הסינתזה והפירוק של חלבונים על ידי קביעת מאזן החנקן.

מאזן החנקן הוא היחס בין כמות החנקן הנכנסת לגוף ומופרשת ממנו. ניתן להבחין בין הסוגים הבאים של מאזן חנקן - חיובי, שלילי ומאזן חנקן. מאזן חנקן חיובי: צריכת החנקן לגוף עולה על הפרשתו מהגוף (אצירת חנקן בגוף). זה מצביע על כך שסינתזת החלבון עולה על פירוקו. בדרך כלל, איזון חנקן מסוג זה מתרחש במהלך גדילת הגוף, במהלך ההיריון, ההבראה ותוספת מסת שריר במהלך ספורט. מאזן חנקן שלילי – צריכת החנקן קטנה מהפרשתו מהגוף. זה מצביע על כך שסינתזת החלבון קטנה מהפירוק שלו. סוג זה של מאזן חנקן מתרחש במצבים הבאים:

1) הרעבת חלבונים (כמות חלבונים לא מספקת חודרת לגוף או חלבונים פגומים מסופקים במזון. חלבון פגום אינו מכיל חומצת אמינו חיונית אחת או יותר);

2) ספיגה לקויה של חומצות אמינו;

3) הזדקנות;

4) מחלות או מצבים המלווים בפירוק רקמות בולט (גידולים, קצ'קסיה);

5) ירידה בסינתזת חלבון עקב פרמנטופתיה.

מאזן חנקן – צריכת והפרשת חנקן זהים. זה מצביע על אותה עוצמה של סינתזת חלבון וריקבון (Raguzin A.V., Setko N.P., Shirshov O.V., Fateeva T.A. 2001)

סיכום

סנאים(חלבונים) הם תרכובות מורכבות המכילות חנקן מולקולרי גבוה המורכבות מחומצות אמינו. מערך ורצף חומצות האמינו בחלבון מאפיינים הן את הספציפיות הביוכימית והן את ערכו התזונתי. מתוך עשרות חומצות אמינו המוכרות כיום, רק 20 נמצאות במזון.

חומצות אמינו המרכיבות את החלבונים מחולקות לחיוניות ולא חיוניות. חומצות אמינו חיוניותחייב להיות מסופק עם מזון בכמויות הנדרשות ובפרופורציות מסוימות. חומצות אמינו לא חיוניותיכולים לעבור טרנספורמציות הדדיות בגוף או להיווצר מאלה שאין להן תחליף כתוצאה מתמורות ביוכימיות שונות (תגובות טרנסאמינציה, סינתזה מתרכובות שאינן חלבוניות באמצעות אמוניה כמקור לחנקן). חומצות אמינו חיוניות כוללות ארגינין, ולין, היסטידין, איזולאוצין, לאוצין, ליזין, מתיונין, טריפטופן, פנילאלנין, ת'רונין (יתרה מכך, ארגינין והיסטידין נחשבים חיוניים לילדים מתחת לגיל 3 שנים). חומצות אמינו לא חיוניות: אלנין, אספרגין, חומצה אספרטית, גליצין, חומצה גלוטמית, גלוטמין, סרין, ציסטין, טירוזין, פרולין.

החלבונים של גוף האדם מבצעים פונקציות חיוניות: פלסטיק, אנרגיה, קטליטי, רגולטורי, מגן, הובלה, קולטן.

על פי התקנים התזונתיים הפיזיולוגיים הנהוגים בארצנו, כמות החלבון הכוללת בתזונה של ילדים צריכה להיות כפולה מהכמות המספקת מאזן חנקן או מאזן חנקן, ולאוכלוסיה הבוגרת - כמות של 1.5. לגיל הרך - 53-69 גרם, לתלמידי בית ספר - 77-98 גרם, לאוכלוסייה הבוגרת: לנשים - 58-87 גרם ולגברים - 65-117 גרם (בהתאם לפעילותם המקצועית).

בִּיבּלִיוֹגְרָפִיָה

1. Raguzin A.V., Setko N.P., Shirshov O.V., Fateeva T.A. היבטים פיזיולוגיים והיגייניים של חילוף חומרים, חילוף חומרים אנרגטי ותזונה רציונלית: מדריך לעבודה עצמאית של סטודנטים מהפקולטה לרפואה ומניעה - אורנבורג: מרכז הוצאת OGAU, 2001. - 40 עמ'.

2. פיזיולוגיה של האדם / בעריכת G.I. קוסיצקי - מ.: "רפואה", 1985. - 560 עמ'.

3. ביוכימיה: פרוק. לאוניברסיטאות / V.P. קומוב, V.P. שוודובה. – M.: Bustard, 2004. – 640 עמ'.

4. מדריך לתרגילים מעשיים בהיגיינת מזון: ספר לימוד. מדריך לאוניברסיטאות / Setko N.P., Setko A.G., Fateeva T.A., Volodina E.A., Trishina S.P., Chistyakova E.S.; מתחת לסך הכל אד. נ.פ. סטקו. - אורנבורג: אורגמה, 2011. - 652 עמ'.

קביעת סך החלבון בסרום/פלזמה/דם ובנוזלים ביולוגיים אחרים.

כל השיטות הידועות לקביעת ריכוז החלבון הכולל בסרום הדם מחולקות לקבוצות העיקריות הבאות:

1. אזוטומטרי, מבוסס על קביעת כמות החנקן החלבון - שיטת Kjeldahl ושינויים שלה.

2. שיטות המורכבות בקביעת צפיפות הסרום אינן מדויקות, משום הצפיפות תלויה לא רק בתכולת החלבונים.

3. משקל - חלבונים בסרום הדם מושקעים, מיובשים למשקל קבוע ומשקללים במאזן אנליטי. השיטות עמלניות ודורשות כמות גדולה של סרום.

4. רפרקטומטרי - לא מושלם, כי חלק מהשבירה נובע ממרכיבים אחרים של הסרום.

5. קולורימטרי - הנפוצה ביותר היא שיטת הביורט, שהיא מאוחדת.

6. שיטות אחרות - נפלומטרי, פולרימטרי, ספקטרופוטומטרי אינן בשימוש נרחב.

התעשייה המקומית השיקה ייצור של ערכות לחקר ריכוז החלבון הכולל בסרום הדם לפי תגובת הביורט. אותו עיקרון משמש למדידת רמת החלבון הכולל בנוזלים ביולוגיים באמצעות ריאגנטים המסופקים על ידי חברות שונות.

קביעת סך החלבון בסרום הדם על ידי תגובה ביורטית.

ריאגנטים.

תמיסת נתרן כלורי 1.0.9% /0.9 גרם נתרן כלורי לכל 100 מ"ל מים מזוקקים /.

תמיסה של 2.0.2N נתרן הידרוקסיד, ללא פחמן דו חמצני /20 מ"ל של 1N נתרן הידרוקסיד מותאמת ל-100 מ"ל עם מים מזוקקים מבושלים/.

3. מגיב ביורט: 4.5 גרם מלח של רושל מומסים ב-40 מ"ל של תמיסת נתרן הידרוקסיד 0.2 N, ולאחר מכן מוסיפים 1.5 גרם גופרת נחושת ו-0.5 גרם סודה קאוסטית. אחסן במיכל זכוכית כהה, התמיסה יציבה.

תמיסה של 4.0.5% של יודיד אשלגן בתמיסת נתרן הידרוקסיד 0.2N.

5. תמיסת עבודה של מגיב ביורט: 20 מ"ל מגיב ביורט מעורבבים עם 80 מ"ל תמיסת יודיד אשלגן. פתרון מתלה.

6. תמיסה סטנדרטית של אלבומין מסרום אנושי או בקר: תמיסה של 10% אלבומין בתמיסת נתרן כלורי 0.9% /1 מ"ל תמיסה מכילה 0.1 גרם חלבון - 100 גרם/ליטר/.

עקרון השיטה.

חלבונים מגיבים בסביבה בסיסית עם גופרת נחושת ליצירת תרכובות בצבע סגול \biuret reaktion/.

מהלך הקביעה: 0.1 מ"ל סרום מתווסף ל-5 מ"ל של תמיסת העבודה של מגיב הביורט, מעורבב, תוך הימנעות מהיווצרות קצף. לאחר 30 דקות \ ולא יאוחר משעה \ הם נמדדים על ה-FEK בקובטה בעובי שכבה של 1 ס"מ באורך גל של 540-560 ננומטר \ מסנן אור ירוק \ נגד בקרה.

לִשְׁלוֹט: 0.1 מ"ל של תמיסת נתרן כלוריד 0.9% מתווספת ל-5 מ"ל מתמיסת העבודה של מגיב הביורט, ואז היא מעובדת כניסוי.

החישוב מתבצע בהתאם ללוח הזמנים של הכיול.

ערכים תקינים של סך החלבון הם 65-85 גרם/ליטר.

בניית גרף כיול.

מֵגִיב:תמיסה סטנדרטית של אלבומין 10% בתמיסת נתרן כלורי 0.9%, 1 מ"ל ממנה מכיל 0.1 גרם חלבון. להכנת המגיב, ניתן להשתמש באלבומין ללופיל מהערכת Bilirubin Standard מבית Lachem. הוראות הערכה מציינות את תכולת האלבומין במ"ג. על סמך זה, אנו מחשבים כמה יש צורך להוסיף 0.9% נתרן כלורי לאלבומין זה כדי לקבל 0.1 גרם חלבון ב-1 מ"ל של תמיסה.

לדוגמה:הוראות הערכה קובעות כי אלבומין lyophilized מכיל 160 מ"ג של אלבומין. חישוב: תמיסה סטנדרטית של 10% מכילה 10 גרם או 10,000 מ"ג ב-100 מ"ל

ב-160 מ"ג הסטנדרטי ב-X

X = 1.6 מ"ל, כלומר. הוסף 1.6 מ"ל של 0.9% נתרן כלורי לבקבוק המכיל אלבומין ונקבל ש-1 מ"ל מהתמיסה הזו מכיל 0.1 גרם חלבון.

לאחר הכנת התמיסה הסטנדרטית, אנו מכינים ממנה סדרה של דילול עבודה לפי הטבלה:

חישוב ריכוז החלבון ב-g/l.

1 מ"ל של תמיסה סטנדרטית 10% מכיל 0.1 גרם חלבון

0.04 גרם חלבון כלול ב-1 מ"ל של תמיסה

X ב-1000 מ"ל

מכל דילול עבודה של הריכוז המתאים, 0.1 מ"ל נלקח לתוך 3-4 מבחנות, כלומר. כל קביעה מתבצעת ב-3-4 מקבילים ו-5 מ"ל מגיב ביורט מתווספים לכל מבחנה. לאחר 30-60 דקות קולורימטרי על FEC נגד שליטה. אנו מקבלים 3-4 קריאות של צפיפות אופטית עבור כל ריכוז. אנו מוצאים מהם את הממוצע האריתמטי, לאחר שזרקו בעבר קריאות סוטה בחדות.

אנו בונים גרף כיול: על האבשיסה אנו משרטטים את ריכוז החלבון ב-g/l, כלומר. 40-60-80-100 גרם\ל; ולאורך ציר ה-y, קריאות הצפיפויות האופטיות המתקבלות ב-FEC \ ממוצע אריתמטי/.

עקומת הכיול צריכה להיראות כמו פרימה המצוירת דרך 3 נקודות. עקומה זו נבדקת בסרה של תורם \לפחות 3-4 קביעות\. כאשר משיגים קריאות חלבון תקינות, כלומר. בטווח הנורמלי; עקומת הכיול הבנויה משמשת בעבודה.

הערה.

1. יש לבנות את עקומת הכיול לפחות פעם בשנה, וכן בכל פעם לאחר תיקון ועל קולורימטר פוטו-אלקטרי שהושג לאחרונה.

2. הקשר הליניארי בין צפיפות אופטית לריכוז נשמר עד D=0.5. אם הסרום מכיל כמות גדולה יותר של חלבון, אז הסרום מדולל בנתרן כלורי פעמיים.

קביעת אוריאה בדם ובשתן.

אוריאה היא התוצר העיקרי המכיל חנקן של קטבוליזם חלבון.

במהלך פירוק החלבונים מצטברת אמוניה - חומר רעיל. הדרך העיקרית לנטרול אמוניה היא סינתזה של אוריאה בכבד. ריכוז האוריאה בדם תלוי בקצב היווצרותו בכבד ובסילוקו מהגוף דרך הכליות עם שתן.

ברוב החולים, קצב היווצרות האוריאה משקף את קצב הניצול והפירוק של החלבון הסלולרי.

בפתולוגיה חמורה בכבד נפגעת יכולתם של הפטוציטים לסנתז אוריאה, אמוניה מצטברת ותכולת האוריאה בדם יורדת.

הפרשת האוריאה שנוצרה מתרחשת בשתן ותלויה בתפקוד ההפרשה של הכליות.

קביעת האוריאה מתבצעת בשיטות הבאות:

1. שיטה כימית על ידי תגובת צבע עם דיאצטיל מונווקסים.

2. שיטה אנזימטית (אוראז)

3. שיטת "כימיה יבשה".

קביעת אוריאה על ידי תגובה עם דיאצטיל מונווקסים.

ריאגנטים.

1. דיאצטיל מונווקסים ותיושמיקרבזיד או ריאגנט בטבליות.

2. תמיסת עזר או סטנדרטית המכילה 100 מ"ג אוריאה ב-100 מ"ל או 1 מ"ג ב-1 מ"ל.

הכנת פתרונות.

תמיסת מגיב: ממיסים טבליה אחת עם חימום בבקבוק נפח של 50 מ"ל ב-30 מ"ל מים מזוקקים. לאחר הקירור, מעלים את הווליום לסימון. הפתרון יציב למשך מספר שבועות.

תמיסת חומצה גופרתית: 150 מ"ל מים מזוקקים ו-25 מ"ל חומצה גופרתית 96% אנליטית מתווספים לבקבוק נפח של 250 מ"ל. מחממים לאחר הקירור מביאים את הנפח לסימן. הפתרון יציב.

תמיסת העבודה של המגיב וחומצה גופרתית מוכנה לפני התגובה ביחס של 1:1 (ראה ערכת הגדרה).

עקרון השיטה.

אוריאה יוצרת קומפלקס אדום עם דיאצטיל מונווקסים בנוכחות תיוסמיקרבזיד ומלחי ברזל במדיום חומצי חזק, עוצמת הצבע פרופורציונלית לריכוז האוריאה.

התקדמות הגדרה.

תקן בקרת ניסיון של ריאגנטים

1.סרום 0.02 - -

2. פתרון עבודה

a\reagent solution 2.0 2.0 2.0

b \ תמיסה גופריתית

חומצות 2.0 2.0 2.0

3. פתרון סטנדרטי

אוריאה - - 0.02

דגירה במשך 10 דקות באמבט מים רותחים. מצננים 2-3 דקות בזרם מים קרים. קולורימטרי לא יאוחר מ-15 דקות: מסנן אור ירוק \באורך גל של 490-540\, קובטה 1 ס"מ, נגד שליטה.

תַחשִׁיב: לפני

X \u003d -------- * C st ב- mmol \ l, איפה

עשה - צפיפות אופטית של ניסיון;

Dst - צפיפות אופטית של תמיסה סטנדרטית של אוריאה או תקן;

C st הוא ריכוז האוריאה בתמיסה הסטנדרטית;

X הוא ריכוז האוריאה בדגימת הסרום.

כדי להמיר מ"ג% ל-mmol/l, נעשה שימוש במקדם של 0.1665.

הערכים הנורמליים של אוריאה בסרום הדם הם 2.5 -8.3 ממול לליטר.

הערות.

1. ניתן לשנות את מהלך הקביעה לעיל על ידי הגדלת הנפחים של כל התמיסות הנמדדות פי 2-3, בהתאם לנפח הקובטות.

3. ההמרה של אוריאה לחנקן אוריאה יכולה להיעשות על ידי הכפלה של גורם של 0.466.

4. Thiosemicarbazide הוא מגיב רעיל. כאשר עובדים עם זה, אתה חייב לעקוב אחר הכללים לעבודה עם חומרים רעילים.

שיטות לחקר חילוף החומרים של חלבון: אלקטרופורטית - מבוססת על הפרדת חלבונים בשדה חשמלי קבוע, בהתאם לגודל מולקולת החלבון. Ultracentrifugation מבוסס על שיעורי שקיעה שונים של חלבונים בודדים בהתאם למשקל המולקולרי שלהם. כרומטוגרפיה: - כרומטוגרפיה של חילופי יונים מבוססת על היכולת השונה של חלבונים בודדים להחליף עם יונים של שרפים לחילופי יונים, - כרומטוגרפיה על מסננות מולקולריות (סינון ג'ל) - על Sephadex - חלבונים מופרדים בהתאם לגודל המולקולה, - כרומטוגרפיה זיקה - חלבונים מחולקים ליחידים בהתאם לזיקה לזיקה (מילוי עמודות).

המלח - מבוסס על הסרת מעטפת המים עם ריכוזים שונים של מלחים של מתכות אלקליות ואדמה אלקליות ויוני אמוניום. זוהי שיטה ישנה להפרדת חלבונים. השימוש בתגובות צבע - למשל, ביורה לחלבון כולל, קסנטופרוטאין לחומצות אמינו מחזוריות, עוצמת הצבע נמדדת קולורימטרית. שיטות אימונולוגיות - משמשות לכימות חלבונים בודדים. בעת אינטראקציה עם אנטי-סרום ספציפי, נוצרת תמיסה עכורה, עוצמת העכירות נמדדת קולורימטרית.

הכנת הנבדקים: דגימת דם נעשית בבוקר בין השעות 8-10 בבוקר. במקרים חירום, דגימת דם מתבצעת בכל שעה של היום. דם נלקח על קיבה ריקה, לאחר 8-12 שעות של צום. הימנעות מנטילת משקאות אלכוהוליים למשך 24 שעות לפחות. לחץ פיזי וגירוי רגשי אינם נכללים, עבורם הנבדק רשאי לנוח במשך 15 דקות.

קבלה ואחסון של חומר ביולוגי: סרום איקטרי, המוליז, chylous או פלזמה אינם מתאימים למחקר. כדי להשיג פלזמה, דם ורידי נאסף בצינור נקי ויבש עם נוגד קרישה. מלחי EDTA, הפרין, ליתיום הפרינאט, נתרן אוקסלט, ציטראטים מפחיתים את התוצאות. הצנטריפוגה מתבצעת במצב הרגיל לא יאוחר מ-3 שעות מדגימת החומר.

כדי לקבל סרום דם, דם ורידי נאסף במבחנה נקייה ויבשה. הצנטריפוגה מתבצעת במצב הרגיל לא יאוחר מ-3 שעות מדגימת החומר. למחקר של שתן, השתמש במנת הבוקר. המחקר מתבצע לא יאוחר משעתיים לאחר הדגימה.

תנאי אחסון של חומר ביולוגי: חומר ביולוגי מאוחסן במיכלים סגורים היטב. דם מלא אינו מתאים לאחסון, גם בנוכחות חומרים משמרים. ניתן לאחסן פלזמה וסרום למשך יום אחד בטמפרטורת החדר, 7 ימים בטמפרטורה של 4-8 מעלות צלזיוס, 3 עד 6 חודשים ב-20 מעלות צלזיוס. במיכלים אטומים, החלבון יציב בשתן למשך יומיים בטמפרטורת החדר, למעלה עד 17 ימים במקרר (4-8 8 C).

הערות: רמת החלבון הכוללת עשויה להיות תלויה בגיל (נמוכה יותר בילדים ובקשישים), מגדר (גבוהה יותר אצל גברים) ובתזונה. הגורמים הבאים גורמים לעלייה בחלבוני הדם: שהייה ממושכת במצב זקוף, מתח, צריכת אלכוהול, תרופות מסוימות (cefotaxime, furosemide, phenobarbital, prednisolone, progesterone). ירידה ברמת החלבונים בדם נגרמת כתוצאה מ: טראומה, עישון, הריון, צום, הפסקה בצריכת אלכוהול, תת תזונה, השמנת יתר, תרופות מסוימות (דקסטרן, איבופרופן, אמצעי מניעה דרך הפה).

שיעורי בית Pustovalova L.M. עמוד יסודות הביוכימיה למכללות רפואיות