שיטות מחקר וירולוגיות ישירות ועקיפות. שיטות מחקר וירולוגיות במיקרוביולוגיה

שיטות מחקר וירולוגיות- שיטות לחקר הביולוגיה של וירוסים וזיהוים. בווירולוגיה, נעשה שימוש נרחב בשיטות של ביולוגיה מולקולרית, בעזרתן ניתן היה לקבוע את המבנה המולקולרי של חלקיקים ויראליים, כיצד הם חודרים לתא ואת תכונות הרבייה של וירוסים, המבנה הראשוני של חומצות גרעין ויראליות. וחלבונים. מפותחות שיטות לקביעת רצף המרכיבים המרכיבים של חומצות גרעין ויראליות וחומצות אמינו חלבוניות. ניתן לקשר את הפונקציות של חומצות הגרעין והחלבונים שהן מקודדות עם רצף הנוקלאוטידים ולבסס את הגורמים לתהליכים תוך-תאיים הממלאים תפקיד חשוב בהדבקה בנגיף האלקטרוני.

שיטות מחקר וירולוגיות מבוססות גם על תהליכים אימונולוגיים (אינטראקציה של אנטיגן עם נוגדנים), תכונות ביולוגיות של הנגיף (יכולת להמגלוטינה, המוליזה, פעילות אנזימטית), תכונות של האינטראקציה של הנגיף עם התא המארח (אופי הציטופטי השפעה, היווצרות תכלילים תוך תאיים וכו').

באבחון זיהומים ויראליים, בגידול, בידוד וזיהוי וירוסים וכן בהכנת תכשירי חיסון, נעשה שימוש נרחב בשיטת התרבית רקמות ותאים. נעשה שימוש בתרביות תאים ראשוניות, משניות, רציפות ודיפלואידיות יציבות. תרביות ראשוניות מתקבלות על ידי פיזור רקמה עם אנזימים פרוטאוליטיים (טריפסין, קולגנאז). מקור התאים יכול להיות רקמות ואיברים (לעתים קרובות יותר כליות) של עוברי אדם ובעלי חיים. תרחיף של תאים במדיום תזונתי ממוקם במזרנים, בקבוקים או צלחות פטרי, שם, לאחר הצמדות אל פני הכלי, התאים מתחילים להתרבות. לזיהום בנגיף, בדרך כלל משתמשים בשכבת תאים. נוזל התזונה מרוקן, התרחיף הנגיפי מוכנס בדילולים מסוימים ולאחר מגע עם התאים מוסיפים מצע תזונתי טרי, לרוב ללא סרום.

תאים מרוב התרבויות הראשוניות ניתנים לתרבית משנה והם מכונים תרבויות משניות. עם מעבר נוסף של תאים, נוצרת אוכלוסייה של תאים דמויי פיברובלסט, המסוגלת להתרבות מהירה, שרובם שומרים על מערכת הכרומוזומים המקורית. אלה הם מה שנקרא תאים דיפלואידים. בגידול סדרתי של תאים מתקבלות תרביות תאים רציפות יציבות. במהלך המעברים, מופיעים תאים הומוגניים המתחלקים במהירות עם קבוצה הטרופלואידית של כרומוזומים. קווי תאים יציבים יכולים להיות חד-שכבתיים והשעיה. תרביות חד-שכבתיות גדלות בצורה של שכבה רציפה על משטח הזכוכית, תרביות תרחיף גדלות בצורה של תרחיפים בכלים שונים באמצעות מערבלים. יש יותר מ-400 שורות תאים שמקורן ב-40 מיני בעלי חיים שונים (כולל פרימטים, ציפורים, זוחלים, דו-חיים, דגים, חרקים) ובני אדם.

ניתן לטפח חתיכות של איברים ורקמות בודדות (תרביות איברים) במדיה תזונתית מלאכותית. סוגים אלה של תרביות משמרים את מבנה הרקמה, שחשוב במיוחד לבידוד ומעבר של וירוסים שאינם מתרבים בתרביות רקמה לא מובחנות (למשל, נגיפים).

בתרביות תאים נגועים ניתן לזהות וירוסים על ידי שינוי במורפולוגיה של התא, פעולה ציטופטית, שעשויה להיות ספציפית, הופעת תכלילים, על ידי קביעת אנטיגנים ויראליים בתא ובנוזל התרבית; קביעת התכונות הביולוגיות של צאצאים נגיפיים בנוזל תרבית וטיטרציה של וירוסים בתרבית רקמה, עוברי אפרוחים או בעלי חיים רגישים; על ידי זיהוי חומצות גרעין ויראליות בודדות בתאים על ידי הכלאה מולקולרית או אשכולות של חומצות גרעין בשיטה ציטוכימית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

בידוד וירוסים הוא תהליך מייגע וארוך. היא מתבצעת על מנת לקבוע את סוג או הווריאציה של הנגיף המסתובב בקרב האוכלוסיה (לדוגמה, לזהות את הסרווריאנט של וירוס a, בר או זן חיסון של וירוס a וכו'); במקרים בהם יש צורך בביצוע צעדים אפידמיולוגיים דחופים; כאשר מופיעים סוגים או גרסאות חדשות של וירוסים; במידת הצורך, אשר את האבחנה המוקדמת; לאינדיקציה של וירוסים בחפצים סביבתיים. בעת בידוד וירוסים, נלקחת בחשבון האפשרות של התמדה שלהם בגוף האדם, כמו גם התרחשות של זיהום מעורב שנגרם על ידי שני וירוסים או יותר. אוכלוסייה הומוגנית מבחינה גנטית של וירוס המתקבלת מנגיף בודד נקראת שיבוט ויראלי, ותהליך השגתו נקרא שיבוט.

כדי לבודד וירוסים, זיהום של חיות מעבדה רגישות, עוברי עוף משמש, אך לרוב נעשה שימוש בתרבית רקמה. נוכחות הנגיף נקבעת בדרך כלל על ידי ניוון תאים ספציפי (אפקט ציטופטי),

היווצרות סימפלסטים וסינסיטיות, זיהוי תכלילים תוך-תאיים, כמו גם אנטיגן ספציפי שזוהה באמצעות אימונופלואורסצנטי, ספיחה של המד, המאגלוטינציה (בנגיפים המגלוטינים) וכו'. ניתן לזהות סימנים אלו רק לאחר 2-3 מעברים של הנגיף.

לבידוד של מספר וירוסים, למשל וירוסים a, משתמשים בעוברי עוף, לבידוד של חלק מנגיפי קוקסאקי ומספר ארבו-וירוסים - עכברים שזה עתה נולדו. זיהוי וירוסים מבודדים מתבצע באמצעות בדיקות סרולוגיות ושיטות אחרות.

כאשר עובדים עם וירוסים, הטיטר שלהם נקבע. טיטרציה של וירוסים מתבצעת בדרך כלל בתרבית רקמה, תוך קביעת הדילול הגבוה ביותר של הנוזל המכיל את הנגיף, שבו מתרחשת ניוון רקמות, נוצרים תכלילים ואנטיגנים ספציפיים לווירוס. ניתן להשתמש בשיטת הפלאק לטיטרציה של מספר וירוסים. פלאקים, או מושבות שליליות של וירוסים, הם מוקדים של תאים שהושמדו וירוסים של תרבית רקמה חד-שכבתית תחת ציפוי אגר. ספירת מושבות מאפשרת ניתוח כמותי של הפעילות המדבקת של וירוסים על בסיס שחלקיק וירוס מדבק אחד יוצר רובד אחד. לוחות מזוהים על ידי צביעה של התרבית עם צבעים חיוניים, בדרך כלל אדום ניטרלי; הפלאקים אינם סופחים את הצבע ולכן נראים ככתמים בהירים על רקע תאים חיים מוכתמים. הטיטר של הנגיף מבוטא כמספר היחידות היוצרות פלאק ב-1 ml.

טיהור וריכוז של וירוסים מתבצע בדרך כלל על ידי אולטרה צנטריפוגה דיפרנציאלית ולאחריה צנטריפוגה בדרגות ריכוז או צפיפות. כדי לטהר וירוסים, נעשה שימוש בשיטות אימונולוגיות, כרומטוגרפיה של חילופי יונים, אימונוסורבנטים וכו'.

אבחון מעבדה של זיהומים ויראליים כולל איתור הפתוגן או מרכיביו בחומר קליני; בידוד וירוסים מחומר זה; serodiagnosis. בחירת שיטת האבחון המעבדתית בכל מקרה לגופו תלויה באופי המחלה, בתקופת המחלה וביכולות המעבדה. אבחון מודרני של זיהומים ויראליים מתבסס על שיטות אקספרס המאפשרות לקבל מענה מספר שעות לאחר נטילת חומר קליני בשלבים המוקדמים לאחר המחלה, ביניהם מיקרוסקופ אלקטרונים ואלקטרונים חיסוניים,

כמו גם אימונופלואורסצנטי, שיטת הכלאה מולקולרית, זיהוי נוגדנים מסוג lgM וכו'.

מיקרוסקופ אלקטרוני של וירוסים מוכתמים שלילי מאפשרת בידול של וירוסים וקביעת ריכוזם. השימוש במיקרוסקופ אלקטרוני באבחון זיהומים ויראליים מוגבל לאותם מקרים שבהם ריכוז החלקיקים הנגיפיים בחומר הקליני גבוה מספיק (10 5 ב-1 mlוגבוה יותר). החיסרון של השיטה הוא חוסר היכולת להבחין בין וירוסים השייכים לאותה קבוצה טקסונומית. חיסרון זה מתבטל על ידי שימוש במיקרוסקופיה אלקטרונית חיסונית. השיטה מבוססת על יצירת קומפלקסים חיסוניים כאשר מוסיפים סרום ספציפי לחלקיקים ויראליים, תוך כדי ריכוז בו-זמנית של חלקיקים ויראליים המאפשר לזהות אותם. השיטה משמשת גם לאיתור נוגדנים. לצורך אבחון אקספרס, מתבצעת בדיקה אלקטרונית מיקרוסקופית של תמציות רקמות, צואה, נוזל שלפוחית ​​וסודות מהאף. מיקרוסקופ אלקטרוני נמצא בשימוש נרחב כדי לחקור את המורפוגנזה של הנגיף; היכולות שלו מורחבות עם השימוש בנוגדנים מסומנים.

שיטת ההכלאה המולקולרית, המבוססת על זיהוי חומצות גרעין ספציפיות לווירוס, מאפשרת לזהות עותקים בודדים של גנים ואין לה אח ורע מבחינת הרגישות. התגובה מבוססת על הכלאה של גדילים משלימים של DNA או RNA (בדיקות) ויצירת מבנים דו-גדיליים. הבדיקה הזולה ביותר היא DNA רקומביננטי משובט. הבדיקה מסומנת במבשרים רדיואקטיביים (בדרך כלל זרחן רדיואקטיבי). השימוש בתגובות קולורימטריות מבטיח. ישנן מספר וריאנטים של הכלאה מולקולרית: הכלאה נקודתית, הכלאה כתם, הכלאה של סנדוויץ', הכלאה באתרו וכו'.

נוגדנים מקבוצת lgM מופיעים מוקדם יותר מנוגדנים מסוג G (ביום ה-3-5 למחלה) ונעלמים לאחר מספר שבועות, כך שזיהוים מצביע על זיהום לאחרונה. נוגדנים מקבוצת IgM מתגלים על ידי אימונופלואורסצנטי או בדיקת אנזים אימונו באמצעות anti-m antisera (סרת שרשרת כבדה נגד IgM).

שיטות סרולוגיות בווירולוגיה מבוססות על תגובות אימונולוגיות קלאסיות (ראה. שיטות מחקר אימונולוגיות ): תגובות קיבוע משלים

עיכוב של hemagglutination, נטרול ביולוגי, immunodifusion, hemagglutination עקיף, המוליזה רדיאלית, immunofluorescence, immunoassay אנזים, radioimmunoassay. פותחו מיקרו-שיטות לתגובות רבות, והטכניקות שלהן משתפרות ללא הרף. שיטות אלו משמשות לזיהוי וירוסים באמצעות קבוצה של סרומים ידועים ועבור סרודאיגנוזיס על מנת לקבוע את העלייה בנוגדנים בסרום השני בהשוואה לראשון (הנסיוב הראשון נלקח בימים הראשונים לאחר המחלה, השני - לאחר 2-3 שבועות). ערך אבחון אינו פחות מעלייה של פי ארבע בנוגדנים בסרום השני. אם גילוי נוגדנים מקבוצת lgM מעיד על זיהום לאחרונה, אזי הנוגדנים מקבוצת lgC נמשכים מספר שנים, ולעיתים לכל החיים.

כדי לזהות אנטיגנים בודדים של וירוסים ונוגדנים אליהם בתערובות מורכבות ללא טיהור חלבון קודם, משתמשים באימונובלוטינג. השיטה משלבת חלוקת חלבונים באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד עם בדיקת אימונו של חלבונים לאחר מכן על ידי בדיקת אנזים אימונו. הפרדת החלבונים מפחיתה את הדרישות לטוהר הכימי של האנטיגן ומאפשרת לזהות זוגות אנטיגן-נוגדנים בודדים. משימה זו רלוונטית, למשל, ב-serodiagnosis של זיהום ב-HIV, כאשר תגובות חיוביות כוזבות של אנזים חיסוני נובעות מנוכחות של נוגדנים לאנטיגנים של תאים, הקיימים כתוצאה מטיהור לא מספק של חלבונים ויראליים. זיהוי נוגדנים בסרה של חולים לאנטיגנים ויראליים פנימיים וחיצוניים מאפשר לקבוע את שלב המחלה, ובניתוח אוכלוסיות - השונות של חלבונים ויראליים. אימונובלוטינג בזיהום ב-HIV משמש כבדיקת אישור לאיתור אנטיגנים ויראליים בודדים ונוגדנים אליהם. בעת ניתוח אוכלוסיות, השיטה משמשת לקביעת השונות של חלבונים ויראליים. הערך הרב של השיטה טמון באפשרות לנתח אנטיגנים המסונתזים בטכנולוגיית DNA רקומביננטי, ביסוס גודלם ונוכחותם של דטרמיננטים אנטיגנים.

בִּיבּלִיוֹגְרָפִיָה:בוקרינסקאיה א.ג. Virology, M., 1986; וירולוגיה, שיטות, עורך. ב' מיכי, טרנס. מאנגלית, מ', 1988; מדריך לשיטות מחקר מיקרוביולוגיות וויירולוגיות, עורך. M.O. בירגר, מ', 1982.

מחקר לאבחון מחלות בעלות אופי ויראלי. זה הכרחי על מנת לזהות את הנגיף, לחקור את הביולוגיה שלו ואת יכולתו להשפיע על תאים של בעלי חיים ובני אדם. כך, ניתן להבין את הפתוגנזה של מחלות ויראליות, ובהתאם, לבחור את שיטת הטיפול הנכונה.

מה האבחנה?

בתאים חיים. כדי לחקור אותו, יש צורך לטפח אותו ברמה של אורגניזם ניסיוני או לשם כך, שיטות מחקר וירולוגיות מתבצעות בפרקטיקה הרפואית ובמיקרוביולוגיה בכלל, שיש להן את הגישות העיקריות הבאות:

• יָשָׁר;
• עקיף;
• סרולוגי.

ניתן לבחון את החומר ישירות לנוכחות חומצות גרעין, אנטיגן ויראלי, או, למשל, לבודד ולזהות את הנגיף מחומר קליני.

בנוסף ליכולת לבסס את האטיולוגיה של המחלה, ניטור ההשפעה הטיפולית, שיטות מחקר וירולוגיות ממלאות תפקיד חשוב באמצעים אנטי מגיפה. לבידוד ושימוש בעוברי עוף, חיות מעבדה או תרביות תאים.

איך הם נחקרים?

המהירה ביותר היא השיטה הישירה. זה מאפשר לך לזהות וירוס, אנטיגן או NA (חומצת גרעין) בחומר הקליני עצמו. זה לוקח בין שעתיים ליום.

1. EM - מיקרוסקופיה אלקטרונית. מזהה את הנגיף ישירות.
2. IEM - מיקרוסקופיה אלקטרונית חיסונית. משתמש בנוגדנים ספציפיים לווירוסים.
3. RIF - תגובה אימונופלואורסצנטית. משתמש בנוגדנים הקשורים לצבע. שיטות מחקר וירולוגיות כאלה נמצאות בשימוש נרחב כפענוח מהיר של האטיולוגיה של SARS (זיהומים נגיפיים חריפים בדרכי הנשימה), כאשר ספוגיות נלקחות מהקרום הרירי של דרכי הנשימה העליונות.
4. ELISA - enzyme immunoassay - קביעת אנטיגנים ויראליים, בדומה ל-RIF, אך מבוססת על סימון אנזים של נוגדנים.
5. RIA - בדיקת רדיואימונו. משתמש בסימון רדיואיזוטופים של נוגדנים כדי לספק רגישות גבוהה בזיהוי אנטיגן ויראלי.
6. מולקולרית - הכלאה של NK או בידוד גנומים של וירוסים באמצעות PCR (תגובת שרשרת פולימראז).
7. ציטולוגיה - בשימוש נדיר, אך עבור זיהומים מסוימים, שיטות מחקר וירולוגיות אלו יעילות מאוד. נבדקים חומרי ביופסיה, נתיחות ומריחות המעובדות לצביעה וניתוח במיקרוסקופ.

מה הטעם במחקר?

לבידוד מוצלח של וירוסים, חומר קליני נלקח בהתאם לפתוגנזה ומוקדם ככל האפשר. לעתים קרובות תהליך זה דורש מספר מעברים לפני יישום מבחני וירולוגיים מסוימים.

מיקרוביולוגיה היא חקר יצורים מיקרוסקופיים. והתחום שלה הוא לא רק רפואה. זהו מדע יסוד לחקלאות, רפואה וטרינרית, חלל ותעשייה טכנית וגיאולוגיה.

אבל כמובן, הכל נוצר עבור האדם והתפתחותו על הפלנטה היפה הזו. לכן, חשוב מאוד לזהות את הסכנה בזמן ולנטרל אותה. וירוסים שונים מחיידקים. אלו מבנים שנכנסים לגוף וגורמים להיווצרות דור חדש. הם נראים כמו גבישים ומכוונים לשלוט בתהליך הרבייה שלהם, למרות שהם עצמם אינם ניזונים, אינם גדלים ואינם מפרישים מוצרים מטבוליים.

הנגיף יכול לגרום למחלה קשה בכל אורגניזם חי שאליו הוא נכנס. בנוסף, זה יכול להתפתח. לכן יש לפתח ולשפר שיטות מחקר וירולוגיות במיקרוביולוגיה, שכן הציוויליזציה האנושית כולה עלולה להיות תחת איום.

חומרים

כדי לזהות ולזהות וירוסים ברפואה, ככלל, הם לוקחים:

• שטיפה באף הלוע (זיהומים בדרכי הנשימה);
• שטיפה וצואה (זיהומים בנגיף אנטרו);
• גרידות, תוכן השלפוחיות (נגעי עור, ריריות, כמו הרפס, אבעבועות רוח);
• סומק (זיהומים אקסנטמיים כמו חצבת, אדמת);
• דם, נוזל מוחי (זיהומים ארבו-וירוס).

שלבים

כל השלבים של שיטת המחקר הווירולוגית כוללים:

• איסוף חומר;
• בחירה, השגת מערכת בדיקה, קביעת הכדאיות שלה;
• זיהום של מערכת הבדיקה;
• אינדיקציה לנגיף;
• קביעת סוג הנגיף.

בעיקרון, וירוסים פתוגניים שונים בנוכחות ספציפיות של רקמה וסוג. קחו, למשל, את נגיף הפוליו, שמתרבה רק בפרימטים (בתאים שלהם). בהתאם לכך, תרבית רקמה ספציפית משמשת לבידוד וירוס מסוים. אם אנחנו מדברים על פתוגן לא ידוע, אז כדאי להדביק בו זמנית שלוש, ועדיף ארבע תרביות תאים.

לפיכך, אולי אחד מהם יהיה רגיש. כדי לקבוע את נוכחות הנגיף בתרביות נגועות, הסתכלו על התפתחות של ניוון תאים ספציפי, תכלילים תוך תאיים, זיהוי של אנטיגן ספציפי, בדיקות המגלוטינציה חיובית ובדיקות hemadsorption.

יש לבחור את כל שיטות החקירה הווירולוגיות (ישירות ועקיפות, סרולוגיות) כמתאימות ביותר למקרה מסוים של חשד לזיהום.

שיטות עקיפות מבוססות על בידוד וזיהוי של הנגיף. הם מייגעים, ארוכים, אך מדויקים.

אבחון סרוד

אבחנה זו מתייחסת לשיטה המבוססת על תגובת אנטיגן-נוגדן. לרוב, נעשה שימוש בסרחי דם מזווגים, הנלקחים במרווחים של מספר שבועות. אם העלייה בטיטר הנוגדנים היא פי 4 או יותר, התגובה נחשבת חיובית. כדי לקבוע את ספציפיות הסוג של וירוס, נעשה שימוש במבחן נטרול וירוס. כדי לקבוע את הספציפיות של הקבוצה, אתה צריך לקבל את תגובת קיבוע המשלים.

וריאנטים שונים של בדיקת אימונו אנזים, תגובה לעיכוב hemagglutination, hemagglutination פסיבי, hemagglutination פסיבי הפוך, RIF נמצאים בשימוש נרחב. גם בהנדסה גנטית פותחה שיטה להשגת נוגדנים חד שבטיים. ניתן להתגבר על הספציפיות הצרה של מונוקלונים על ידי שימוש במספר נוגדנים חד שבטיים לדטרמיננטים ויראליים שונים. לפיכך, הספציפיות והרגישות של המבחן עם קביעת אנטיגנים גדלו.

כמה מאפיינים

כיום נוצרו מערכות בדיקה רבות ושונות לאבחון אימונולוגי של זיהומים הנובעים מחדירת נגיף לאורגניזם חי.

לפיכך, שיטות מחקר וירולוגיות הן שיטות לבידוד נגיפים, לימוד תכונותיהם וביסוס הקשר האטיולוגי שלהם עם מחלות מסוימות.

שיטות מחקר וירולוגיות- שיטות לחקר הביולוגיה של וירוסים וזיהוים. בווירולוגיה, נעשה שימוש נרחב בשיטות של ביולוגיה מולקולרית, בעזרתן ניתן היה לקבוע את המבנה המולקולרי של חלקיקים ויראליים, כיצד הם חודרים לתא ואת תכונות הרבייה של וירוסים, המבנה הראשוני של חומצות גרעין ויראליות. וחלבונים. מפותחות שיטות לקביעת רצף המרכיבים המרכיבים של חומצות גרעין ויראליות וחומצות אמינו חלבוניות. ניתן לקשר בין הפונקציות של חומצות הגרעין והחלבונים המקודדים על ידן עם רצף הנוקלאוטידים ולבסס את הגורמים לתהליכים תוך תאיים הממלאים תפקיד חשוב בפתוגנזה של זיהום ויראלי.

שיטות מחקר וירולוגיות מבוססות גם על תהליכים אימונולוגיים (אינטראקציה של אנטיגן עם נוגדנים), תכונות ביולוגיות של הנגיף (יכולת להמגלוטינה, המוליזה, פעילות אנזימטית), תכונות של האינטראקציה של הנגיף עם התא המארח (אופי הציטופטי השפעה, היווצרות תכלילים תוך תאיים וכו').

באבחון זיהומים ויראליים, בגידול, בידוד וזיהוי וירוסים וכן בהכנת תכשירי חיסון, נעשה שימוש נרחב בשיטת התרבית רקמות ותאים. נעשה שימוש בתרביות תאים ראשוניות, משניות, רציפות ודיפלואידיות יציבות. תרביות ראשוניות מתקבלות על ידי פיזור רקמה עם אנזימים פרוטאוליטיים (טריפסין, קולגנאז). מקור התאים יכול להיות רקמות ואיברים (לעתים קרובות יותר כליות) של עוברי אדם ובעלי חיים. תרחיף של תאים במדיום תזונתי ממוקם במזרנים, בקבוקים או צלחות פטרי, שם, לאחר הצמדות אל פני הכלי, התאים מתחילים להתרבות. לזיהום בנגיף, בדרך כלל משתמשים בשכבת תאים. נוזל התזונה מרוקן, התרחיף הנגיפי מוכנס בדילולים מסוימים ולאחר מגע עם התאים מוסיפים מצע תזונתי טרי, לרוב ללא סרום.

תאים מרוב התרבויות הראשוניות ניתנים לתרבית משנה והם מכונים תרבויות משניות. עם מעבר נוסף של תאים, נוצרת אוכלוסייה של תאים דמויי פיברובלסט, המסוגלת להתרבות מהירה, שרובם שומרים על מערכת הכרומוזומים המקורית. אלה הם מה שנקרא תאים דיפלואידים. בגידול סדרתי של תאים מתקבלות תרביות תאים רציפות יציבות. במהלך המעברים, מופיעים תאים הומוגניים המתחלקים במהירות עם קבוצה הטרופלואידית של כרומוזומים. קווי תאים יציבים יכולים להיות חד-שכבתיים והשעיה. תרביות חד-שכבתיות גדלות בצורה של שכבה רציפה על משטח הזכוכית, תרביות תרחיף גדלות בצורה של תרחיפים בכלים שונים באמצעות מערבלים. יש יותר מ-400 שורות תאים שמקורן ב-40 מיני בעלי חיים שונים (כולל פרימטים, ציפורים, זוחלים, דו-חיים, דגים, חרקים) ובני אדם.

ניתן לטפח חתיכות של איברים ורקמות בודדות (תרביות איברים) במדיה תזונתית מלאכותית. סוגים אלה של תרביות משמרים את מבנה הרקמה, שחשוב במיוחד לבידוד ומעבר של וירוסים שאינם מתרבים בתרביות רקמה לא מובחנות (למשל, נגיפים).

בתרביות תאים נגועים ניתן לזהות וירוסים על ידי שינוי במורפולוגיה של התא, פעולה ציטופטית, שעשויה להיות ספציפית, הופעת תכלילים, על ידי קביעת אנטיגנים ויראליים בתא ובנוזל התרבית; קביעת התכונות הביולוגיות של צאצאים נגיפיים בנוזל תרבית וטיטרציה של וירוסים בתרבית רקמה, עוברי אפרוחים או בעלי חיים רגישים; על ידי זיהוי חומצות גרעין ויראליות בודדות בתאים על ידי הכלאה מולקולרית או אשכולות של חומצות גרעין בשיטה ציטוכימית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

בידוד וירוסים הוא תהליך מייגע וארוך. הוא מתבצע על מנת לקבוע את סוג הנגיף או הווריאציה של הנגיף המסתובב בקרב האוכלוסייה (לדוגמה, לזהות את הסרווריאנט של נגיף השפעת, זן הבר או החיסון של נגיף הפוליו וכו'); במקרים בהם יש צורך בביצוע צעדים אפידמיולוגיים דחופים; כאשר מופיעים סוגים או גרסאות חדשות של וירוסים; במידת הצורך, אשר את האבחנה המוקדמת; לאינדיקציה של וירוסים בחפצים סביבתיים. בעת בידוד וירוסים, נלקחת בחשבון האפשרות של התמדה שלהם בגוף האדם, כמו גם התרחשות של זיהום מעורב שנגרם על ידי שני וירוסים או יותר. אוכלוסייה הומוגנית מבחינה גנטית של וירוס המתקבלת מנגיף בודד נקראת שיבוט ויראלי, ותהליך השגתו נקרא שיבוט.

כדי לבודד וירוסים, זיהום של חיות מעבדה רגישות, עוברי עוף משמש, אך לרוב נעשה שימוש בתרבית רקמה. נוכחות נגיף נקבעת בדרך כלל על ידי ניוון תאים ספציפי (אפקט ציטופטי), היווצרות סימפלסטים וסינסיטיות, זיהוי תכלילים תוך תאיים, וכן אנטיגן ספציפי שזוהה באמצעות אימונופלואורסצנטי, ספיחה המד, המאגלוטינציה (בנגיפים הממגלוטינים) וכו' . ניתן לזהות סימנים אלו רק לאחר 2-3 מעברים של הנגיף.

לבידוד של מספר וירוסים, כמו נגיפי שפעת, משתמשים בעוברי תרנגולת, לבידוד של כמה מנגיפי קוקסאקי ומספר נגיפים ארבו משתמשים בעכברים שזה עתה נולדו. זיהוי וירוסים מבודדים מתבצע באמצעות בדיקות סרולוגיות ושיטות אחרות.

כאשר עובדים עם וירוסים, הטיטר שלהם נקבע. טיטרציה של וירוסים מתבצעת בדרך כלל בתרבית רקמה, תוך קביעת הדילול הגבוה ביותר של הנוזל המכיל את הנגיף, שבו מתרחשת ניוון רקמות, נוצרים תכלילים ואנטיגנים ספציפיים לווירוס. ניתן להשתמש בשיטת הפלאק לטיטרציה של מספר וירוסים. פלאקים, או מושבות שליליות של וירוסים, הם מוקדים של תאים שהושמדו וירוסים של תרבית רקמה חד-שכבתית תחת ציפוי אגר. ספירת מושבות מאפשרת ניתוח כמותי של הפעילות המדבקת של וירוסים על בסיס שחלקיק וירוס מדבק אחד יוצר רובד אחד. לוחות מזוהים על ידי צביעה של התרבית עם צבעים חיוניים, בדרך כלל אדום ניטרלי; הפלאקים אינם סופחים את הצבע ולכן נראים ככתמים בהירים על רקע תאים חיים מוכתמים. הטיטר של הנגיף מבוטא כמספר היחידות היוצרות פלאק ב-1 ml.

טיהור וריכוז של וירוסים מתבצע בדרך כלל על ידי אולטרה צנטריפוגה דיפרנציאלית ולאחריה צנטריפוגה בדרגות ריכוז או צפיפות. כדי לטהר וירוסים, נעשה שימוש בשיטות אימונולוגיות, כרומטוגרפיה של חילופי יונים, אימונוסורבנטים וכו'.

אבחון מעבדה של זיהומים ויראליים כולל איתור הפתוגן או מרכיביו בחומר קליני; בידוד וירוסים מחומר זה; serodiagnosis. בחירת שיטת האבחון המעבדתית בכל מקרה לגופו תלויה באופי המחלה, בתקופת המחלה וביכולות המעבדה. האבחון המודרני של זיהומים ויראליים מבוסס על שיטות אקספרס המאפשרות קבלת תגובה מספר שעות לאחר נטילת חומר קליני בשלבים המוקדמים לאחר המחלה, הכוללות מיקרוסקופ אלקטרונים ואלקטרונים חיסוניים וכן אימונופלואורסצנטי, שיטת הכלאה מולקולרית, איתור נוגדנים מקבוצת lgM וכו'.

מיקרוסקופ אלקטרוני של וירוסים מוכתמים שלילי מאפשרת בידול של וירוסים וקביעת ריכוזם. השימוש במיקרוסקופ אלקטרוני באבחון זיהומים ויראליים מוגבל לאותם מקרים שבהם ריכוז החלקיקים הנגיפיים בחומר הקליני גבוה מספיק (10 5 ב-1 mlוגבוה יותר). החיסרון של השיטה הוא חוסר היכולת להבחין בין וירוסים השייכים לאותה קבוצה טקסונומית. חיסרון זה מתבטל על ידי שימוש במיקרוסקופיה אלקטרונית חיסונית. השיטה מבוססת על יצירת קומפלקסים חיסוניים כאשר מוסיפים סרום ספציפי לחלקיקים ויראליים, תוך כדי ריכוז בו-זמנית של חלקיקים ויראליים המאפשר לזהות אותם. השיטה משמשת גם לאיתור נוגדנים. לצורך אבחון אקספרס, מתבצעת בדיקה אלקטרונית מיקרוסקופית של תמציות רקמות, צואה, נוזל שלפוחית ​​וסודות מהאף. מיקרוסקופ אלקטרוני נמצא בשימוש נרחב כדי לחקור את המורפוגנזה של הנגיף; היכולות שלו מורחבות עם השימוש בנוגדנים מסומנים.

שיטת ההכלאה המולקולרית, המבוססת על זיהוי חומצות גרעין ספציפיות לווירוס, מאפשרת לזהות עותקים בודדים של גנים ואין לה אח ורע מבחינת הרגישות. התגובה מבוססת על הכלאה של גדילים משלימים של DNA או RNA (בדיקות) ויצירת מבנים דו-גדיליים. הבדיקה הזולה ביותר היא DNA רקומביננטי משובט. הבדיקה מסומנת במבשרים רדיואקטיביים (בדרך כלל זרחן רדיואקטיבי). השימוש בתגובות קולורימטריות מבטיח. ישנן מספר וריאנטים של הכלאה מולקולרית: הכלאה נקודתית, הכלאה כתם, הכלאה של סנדוויץ', הכלאה באתרו וכו'.

נוגדנים מסוג lgM מופיעים מוקדם יותר מנוגדנים מסוג G (ביום ה-3-5 למחלה) ונעלמים לאחר מספר שבועות, כך שזיהוים מצביע על זיהום לאחרונה. נוגדנים מקבוצת IgM מתגלים על ידי אימונופלואורסצנטי או בדיקת אנזים אימונו באמצעות anti-m antisera (סרת שרשרת כבדה נגד IgM).

שיטות סרולוגיות בווירולוגיה מבוססות על תגובות אימונולוגיות קלאסיות (ראה. שיטות מחקר אימונולוגיות ): תגובות קיבוע משלים, עיכוב hemagglutination, נטרול ביולוגי, immunodiffusion, hemagglutination עקיף, המוליזה רדיאלית, immunofluorescence, immunoassay אנזים, radioimmunoassay. פותחו מיקרו-שיטות לתגובות רבות, והטכניקות שלהן משתפרות ללא הרף. שיטות אלו משמשות לזיהוי וירוסים באמצעות קבוצה של סרומים ידועים ועבור סרודאיגנוזיס על מנת לקבוע את העלייה בנוגדנים בסרום השני בהשוואה לראשון (הנסיוב הראשון נלקח בימים הראשונים לאחר המחלה, השני - לאחר 2-3 שבועות). ערך אבחון אינו פחות מעלייה של פי ארבע בנוגדנים בסרום השני. אם גילוי נוגדנים מקבוצת lgM מעיד על זיהום לאחרונה, אזי הנוגדנים מקבוצת lgC נמשכים מספר שנים, ולעיתים לכל החיים.

כדי לזהות אנטיגנים בודדים של וירוסים ונוגדנים אליהם בתערובות מורכבות ללא טיהור חלבון קודם, משתמשים באימונובלוטינג. השיטה משלבת חלוקת חלבונים באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד עם בדיקת אימונו של חלבונים לאחר מכן על ידי בדיקת אנזים אימונו. הפרדת החלבונים מפחיתה את הדרישות לטוהר הכימי של האנטיגן ומאפשרת לזהות זוגות אנטיגן-נוגדנים בודדים. משימה זו רלוונטית, למשל, ב-serodiagnosis של זיהום ב-HIV, כאשר תגובות חיוביות כוזבות של אנזים חיסוני נובעות מנוכחות של נוגדנים לאנטיגנים של תאים, הקיימים כתוצאה מטיהור לא מספק של חלבונים ויראליים. זיהוי נוגדנים בסרום של חולים לאנטיגנים נגיפיים פנימיים וחיצוניים מאפשר לקבוע את שלב המחלה, ובניתוח אוכלוסיות את השונות של חלבונים ויראליים. אימונובלוטינג בזיהום ב-HIV משמש כבדיקת אישור לאיתור אנטיגנים ויראליים בודדים ונוגדנים אליהם. בעת ניתוח אוכלוסיות, השיטה משמשת לקביעת השונות של חלבונים ויראליים. הערך הרב של השיטה טמון באפשרות לנתח אנטיגנים המסונתזים בטכנולוגיית DNA רקומביננטי, ביסוס גודלם ונוכחותם של דטרמיננטים אנטיגנים.

שיטות לחקר הביולוגיה של וירוסים וזיהוים. בווירולוגיה, נעשה שימוש נרחב בשיטות של ביולוגיה מולקולרית, בעזרתן ניתן היה לקבוע את המבנה המולקולרי של חלקיקים ויראליים, כיצד הם חודרים לתא ואת תכונות הרבייה של וירוסים, המבנה הראשוני של חומצות גרעין ויראליות. וחלבונים. מפותחות שיטות לקביעת רצף המרכיבים המרכיבים של חומצות גרעין ויראליות וחומצות אמינו חלבוניות. ניתן לקשר בין הפונקציות של חומצות הגרעין והחלבונים המקודדים על ידן עם רצף הנוקלאוטידים ולבסס את הגורמים לתהליכים תוך תאיים הממלאים תפקיד חשוב בפתוגנזה של זיהום ויראלי.

שיטות מחקר וירולוגיות מבוססות גם על תהליכים אימונולוגיים (אינטראקציה של אנטיגן עם נוגדנים), תכונות ביולוגיות של הנגיף (יכולת להמגלוטינה, המוליזה, פעילות אנזימטית), תכונות של האינטראקציה של הנגיף עם התא המארח (אופי הציטופטי השפעה, היווצרות תכלילים תוך תאיים וכו').

באבחון זיהומים ויראליים, בגידול, בידוד וזיהוי וירוסים וכן בהכנת תכשירי חיסון, נעשה שימוש נרחב בשיטת התרבית רקמות ותאים. נעשה שימוש בתרביות תאים ראשוניות, משניות, רציפות ודיפלואידיות יציבות. תרביות ראשוניות מתקבלות על ידי פיזור רקמה עם אנזימים פרוטאוליטיים (טריפסין, קולגנאז). מקור התאים יכול להיות רקמות ואיברים (לעתים קרובות יותר כליות) של עוברי אדם ובעלי חיים. תרחיף של תאים במדיום תזונתי ממוקם במזרנים, בקבוקים או צלחות פטרי, שם, לאחר הצמדות אל פני הכלי, התאים מתחילים להתרבות. לזיהום בנגיף, בדרך כלל משתמשים בשכבת תאים. נוזל התזונה מרוקן, התרחיף הנגיפי מוכנס בדילולים מסוימים ולאחר מגע עם התאים מוסיפים מצע תזונתי טרי, לרוב ללא סרום.

תאים מרוב התרבויות הראשוניות ניתנים לתרבית משנה והם מכונים תרבויות משניות. עם מעבר נוסף של תאים, נוצרת אוכלוסייה של תאים דמויי פיברובלסט, המסוגלת להתרבות מהירה, שרובם שומרים על מערכת הכרומוזומים המקורית. אלה הם מה שנקרא תאים דיפלואידים. בגידול סדרתי של תאים מתקבלות תרביות תאים רציפות יציבות. במהלך המעברים, מופיעים תאים הומוגניים המתחלקים במהירות עם קבוצה הטרופלואידית של כרומוזומים. קווי תאים יציבים יכולים להיות חד-שכבתיים והשעיה. תרביות חד-שכבתיות גדלות בצורה של שכבה רציפה על משטח הזכוכית, תרביות תרחיף גדלות בצורה של תרחיפים בכלים שונים באמצעות מערבלים. יש יותר מ-400 שורות תאים שמקורן ב-40 מיני בעלי חיים שונים (כולל פרימטים, ציפורים, זוחלים, דו-חיים, דגים, חרקים) ובני אדם.

ניתן לטפח חתיכות של איברים ורקמות בודדות (תרביות איברים) במדיה תזונתית מלאכותית. סוגים אלה של תרביות משמרים את מבנה הרקמה, שחשוב במיוחד לבידוד ומעבר של וירוסים שאינם מתרבים בתרביות רקמה לא מובחנות (למשל, נגיפים).

בתרביות תאים נגועים ניתן לזהות וירוסים על ידי שינוי במורפולוגיה של התא, פעולה ציטופטית, שעשויה להיות ספציפית, הופעת תכלילים, על ידי קביעת אנטיגנים ויראליים בתא ובנוזל התרבית; קביעת התכונות הביולוגיות של צאצאים נגיפיים בנוזל תרבית וטיטרציה של וירוסים בתרבית רקמה, עוברי אפרוחים או בעלי חיים רגישים; על ידי זיהוי חומצות גרעין ויראליות בודדות בתאים על ידי הכלאה מולקולרית או אשכולות של חומצות גרעין בשיטה ציטוכימית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

בידוד וירוסים הוא תהליך מייגע וארוך. הוא מתבצע על מנת לקבוע את סוג הנגיף או הווריאציה של הנגיף המסתובב בקרב האוכלוסייה (לדוגמה, לזהות את הסרווריאנט של נגיף השפעת, זן הבר או החיסון של נגיף הפוליו וכו'); במקרים בהם יש צורך בביצוע צעדים אפידמיולוגיים דחופים; כאשר מופיעים סוגים או גרסאות חדשות של וירוסים; במידת הצורך, אשר את האבחנה המוקדמת; לאינדיקציה של וירוסים בחפצים סביבתיים. בעת בידוד וירוסים, נלקחת בחשבון האפשרות של התמדה שלהם בגוף האדם, כמו גם התרחשות של זיהום מעורב שנגרם על ידי שני וירוסים או יותר. אוכלוסייה הומוגנית מבחינה גנטית של וירוס המתקבלת מנגיף בודד נקראת שיבוט ויראלי, ותהליך השגתו נקרא שיבוט.

כדי לבודד וירוסים, זיהום של חיות מעבדה רגישות, עוברי עוף משמש, אך לרוב נעשה שימוש בתרבית רקמה. נוכחות נגיף נקבעת בדרך כלל על ידי ניוון תאים ספציפי (אפקט ציטופטי), היווצרות סימפלסטים וסינסיטיות, זיהוי תכלילים תוך תאיים, וכן אנטיגן ספציפי שזוהה באמצעות אימונופלואורסצנטי, ספיחה המד, המאגלוטינציה (בנגיפים הממגלוטינים) וכו' . ניתן לזהות סימנים אלו רק לאחר 2-3 מעברים של הנגיף.

לבידוד של מספר וירוסים, כמו נגיפי שפעת, משתמשים בעוברי תרנגולת, לבידוד של כמה מנגיפי קוקסאקי ומספר נגיפים ארבו משתמשים בעכברים שזה עתה נולדו. זיהוי וירוסים מבודדים מתבצע באמצעות בדיקות סרולוגיות ושיטות אחרות.

כאשר עובדים עם וירוסים, הטיטר שלהם נקבע. טיטרציה של וירוסים מתבצעת בדרך כלל בתרבית רקמה, תוך קביעת הדילול הגבוה ביותר של הנוזל המכיל את הנגיף, שבו מתרחשת ניוון רקמות, נוצרים תכלילים ואנטיגנים ספציפיים לווירוס. ניתן להשתמש בשיטת הפלאק לטיטרציה של מספר וירוסים. פלאקים, או מושבות שליליות של וירוסים, הם מוקדים של תאים שהושמדו וירוסים של תרבית רקמה חד-שכבתית תחת ציפוי אגר. ספירת מושבות מאפשרת ניתוח כמותי של הפעילות המדבקת של וירוסים על בסיס שחלקיק וירוס מדבק אחד יוצר רובד אחד. לוחות מזוהים על ידי צביעה של התרבית עם צבעים חיוניים, בדרך כלל אדום ניטרלי; הפלאקים אינם סופחים את הצבע ולכן נראים ככתמים בהירים על רקע תאים חיים מוכתמים. הטיטר של הנגיף מבוטא כמספר היחידות היוצרות פלאק ב-1 ml.

טיהור וריכוז של וירוסים מתבצע בדרך כלל על ידי אולטרה צנטריפוגה דיפרנציאלית ולאחריה צנטריפוגה בדרגות ריכוז או צפיפות. כדי לטהר וירוסים, נעשה שימוש בשיטות אימונולוגיות, כרומטוגרפיה של חילופי יונים, אימונוסורבנטים וכו'.

אבחון מעבדה של זיהומים ויראליים כולל איתור הפתוגן או מרכיביו בחומר קליני; בידוד וירוסים מחומר זה; serodiagnosis. בחירת שיטת האבחון המעבדתית בכל מקרה לגופו תלויה באופי המחלה, בתקופת המחלה וביכולות המעבדה. האבחון המודרני של זיהומים ויראליים מבוסס על שיטות אקספרס המאפשרות קבלת תגובה מספר שעות לאחר נטילת חומר קליני בשלבים המוקדמים לאחר המחלה, הכוללות מיקרוסקופ אלקטרונים ואלקטרונים חיסוניים וכן אימונופלואורסצנטי, שיטת הכלאה מולקולרית, איתור נוגדנים מקבוצת lgM וכו'.

מיקרוסקופ אלקטרוני של וירוסים מוכתמים שלילי מאפשרת בידול של וירוסים וקביעת ריכוזם. השימוש במיקרוסקופ אלקטרוני באבחון זיהומים ויראליים מוגבל לאותם מקרים שבהם ריכוז החלקיקים הנגיפיים בחומר הקליני גבוה מספיק (10 5 ב-1 mlוגבוה יותר). החיסרון של השיטה הוא חוסר היכולת להבחין בין וירוסים השייכים לאותה קבוצה טקסונומית. חיסרון זה מתבטל על ידי שימוש במיקרוסקופיה אלקטרונית חיסונית. השיטה מבוססת על יצירת קומפלקסים חיסוניים כאשר מוסיפים סרום ספציפי לחלקיקים ויראליים, תוך כדי ריכוז בו-זמנית של חלקיקים ויראליים המאפשר לזהות אותם. השיטה משמשת גם לאיתור נוגדנים. לצורך אבחון אקספרס, מתבצעת בדיקה אלקטרונית מיקרוסקופית של תמציות רקמות, צואה, נוזל שלפוחית ​​וסודות מהאף. מיקרוסקופ אלקטרוני נמצא בשימוש נרחב כדי לחקור את המורפוגנזה של הנגיף; היכולות שלו מורחבות עם השימוש בנוגדנים מסומנים.

שיטת ההכלאה המולקולרית, המבוססת על זיהוי חומצות גרעין ספציפיות לווירוס, מאפשרת לזהות עותקים בודדים של גנים ואין לה אח ורע מבחינת הרגישות. התגובה מבוססת על הכלאה של גדילים משלימים של DNA או RNA (בדיקות) ויצירת מבנים דו-גדיליים. הבדיקה הזולה ביותר היא DNA רקומביננטי משובט. הבדיקה מסומנת במבשרים רדיואקטיביים (בדרך כלל זרחן רדיואקטיבי). השימוש בתגובות קולורימטריות מבטיח. ישנן מספר וריאנטים של הכלאה מולקולרית: הכלאה נקודתית, הכלאה כתם, הכלאה של סנדוויץ', הכלאה באתרו וכו'.

נוגדנים מקבוצת lgM מופיעים מוקדם יותר מנוגדנים מסוג G (ביום ה-3-5 למחלה) ונעלמים לאחר מספר שבועות, כך שזיהוים מצביע על זיהום לאחרונה. נוגדנים מקבוצת IgM מתגלים על ידי אימונופלואורסצנטי או בדיקת אנזים אימונו באמצעות אנטי-μ אנטיסרה (סרת שרשרת כבדה נגד IgM).

שיטות סרולוגיות בווירולוגיה מבוססות על תגובות אימונולוגיות קלאסיות (ראה שיטות מחקר אימונולוגיות) : תגובות קיבוע משלים, עיכוב hemagglutination, נטרול ביולוגי, immunodiffusion, hemagglutination עקיף, המוליזה רדיאלית, immunofluorescence, immunoassay אנזים, radioimmunoassay. פותחו מיקרו-שיטות לתגובות רבות, והטכניקות שלהן משתפרות ללא הרף. שיטות אלו משמשות לזיהוי וירוסים באמצעות קבוצה של סרומים ידועים ועבור סרודאיגנוזיס על מנת לקבוע את העלייה בנוגדנים בסרום השני בהשוואה לראשון (הנסיוב הראשון נלקח בימים הראשונים לאחר המחלה, השני - לאחר 2-3 שבועות). ערך אבחון אינו פחות מעלייה של פי ארבע בנוגדנים בסרום השני. אם גילוי נוגדנים מקבוצת lgM מעיד על זיהום לאחרונה, אזי הנוגדנים מקבוצת lgC נמשכים מספר שנים, ולעיתים לכל החיים.

כדי לזהות אנטיגנים בודדים של וירוסים ונוגדנים אליהם בתערובות מורכבות ללא טיהור חלבון קודם, משתמשים באימונובלוטינג. השיטה משלבת חלוקת חלבונים באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד עם בדיקת אימונו של חלבונים לאחר מכן על ידי בדיקת אנזים אימונו. הפרדת החלבונים מפחיתה את הדרישות לטוהר הכימי של האנטיגן ומאפשרת לזהות זוגות אנטיגן-נוגדנים בודדים. משימה זו רלוונטית, למשל, ב-serodiagnosis של זיהום ב-HIV, כאשר תגובות חיוביות כוזבות של אנזים חיסוני נובעות מנוכחות של נוגדנים לאנטיגנים של תאים, הקיימים כתוצאה מטיהור לא מספק של חלבונים ויראליים. זיהוי נוגדנים בסרה של חולים לאנטיגנים ויראליים פנימיים וחיצוניים מאפשר לקבוע את שלב המחלה, ובניתוח אוכלוסיות - השונות של חלבונים ויראליים. אימונובלוטינג בזיהום ב-HIV משמש כבדיקת אישור לאיתור אנטיגנים ויראליים בודדים ונוגדנים אליהם. בעת ניתוח אוכלוסיות, השיטה משמשת לקביעת השונות של חלבונים ויראליים. הערך הרב של השיטה טמון באפשרות לנתח אנטיגנים המסונתזים בטכנולוגיית DNA רקומביננטי, ביסוס גודלם ונוכחותם של דטרמיננטים אנטיגנים.

בִּיבּלִיוֹגְרָפִיָה:בוקרינסקאיה א.ג. Virology, M., 1986; וירולוגיה, שיטות, עורך. ב' מיכי, טרנס. מאנגלית, מ', 1988; מדריך לשיטות מחקר מיקרוביולוגיות וויירולוגיות, עורך. M.O. בירגר, מ', 1982.

• - שיטות לנטרול פסולת המכילה חומרים אורגניים, המבוססת על חימום שלהם כתוצאה מפעילות חיונית של מיקרואורגניזמים אירוביים תרמופיליים ...

  אנציקלופדיה רפואית

• - שיטות היסטוכימיות לזיהוי אנזימים, המבוססות על התגובה של היווצרות משקעי סידן או מגנזיום פוספט בלוקליזציה של פעילות אנזימטית במהלך דגירה של קטעי רקמה עם ...

  אנציקלופדיה רפואית

• - שיטות לגילוי היסטיוציטים בתכשירים של רקמת עצב ואיברים שונים באמצעות אמוניה כסף או תמיסות פירידין-סודה של כסף ...

  אנציקלופדיה רפואית

• - שיטות להערכת הנחות לגבי אופי הירושה, בהתבסס על השוואת היחסים הנצפים והצפויים של אנשים חולים ובריאים במשפחות עמוסות מחלות תורשתיות, תוך התחשבות בשיטה ...

  אנציקלופדיה רפואית

• - משמשים לחקר המבנה והתפקוד של תאים ורקמות של בני אדם, בעלי חיים וצמחים בתנאים נורמליים, פתולוגיים וניסויים...

  אנציקלופדיה רפואית

• - שיטות לזיהוי כימיקלים בחתכים היסטולוגיים. חלק בלתי נפרד מ-G.m. הן שיטות ציטוכימיות שמזהות כימיקלים בתאים של מריחות והדפסים מוכנים ...

  אנציקלופדיה רפואית

• - שיטות לקביעה כמותית ואיכותית של גלוקוז בדם ובשתן, המבוססות על חמצון של גלוקוז עם חמצן אטמוספרי בנוכחות האנזים גלוקוז אוקסידאז ...

  אנציקלופדיה רפואית

• - שיטות מחקר אבחנתיות המבוססות על אינטראקציה ספציפית של אנטיגנים ונוגדנים ...

  אנציקלופדיה רפואית

• - שיטות לזיהוי מבנים סיביים של רקמת חיבור ונוירוגליה בתכשירים היסטולוגיים, על בסיס צביעה רב-צבעונית שלהם...

  אנציקלופדיה רפואית

• - 1) שיטת צביעה של תכשירים היסטולוגיים של הדרמיס באמצעות המלון של מאייר, תמיסה של אלום אשלגן ורודמין; גרעיני תאים מכתימים כחול, אלידין מכתים אדום...

  אנציקלופדיה רפואית

• - ברפואה - סט של שיטות למחקר וניתוח כמותי של מצב והתנהגותם של חפצים ומערכות הקשורות לרפואה ושירותי בריאות ...

  אנציקלופדיה רפואית

• - דרכים לחקור אובייקטים שונים באמצעות מיקרוסקופ ...

  אנציקלופדיה רפואית

• - מבוסס על השימוש בחוקי האופטיקה המתייחסים לאופי, התפשטות ואינטראקציה עם החומר של קרינה אלקטרומגנטית בטווח האופטי ...

  אנציקלופדיה רפואית

• - שיטות מחקר והערכה של איכות חפצי הסביבה בעזרת איברי חישה ...

  אנציקלופדיה רפואית

• - השם הכללי של מספר שיטות להספגת תכשירים היסטולוגיים בכסף לזיהוי גלייה וסיבים ארגירופילים אחרים ...

  אנציקלופדיה רפואית

• - ממונים על ידי החוקר ובית המשפט לפתרון סוגיות מיוחדות המתעוררות בחקירת עבירות ובחינת תיקים אזרחיים. הם מוחזקים גם לפי הצעת זיהוי פלילי...

  אנציקלופדיה רפואית

"שיטות מחקר וירולוגיות" בספרים

Rage Against The Machine Killing In The Name (1992)

הסופר צלר איגור

Rage Against The Machine Killing In The Name (1992) האלבום הראשון של Rage Against The Machine מלוס אנג'לס שילב היפ-הופ והארד רוק, שפריץ עליהם מניפסטים פוליטיים אקטואליים, ולמרבה הצער, מנה ניכרת של קצב פאנק צפוף. בשיר "להרוג בשם", שנכלל בסינגל הראשון,

ג'יימס בראון קום (I Feel Like Being A) מכונת סקס (1970)

מתוך הספר מוזיקה פופולרית של המאה ה-20: ג'אז, בלוז, רוק, פופ, קאנטרי, פולק, אלקטרוני, נשמה הסופר צלר איגור

James Brown Get Up (I Feel Like Being A) Sex Machine (1970) לקראת סוף שנות ה-60, ג'יימס בראון החל להתנסות. נשמה קורעת לב מ-The Famous Flames פינתה את מקומה לפאנק רוחש מה-J.B. אחת מאבני הדרך החשובות ביותר של עידן ה-Fאנק הממשמש ובא הייתה "Sex Machine", שבגרסה של עשר דקות

זעם כנגד המכונה

מתוך הספר נגד הבלתי אפשרי (אוסף מאמרים על תרבות) מְחַבֵּר קולטשוב וסילי ג'ורג'יביץ'

Rage Against The Machine טום מורלו: "המטרה שלנו היא לעזור לאנשים להשתחרר משלשלאות השקרים והאלימות שסבכו אותם עם ממשלות, תאגידים בינלאומיים, תקשורת ומפלגות פוליטיות, כדי לתת לאנשים ברחבי העולם תחושת אמון ב מחר ו

ברוך הבא למכונה

מתוך הספר זמן פעמון הסופר סמירנוב איליה

ברוכים הבאים למכונה אנו יכולים לתארך את תחילת הפרסטרויקה בהיסטוריה שלנו לינואר 1987. אז התקיימה המליאה הליברלית של הוועד המרכזי, וקיבלנו את ההזדמנות לפרסם ביונוסט רשימה לא ערוכה של "כוכבים" מודרניים של הרוק הסובייטי, כולל DDT, CLOUD EDGE ו

Toyoda Machine Works

מתוך הספר Gemba kaizen. הדרך להוזלת עלויות ושיפור איכות מאת אימאי מסאקי

Toyoda Machine Works לדברי יושיו שימה, מנהל Toyoda Machine Works, היתרונות של הקמת מערכת איכות ותקנים לאבטחת איכות התגלו בשנות ה-80, כאשר החברה הציגה את המושג "ניהול כולל המבוסס על איכות"

מְכוֹנָה

מתוך הספר מילון פילוסופי מְחַבֵּר הרוזן ספונוויל אנדרה

מכונה (מכונה) "אם המעבורות היו ארוגות את עצמן", העיר פעם אריסטו, "אומנים לא יזדקקו לפועלים, ואדונים לא יצטרכו עבדים" ("פוליטיקה", א', 4). זה בערך מה שאנו מכנים מכונה - אובייקט המסוגל לנוע, נטול נשמה (אוטומט) ו

מתוך הספר Internet Intelligence [מדריך פעולה] מְחַבֵּר יושצ'וק יבגני ליאונידוביץ'

ארכיון אתרים Internet Archive Wayback Machine כתובת דואר אלקטרוני - http://web.archive.org כל מי שאסף מידע על בעיה שמעניינת אותו במשך תקופה מספיק ארוכה יודע כמה חשוב לפעמים למצוא מידע שפורסם ב האתר לפני מספר שנים. לפעמים זה סתם

מכונת Wayback של ארכיון האינטרנט

מתוך הספר Countering Black PR באינטרנט מְחַבֵּר קוזין אלכסנדר ולדימירוביץ'

ארכיון אתרים Internet Archive Wayback Machine לעתים קרובות מאוד ההתקפה של אנשי יחסי ציבור שחורים מגיעה באופן בלתי צפוי עבורך. במקרה זה, בפעם הראשונה, אתה מתמודד עם הצורך ללמוד מקרוב את האויב. אם בכלל הנחת התפתחות כזו של אירועים (לדוגמה, ב

4.9. גיבוי עם Time Machine

הסופרת סקרילינה סופיה

4.9. גיבוי עם Time Machine Mac OS X Leopard מאפשר לך לגבות באופן קבוע את המחשב שלך באמצעות יישום Time Machine. לאחר ההגדרות המתאימות, האפליקציה תתבצע אוטומטית

4.9.2. צור את הגיבוי הראשון שלך עם Time Machine

מתוך הספר Macintosh Tutorial הסופרת סקרילינה סופיה

4.9.2. יצירת הגיבוי הראשון שלך באמצעות Time Machine לפני שתתחיל ליצור את הגיבוי הראשון שלך, עליך להכניס כונן חיצוני או להקצות מחיצת כונן קשיח בחינם לגיבוי בלבד.

4.9.4. שימוש במכונת זמן

מתוך הספר Macintosh Tutorial הסופרת סקרילינה סופיה

4.9.4. שימוש ב-Time Machine לאחר שביצעת את הגדרות Time Machine הנחוצות ויצרת מספר גיבויים, תוכל להתחיל לחפש ולשחזר גרסאות קודמות של הקבצים שלך. לשם כך: 1. פתח חלון Finder ובחר את הקובץ שאתה צריך לשחזר.2. אם

נגיפים, בניגוד לחיידקים, מתרבים רק בתאים חיים. בהקשר זה, גידול נגיפים יכול להתבצע ברמת הגוף של חיית ניסוי (עובר עוף כאורגניזם מתפתח מכונה חיות ניסוי) או תא חי הגדל מחוץ לגוף, כלומר. ברמת תרבית תאים.

שימוש בחיות מעבדה. אחת השיטות לבידוד וטיפוח וירוסים היא הדבקה של חיות מעבדה. הם משמשים לבידוד וירוסים שאינם גורמים להתפתחות של שינויים ציטופתיים בתרביות תאים ואינם מתרבים בעוברי תרנגולת. השימוש בחיות מעבדה מאפשר גם לזהות את אופי הזיהום הנגיפי לפי תסביך הסימפטומים הקליניים. עכברים לבנים, אוגרים, שפני ניסיונות וארנבות משמשים לרוב כחיות מעבדה, בהתאם למטרת העבודה וסוג הנגיפים הנחקרים. מבין החיות הגדולות יותר משתמשים בקופים ממינים שונים ובכמה חיות אחרות. מציפורים להשתמש תרנגולות, אווזים, ברווזים. בשנים האחרונות, בעלי חיים שזה עתה נולדו (רגישים יותר לווירוסים), "בעלי חיים סטריליים" (שחולצו מהרחם והוחזקו בתנאים סטריליים באמצעות אוויר סטרילי ומזון מעוקר) ובעלי חיים בעלי קווים טהורים עם תורשה ידועה (בעלי חיים מגזעים או קוויים). בשימוש לעתים קרובות יותר.

רק בעלי חיים בריאים נלקחים לניסוי, רצוי ממשתלה אחת ומאצווה אחת. טמפרטורת הגוף נמדדת במקביל, שכן יש בו תנודות יומיות. חומר הבדיקה מנוהל תוך התחשבות בטרופיזם של וירוסים לרקמות מסוימות. אז, לבידוד של וירוסים נויטטרוטרופיים, החומר מוזרק למוח, לבידוד של וירוסים פנאומוטרופיים - דרך האף (תחת הרדמת אתר קלה).

בחיות מעבדה, לאחר הדבקה בחומר המכיל וירוסים, חשוב לקחת חומר להמשך מחקר בזמן ונכון, ובאופן אספטי. תוצאות בידוד נגיפים נחשבות חיוביות אם החיה מפתחת תסמינים של זיהום לאחר תקופת דגירה מתאימה.

שימוש בעוברי אפרוחים. ברקמות העובר, הממברנות שלו, שק החלמון, נגיפים פתוגניים רבים של בני אדם ובעלי חיים מסוגלים להתרבות. במקרה זה יש חשיבות לסלקטיביות של וירוסים לרקמה מסוימת: נגיפי אבעבועות שחורות מתרבים היטב ומצטברים בתאי הקרום הכוריון-אלנטואי, נגיף החזרת במי השפיר, נגיפי השפעת במי השפיר ובאלנטואיס, ונגיף הכלבת. בשק החלמון.

לגידול של וירוסים בעוברים מתפתחים יש מספר יתרונות על פני שיטות אחרות: קליפה צפופה מגינה בצורה אמינה למדי על התוכן הפנימי מפני חיידקים; כאשר מדביקים עוברי עוף, מתקבלת תשואה גדולה יותר של חומר המכיל וירוסים מאשר בשיטות גידול אחרות; שיטת ההדבקה של עוברי עוף פשוטה ונגישה לכל מעבדה וירולוגית; לעוברים יש מספיק כדאיות ועמידות בפני פתוגנים של גורמים חיצוניים. עם זאת, עוברי עוף אינם תמיד נקיים מזיהומים נגיפיים וחיידקיים סמויים. קשה לראות את הדינמיקה של שינויים פתולוגיים המתרחשים בעובר לאחר הדבקה בנגיף. ניתוח שלאחר המוות של עוברים נגועים מגלה לעיתים קרובות לא שינויים נראים לעין ומזהה את הנגיף באמצעות בדיקת המגלוטינציה ושיטות אחרות. בעוברים נגועים, אי אפשר לעקוב אחר העלייה בטיטר הנוגדנים. השיטה אינה מתאימה לכל הוירוסים.

למחקרים וירולוגיים משתמשים בעוברים בני 7-12 ימים, המתקבלים מחוות עופות. ניתן לגדל עוברים בתרמוסטט קונבנציונלי, שבתחתיתו ממוקמים מגשים עם מים כדי להרטיב את האוויר. הטמפרטורה בתרמוסטט צריכה להיות 37 מעלות צלזיוס, והלחות צריכה להיות 60-65%. בחר ביצים מופרות גדולות, נקיות (אך לא שטופות), מתרנגולות לבנות, המאוחסנות לא יותר מ-10 ימים בטמפרטורה של 5-10 מעלות צלזיוס. ביציות מופרות מזוהות על ידי נוכחות של דיסק נבט, שכאשר הוא שקוף עם אובוסקופ, נראה כמו כתם כהה.

בעבודה עם וירוסים ניתן להשתמש בשיטות שונות של הדבקת עוברים, אך היישום המעשי ביותר הוא יישום הנגיף על הקרום הכוריון-אלנטואי, החדרה לחלל האלנטואי, לשק השפיר ולשק החלמון.

(איור 10.5). בחירת השיטה תלויה בתכונות הביולוגיות של הנגיף הנחקר.

אורז. 10.5.

לפני ההדבקה, הכדאיות של העובר נקבעת על אובוסקופ. עוברים חיים הם ניידים, הפעימה של כלי הממברנות נראית בבירור. בעת ההדלקה יש לסמן בעיפרון פשוט על הקליפה את גבולות שק האוויר או את מיקומו של העובר, שנקבע לפי הצל שלו על הקליפה.

עוברי עוף נדבקים בקופסה בתנאים אספטיים לחלוטין באמצעות מכשירים מעוקרים בהרתחה.

כאשר נדבקים על הממברנה הכוריונית-אלנטואית, עוברים בני 12 ימים מתאימים ביותר. להדבקה בחלל האלנטואי משתמשים בעוברים בני 10-11 ימים, בחלל השפיר - עוברים בני 7-11 ימים, בשק חלמון - עוברים בני 7 ימים.

ביצים עם עוברים נגועים מונחות על דוכנים כשהקצה הקהה כלפי מעלה. משטר הטמפרטורה ותקופת הדגירה תלויים בתכונות הביולוגיות של הנגיף המחוסן. כדאיות העוברים מנוטרת מדי יום מתחת לאובוסקופ. עוברים שמתו ביום הראשון לאחר ההדבקה עקב פציעה אינם נבדקים.

לפני איסוף החומר, עוברים מקוררים ב-4 מעלות צלזיוס למשך 18-20 שעות כדי לכווץ את הכלים ולמנוע דימום בנתיחה. עוברים נפתחים בקופסה בהתאם לכללי האספסיס.

הנוזל האלנטואי נשאב בעזרת פיפטה, הסטריליות נשלטת על ידי חיסון בסוכר או במרק בשר-פפטון, בודקים את נוכחות הנגיף בתגובת ההמגלוטינציה ומאוחסנים ב-4 מעלות צלזיוס במצב קפוא.

כדי להשיג מי שפיר, שואבים תחילה את מי השפיר, לאחר מכן נלכדים את קרום השפיר בפינצטה, מרימים מעט את מי השפיר נשאבים בעזרת פיפטת פסטר.

כאשר בוחנים שינויים בקרום הכוריון-אלנטואי, חותכים אותו במספריים וכל התוכן נשפך דרך החור לתוך צלחת פטרי. הממברנה הכוריונית-אלנטואית נשארת בתוך הקליפה ומוסרת בפינצטה לתוך צלחת פטרי עם מלוחים. כאן הוא נשטף, מיישר את אופי הנגעים המוקדיים על רקע כהה.

כדי להשיג את קרום השפיר, חותכים את שק השפיר שבו העובר סגור ומשחררים אותו מהעובר, צופים בנגעים.

כדי להשיג את קרום החלמון, חותכים את הצ'וריון-אלנטואה, שואבים את מי השפיר והאלנטואיס, מוציאים את העובר בפינצטה, מופרדים בחבל הטבור, לכוד את שק החלמון ומניחים בצלחת פטרי. בקרה על סטריליות, מבט לנוכחות נגעים. את החלמון, במידת הצורך, ניתן להוציא בעזרת מזרק מבלי להוציא את שק החלמון.

נוכחות הנגיף במי האלנטואי והשפיר של העובר הנגוע נקבעת בבדיקת ההמגלוטינציה. נוזלים מעוברים חיוביים להמגלוטינציה לאחר בדיקת סטריליות נאספים ומטטרלים בבדיקת המגלוטינציה מורחבת.

בנוכחות כמות קטנה של וירוס או חוסר האפשרות לזהות אותו בחומר הבדיקה, מתבצעים מעברים רצופים על עוברי עוף. אם לאחר שלושה מעברים עוקבים על עוברים, הנגיף לא מתגלה בחומר הבדיקה, התוצאה נחשבת שלילית.

שימוש בתרביות תאים. טיפוח תאים מחוץ לגוף מצריך מילוי של מספר תנאים. אחד מהם הוא הקפדה על סטריליות במהלך העבודה, שכן אמצעי ההזנה המשמשים הם מצע תזונתי מצוין גם עבור חיידקים ופטריות. תאי רקמה רגישים מאוד למלחים של מתכות כבדות. לפיכך, יש לייחס חשיבות יוצאת דופן לאיכות המרכיבים השונים המרכיבים תמיסות מלח ואמצעי הזנה, כמו גם לשיטות העיבוד של הכלים ופקקי הגומי המשמשים בתרבית תאים.

אחד התנאים המוקדמים לעבודה מוצלחת עם תאים הוא האיכות הגבוהה של מים מזוקקים (נבדקים פעמיים בשבוע). כדי לעבוד עם תאים, נעשה שימוש במים מזוקקים או דה-יונים. המזקקים הטובים ביותר הם מכשירים העשויים מזכוכית או פלדה מסגסוגת: יוני מתכת כבדים, רעילים לתאים, אינם נשטפים מציוד כזה. מים דה-יונים מתקבלים במתקנים מיוחדים, שבהם המים מטוהרים ממלחים במהלך מעברם הרצוף דרך עמודים עם מחליף אניונים ומחליף קטונים.

כאשר מטפחים תאים מונחות דרישות גבוהות במיוחד להכנה ועיקור של כלים ופקקים. במקרים רבים, שטיפה וסטריליזציה לא נכונה שלהם היא שגורמת לתאים לא להיצמד לזכוכית או לניוון מהיר של השכבה החד-שכבתית של התא.

לצמיחה ורבייה של תאים מחוץ לגוף, נדרשת קבוצה מורכבת של גורמים פיזיקוכימיים: טמפרטורה מסוימת, ריכוז יוני מימן, תרכובות אנאורגניות, פחמימות, חומצות אמינו, חלבונים, ויטמינים, חמצן ופחמן דו חמצני, ולכן, עבור גידול של וירוסים בתרביות תאים, משתמשים במדיה תזונתית בהרכב מורכב. . על פי אופי הרכיבים המרכיבים את הרכבם, מדיה אלו מחולקות לשתי קבוצות.

• 1. מדיה, שהם תערובות של תמיסות מלח (האנקס, ארל וכו') ורכיבים טבעיים (סרום דם מהחי והאדם, הידרוליזט של אלבומין). הכמות של כל אחד מהרכיבים הללו בניסוחים שונים של מדיה שונה.
• 2. מדיה סינטטית וחצי סינתטית המורכבת מתמיסות מלח (ארל, הנקס וכו') בתוספת חומצות אמינו, ויטמינים, קו-אנזימים ונוקלאוטידים (Eagle media, 199 וכו'). במדיה סינתטית, תאים יכולים להתקיים במצב קיימא לזמן קצר (עד 7 ימים). כדי לשמור אותם במצב קיימא לאורך זמן, כמו גם ליצור תנאים טובים יותר לגדילה ורבייה של תאים, מתווסף סרום דם של בעלי חיים (פרות, עגלים וכו') למדיה הסינטטית.

ניתן להשתמש בשיטות שונות של תרבית תאים מחוץ לגוף כדי לבודד וירוסים. עם זאת, נכון לעכשיו, תרביות חד-שכבתיות של קווי תאים ראשוניים שעברו טריפסין ומושתלים קיבלו את היישום המעשי הגדול ביותר. תרביות תאים חד-שכבתיות גדלות בכלי זכוכית בעלי דופן שטוחה- מזרנים בנפח של 1 ליטר, 250 ו-100 מ"ל או במבחנות בקטריולוגיות קונבנציונליות המטופלות בצורה מתאימה.

כאשר משתמשים בתרביות תאים טריפסיניות ראשוניות, המהות של השיטה נעוצה בהרס של קשרים בין-תאיים ברקמות על ידי אנזימים פרוטאוליטיים והפרדה של תאים לגידול חד-שכבה על פני הזכוכית. רקמות ואיברים של עוברי אדם ובעלי חיים, חיות שחוטות ועופות, כמו גם אלו המופקים מבני אדם במהלך ניתוח יכולים לשמש מקור להשגת תאים. השתמש ברקמות מנוונות רגילות וממאירות, אפיתל, סוג פיברובלסטי ומעורב. היכולת להתרבות תאים המופקים מהגוף קשורה קשר הדוק למידת ההתמיינות של הרקמות. ככל שהרקמה מובחנת פחות, כך יכולת התאים שלה להתרבות במבחנה חזקה יותר. לכן, תאים של רקמות עובריות וגידולים הרבה יותר קל להתרבות מחוץ לגוף מאשר תאים רגילים של בעלי חיים בוגרים.

תרבויות יומיות נראות תחת מיקרוסקופ בהגדלה נמוכה כדי לקבוע את אופי הצמיחה שלהן. אם התאים אינם מתרבים, נראים עגולים, מגורענים, כהים ומתקלפים מהזכוכית, כלי הזכוכית מעובדים בצורה גרועה או שהמרכיבים במצע התרבות רעילים.

יחד עם רקמות ראשוניות שעברו טריפסין, תרביות תאים מושתלות נמצאות בשימוש נרחב לגידול וירוסים; תרביות תאים המסוגלות להתרבות מחוץ לגוף ללא הגבלת זמן. לרוב נעשה שימוש בתרביות תאים שמקורן ברקמות אנושיות רגילות וסרטניות. שורת תאי HeLa המתקבלת מגידול צוואר הרחם, Hep-2 מקרצינומה של הגרון, KV מרקמת סרטן חלל הפה הפכה ידועה. תרביות תאים כאלה מוכנות גם מרקמות נורמליות של בעלי חיים - כליות של קוף, ארנב ועובר חזיר (טבלה 10.1).

לזריעה חוזרת של תאים מושתלים, המדיום התזונתי נשאב בעזרת פיפטה ושופך החוצה. שכבת התאים הדקה שנוצרת נהרסת עם תמיסת טריפסין, והתאים המשתחררים בדרך זו מועברים לכלי חדש עם תמיסת תזונה טרייה, שם שוב נוצרת חד-שכבה של תאים.

אינדיקטור לנוכחות הנגיף בתרביות תאים נגועים יכול להיות:

• א) התפתחות של ניוון תאים ספציפי;
• ב) זיהוי של תכלילים תוך תאיים;
• ג) זיהוי של אנטיגן ספציפי על ידי אימונופלואורסצנטי;
• ד) תגובה חיובית לספיחה של המד;
• ה) תגובה חיובית להמגלוטינציה;
• ה) היווצרות של פלאקים.

טבלה 10.1

רשימה של תרביות התאים הנפוצות ביותר

כדי לזהות ניוון ספציפי בתרביות נגועות, תאים נבדקים מדי יום במיקרוסקופ בהגדלה נמוכה. וירוסים רבים, כאשר מתרבים בתאים, גורמים לניוון שלהם, כלומר. בעלי אפקט ציטופטוגני (CPA) (איור 10.6).

אורז. 10.6.

זמן ההתפתחות ואופי השינויים הציטופטיים בתרביות תאים נגועים נקבעים על פי התכונות והמינון של הנגיף המחוסן, כמו גם התכונות והתנאים של גידול התאים. וירוסים מסוימים גורמים ל-CPP בשבוע הראשון לאחר ההדבקה (אבעבועות, פוליו, קוקסאקי B וכו'), אחרים - לאחר 1-2 שבועות. לאחר זיהום (אדנוווירוסים, נגיפי פארא-אינפלואנזה, ECHO וכו').

נגיפים גורמים לשינויים ציטופתיים משלושה סוגים עיקריים: היווצרות תאי ענק וסימפלסטים מרובי גרעינים, שהם תוצאה של היתוך הציטופלזמה של תאים רבים; ניוון תאים עגול הנובע מאובדן קשרים בין תאיים ועיגול תאים; פיתוח מוקדי התפשטות תאים, המורכבים ממספר שכבות של תאים.

במהלך רבייה של נגיפים מסוימים בתרביות תאים, נוצרים תכלילים תוך-תאיים בציטופלזמה או בגרעין של התאים הפגועים. תרביות תאים לאיתור תכלילים גדלות על צלחות זכוכית במבחנות, נגועות בנגיף, ולאחר תקופות דגירה מסוימות מכינים תכשירים על ידי צביעה בצבעים קונבנציונליים.

כדי לזהות אנטיגן ספציפי בתרביות תאים נגועים, מכינים תכשירים באותו אופן כמו לזיהוי תכלילים באמצעות MFA.

שיטת הפלאק מבוססת על היווצרות במונו-שכבה של תאים נגועים בנגיף מתחת לציפוי אגר של אזורים דהויים המורכבים מתאי מנוונים (מתים). אזורים אלו, הנקראים פלאק, הם מושבות וירוסים, הנוצרות בדרך כלל מחלקיק ויראלי בודד.

בהיעדר שינויים ציטופתיים, תכלילים תוך-תאיים, היווצרות פלאק, תגובות שליליות של ספיחה המד-המגלוטינציה בתרביות תאים הנגועות בחומר הבדיקה, מבוצעים שני מעברים עוקבים. בהיעדר שינויים אלה במעבר הסופי, התוצאה של בידוד הנגיף נחשבת שלילית.

ניתן להשתמש בשיטות הבאות כדי לזהות וירוסים בחומר מדבק.

מִיקרוֹסקוֹפִּי:

• א) וירוסקופיה;
• ב) זיהוי של תכלילים תוך תאיים.

אימונולוגי:

• א) מיקרוסקופ אלקטרונים חיסוני;
• ב) אימונופלואורסצנטי;
• ג) המגלוטינציה;
• ד) ספיגת המד.

זיהוי וירוסים מתבצע באמצעות שיטות אימונולוגיות, כולל התגובות הבאות:

• א) עיכוב ההמגלוטינציה;
• ב) עיכובים בספיגת המד;
• ג) מחייב משלים;
• ד) נטרול;
• ה) משקעים בג'ל אגר.

שיטות מיקרוסקופיות. עם מיקרוסקופ אור, ניתן לזהות רק וירוסים גדולים יותר מ-150 ננומטר. זיהוי וירוסים קטנים יותר אפשרי רק עם מיקרוסקופ אלקטרונים. ניתן להשתמש במיקרוסקופ של אור, ניגודיות פאזה ופלורסנט כדי לזהות וירוסים גדולים.

במהלך זיהומים ויראליים, תכלילים מוזרים מתפתחים בתאים נגועים. זיהומים מסוימים מלווים ביצירת תכלילים בציטופלזמה של התאים הפגועים (כלבת, חיסון נגד אבעבועות שחורות), אחרים - בציטופלזמה ובגרעין (חצבת, אבעבועות רוח טבעיות, מחלות אדנוווירוס). לתכלילים יש אופי, מבנה, צורה וגודל שונים מ-0.25 עד 25 מיקרון. על פי נתונים מודרניים, בזיהומים מסוימים, תכלילים הם האתר של רביית הנגיף ומייצגים את הצטברויותיו מוקפות בחומרים תאים, בעוד שבאחרים, הם תוצר של ניוון תאים.

ניתן לזהות תכלילים בהדפסים מוכתמים של איברים ורקמות, גרידות תאים, חתכים היסטולוגיים מהרקמה הפגועה ותכשירי תרבית תאים נגועים בנגיף. צביעה נעשית לרוב על פי שיטת רומנובסקי-גימסה. לצביעה בשיטה זו, התכשירים מקובעים בתערובת של דובוסקה - ברזיל - בואין, המורכבת מחומצה פיקרית, פורמלין, אלכוהול, חומצה אצטית. התכלילים התוך-תאיים ברוב הזיהומים הנגיפים הם אוקסיפיליים ומכתימים ורוד או לילך לפי שיטת רומנובסקי-גימסה.

שיטות אימונולוגיות לאבחון זיהומים ויראליים. בשנים האחרונות, שיטות אלו הפכו למובילות באבחון מעבדתי של זיהומים ויראליים. זה נובע בעיקר מסיבות כלכליות, שכן שיטות קלאסיות של ניתוח וירולוגי הן די יקרות. בנוסף, משך המחקרים בשיטות וירולוגיות (שבועות), גם אם הן יעילות למדי, הופכים אותם למפרע.

שיטות אימונולוגיות משמשות הן לזיהוי אנטיגנים נגיפיים בביו-סובסטרטים וחפצים סביבתיים שונים, והן לסרודיאגנוזיס - זיהוי נוגדנים לאנטיגנים נגיפיים בדם של אנשים חולים וחיות מעבדה. בנוסף, שיטות מחקר אימונולוגיות הכרחיות לזיהוי ויריון.

תוך אינטראקציה עם הגוף, וירוסים גורמים להיווצרות נוגדנים, אשר, בהיותם נספגים על ויריון, מונעים חדירת וירוסים לתאים והתפתחות של פעולה ציטופטית (CPE); לנטרל את ההשפעה הקטלנית של וירוסים במהלך רבייתם בעוברי תרנגולות ובעלי חיים; להשבית את ההמגלוטינינים וה-neuraminidase של virion, ולמנוע את תגובת ההמגלוטינציה (RGA) ואת תגובת ההמגלוטינציה (RGads) על תאים מושפעי וירוס. נוגדנים מנטרלים וירוסים אלו גורמים גם לאגלוטינציה ולמשקעים של חלקיקים ויראליים, והקומפלקסים החיסונים שנוצרו קושרים משלים. לכן, לצורך זיהוי ויריון, נעשה שימוש בתגובת הנטרול הקלאסית (PH) על תרביות תאים, עוברי עוף ובעלי חיים והשינויים שלה: תגובת עיכוב ההמגלוטינציה (HITA); תגובת עיכוב ספיחה של hemadsorption (RTGads). אותן תגובות משמשות ב-serodiagnosis של זיהומים ויראליים כדי לזהות נוגדנים מנטרלים וירוסים בסרום של חולים על פי אנטיגן ויראלי ידוע (diagnosticum).

שיטת מיקרוסקופיה אימונואלקטרון (IEM). מיקרוסקופיה אלקטרונית ממלאת כיום תפקיד חשוב בחקר הווירוסים. הנתונים של מיקרוסקופ אלקטרונים הם המשמשים כבסיס לסיווג המודרני של וירוסים.

שלב חדש בפיתוח מחקר מיקרוסקופי אלקטרוני של וירוסים הוא השימוש בטכניקות מיקרוסקופיה אימונואלקטרון. בשיטה זו התאפשר לא רק גילוי ישיר של וירוסים, אלא גם זיהוי שלהם, כמו גם סרוטיפינג מהיר של זנים ויראליים וטיטרציה של נוגדנים אליהם. IEM רכשה חשיבות רבה לקביעת לוקליזציה של אנטיגנים ויראליים בתוך תאי המקרואורגניזם.

היתרון הבלתי מעורער של IEM הוא הרגישות הגבוהה שלו בהשוואה לשיטות קונבנציונליות של מיקרוסקופ אלקטרונים.

כאשר אנטיגן וירוס או רכיב ויראלי בא במגע עם אנטי-סרום הומולוגי, נוצר קומפלקס נוגדן-אנטיגן. תופעה זו היא הבסיס לטכניקה המשמשת לאיתור וזיהוי אנטיגנים נגיפיים או נוגדנים אליהם. אלה קומפלקסים של אנטיגנים עם נוגדנים לאחר צביעה שלילית שניתן לראות במיקרוסקופ אלקטרונים. באבחון קליני, חומר אנטיגני אינו דורש טיהור יסודי. לכן, אם מתגלה נגיף שפעת, ניתן לבדוק את הנוזל האלנטואי הלא מטוהר. נכון לעכשיו, מאמינים שכמעט כל סוג של חומר קליני מתאים ל- IEM. למטרות אבחון, ניתן להשתמש בסמים רגילים לא מפורקים, כמו גם בסמים של הבראה. יש לציין כי ליחס בין כמויות האנטיגן והנוגדנים יש השפעה רבה על התוצאות הסופיות. עם עודף של אנטיגן, שפע של חלקיקים הוא ציין; צבירות במקרה זה יהיו מעטות. עם עודף של נוגדנים, החלקיקים הנגיפים מוקפים בשכבה העבה שלהם, כמעט בלתי אפשרי לחשוף את הפרטים המבניים הקטנים של הנגיף; גם האגרגטים מעטים. עם היחס האופטימלי של אנטיגן ונוגדנים, האגרגטים מוגדלים עם תמונה טובה של הפרטים של הווירונים. מהשיקולים לעיל, רצוי להשתמש בסרום חיסון במספר דילולים.

סרט תמיכה עשוי פלדיום מוחל על רשת התמיכה. כאשר משתמשים בריכוזים נמוכים של פלדיום וכדי לשפר את תכונות הספיחה של המצע, הוא מחוזק בפחמן. לשם כך, מרוסס פחם על מצע הסרט היבש המוגמר על גבי רשת מיקרוסקופית אלקטרונית בוואקום. לעובי מצע הסרט ושכבת הפחמן המחזקת יש השפעה משמעותית על הניגודיות והתמונה של פרטים עדינים של האובייקט. כל חוקר קובע את העובי הספציפי של סרטי המצע ושכבת הפחמן בנפרד, בהתבסס על העובדה שפחמן שקוף יותר מבחינה אלקטרונית מפלדיום.

לנגיפים ולנוגדנים אליהם יש צפיפות אלקטרונים נמוכה. לכן, לא ניתן לזהות עצמים ביולוגיים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים ללא טיפול מקדים. וירוסים מוצגים באמצעות טכניקת ניגוד שלילי (או כתם שלילי). מלחים שונים של מתכות כבדות משמשים לצביעה שלילית של וירוסים ומתחמי נוגדנים וירוסים. חומרים מנוגדים (אטומי מתכת כבדה) חודרים לאזורים ההידרופיליים של עצמים ומחליפים בהם מים. כתוצאה מכך, צפיפות האלקטרונים של העצם עולה, ומתאפשר לצפות בו במיקרוסקופ אלקטרונים.

שיטת IEM הישירה מצאה את היישום הגדול ביותר בפועל. תרחיף הנגיף מעורבב עם אנטי-סרום לא מדולל. לאחר ערבוב נמרץ, התערובת מודגרת למשך שעה בשעה

37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לילה ב-4 מעלות צלזיוס. למחרת, התערובת עוברת צנטריפוגה כדי לזרז את הקומפלקסים החיסונים. המשקע מושהה מחדש בטיפת מים מזוקקים ונתון לניגודיות שלילית.

כאשר מעריכים את התוצאות של IEM, תוצרי האינטראקציה בין אנטיגן לנוגדן במיקרוסקופ אלקטרוני יכולים להיות בעלי מראה שונה (חלקיק ויראלי בודד מכוסה בנוגדנים בשלמותם או בחלקו; אגרופים של חלקיקים ויראליים). אגלומרטים יכולים לתפוס שטח אחר, להיות בעלי מראה שונה ולהכיל מספר שונה של חלקיקים. לכן, יחד עם הניסויים, יש צורך ללמוד תכשירי בקרה (עם תמיסת חיץ או אנטי-סרום הטרולוגי).

הקריטריון להערכת התוצאות המתקבלות באמצעות IEM הוא נוכחות או היעדר מקבצים של חלקיקים ויראליים המצטברים על ידי סרום חיסוני בתכשירים. נוכחותם של אגלומרטים של אנטיגנים ונוגדנים ספציפיים נגד סרום היא סימן לתגובה חיובית. עם זאת, יש לקחת בחשבון את האפשרות של צבירה לא ספציפית של חלקיקי אנטיגן בהשפעת צנטריפוגה במהירות גבוהה. מסיבה זו, מחברים רבים ממליצים לשקול תוצאות בסולם מותנה מ-0 עד 4+. הוא מבוסס על הערכה של מידת הכיסוי של חלקיקים מצטברים עם נוגדנים בסרום.

שיטות של hemagglutination ו hemadsorption. לנגיפים רבים יש את היכולת לצבור אריתרוציטים של מינים מוגדרים בהחלט של יונקים וציפורים. לפיכך, נגיפי שפעת וחזרת מצמידים אריתרוציטים של תרנגולות, חזירי ניסיונות ובני אדם; וירוס דלקת מוח קרציות - אריתרוציטים של כבשים; נגיפי דלקת מוח יפנית - אריתרוציטים של תרנגולות ואווזים בני יום אחד; אדנוווירוסים - אריתרוציטים של חולדות, עכברים, קופים. אלנטואים, מי שפיר, תרחיף של ממברנות כוריון-אלנטואיות של עוברי עוף, תרחיפים ותמציות מתרביות של תאים או איברים של בעלי חיים שנדבקו בנגיפים משמשים כחומר הבדיקה בתגובת ההמגלוטינציה (HA). ניתן לקבוע את תגובת ההמגלוטינציה בשיטת הטפטוף על זכוכית ובשורה מורחבת במבחנות או בארות של לוחות פוליסטירן. השיטה הראשונה היא אינדיקטיבית.

בהיותו ספציפי לקבוצה, RGA אינו מאפשר לקבוע את מיני הנגיפים. הם מזוהים באמצעות מבחן עיכוב ההמגלוטינציה (HITA). סרה אנטי-ויראלית חיסונית ידועה משמשת לניסוח שלה. כמות שווה של נוזל המכיל וירוס מתווספת לכל דילול. השליטה היא השעיה של הנגיף.

התערובת נשמרת בתרמוסטט, ואז מתווספת השעיה של אריתרוציטים. מספר דקות לאחר מכן נקבע הטיטר של הסרום המנטרל, כלומר. הדילול המקסימלי שלו, מה שגרם לעיכוב באגלוטינציה של אריתרוציטים.

באבחון סרולוגי של מחלות ויראליות, מומלץ להשתמש ב-RTHA עם סרה זוגית, אחת מהן מתקבלת בתחילת המחלה, והשנייה לאחר 1-2 שבועות או יותר. עלייה של פי ארבע בטיטר הנוגדנים בסרום השני מאשרת את האבחנה המוצעת.

תגובת ההמדסורפציה (RGads) משמשת לציון בתרביות תאים נגועים וירוס בעל פעילות המגלוטינציה. מהות התגובה טמונה בעובדה שאריתרוציטים הרגישים לפעולת ההמגלוטינציה של וירוסים נספגים על פני השטח של תאים נגועים בנגיפים. לדוגמה, אריתרוציטים של עוף נספגים על תאים הנגועים בנגיף הווריולה; וירוס חצבת - אריתרוציטים של קופים; אדנוווירוסים - קופים וחולדות וכו'.

תגובת נטרול (PH). רבייה בתרביות תאים, וירוסים גורמים לסוגים שונים של CPD, המתבטאים בעיגול, קמטים, הפחתה או להיפך, הגדלת גודל התא, היתוך שלהם ויצירת סימפלסטים, הרס הציטופלזמה והגרעין. לבסוף, בשכבת מונו-שכבה של תאים נגועים בנגיפים, כתוצאה מהרס שלהם של חלקים מסוימים בשכבת התאים, יכולים להופיע "כתמים סטריליים" או פלאקים, שהם שיבוט של חלקיק נגיפי, מה שמאפשר לא רק לבודד את הנגיף, אלא גם לקבוע את הטיטר שלו.

קשה מאוד לזהות את הנגיף לפי אופי הפלאק, ולכן הם פונים לקביעת ה-PH של הנגיף המבודד עם סמים ידועים שמנטרלים וירוסים. לצורך כך, הנגיף המתקבל מהמטופל נצבר בתרבית תאים ומערבבים את דילוליו השונים בסרום אנטי-ויראלי לא מדולל.

תערובת של וירוסים וסרה יכולה להדביק עוברי אפרוחים או חיות רגישות. במקרים כאלה, פעילות הנטרול של הנוגדנים נקבעת לרוב על ידי נטרול ההמגלוטינינים הנגיפיים בנוזלי העובר וביטול ההשפעה הקטלנית של הנגיף על עוברים ובעלי חיים. במקביל, מחושב מדד הנטרול, המבטא את המספר המרבי של מנות קטלניות של הנגיף המנוטרל על ידי סרום זה, בהשוואה לתוצאות ניסוי הביקורת, שנלקחו כאחת.

באופן דומה, באמצעות PH, וירוסים מבודדים מחומר החולים מזוהים כאשר הם מדביקים עוברי עוף ובעלי חיים. לשם כך מוסיפים נוזלים המכילים וירוסים של עוברים ותרחיות של האיברים הפגועים של בעלי חיים לסרה המנטרלת את הנגיף. לאחר זמן דגירה מסוים, תרביות תאים, עוברי אפרוחים ובעלי חיים נדבקים בתערובות.

ב-serodiagnosis של זיהומים ויראליים, נקבעת הדינמיקה של העלייה בטיטר של נוגדנים מנטרלים וירוסים עבור וירוס ידוע. במקביל, ה-PH נקבע עם סמים זוגיים שנלקחו מהמטופלים בתחילת המחלה ובסיומה. אבחון יהיה עלייה של פי 4 בטיטר של אימונוגלובולינים בשני מהם.

PH מבוסס על היכולת של נוגדנים ספציפיים להיקשר חזק מספיק לחלקיק ויראלי. כתוצאה מהאינטראקציה בין הנגיף לנוגדן, הפעילות המדבקת של הנגיף מנוטרלת עקב חסימת הקובעים האנטיגנים האחראים לחיבור של החלקיק הנגיפי עם תאים רגישים. כתוצאה מכך, הנגיף מאבד את יכולתו להתרבות במערכת ביולוגית רגישה במבחנה או in vivo.

התוצאות של PH מתגלות לאחר שתערובת של הנגיף והנוגדנים ההומולוגיים שלו, לאחר חשיפה מתוזמנת, מוכנסת למערכת ביולוגית רגישה (תרבית תאי רקמה, עובר אפרוח, גוף בעל חיים רגיש), שם הנגיף יכול להתרבות ולגרום למדידה. שינויים שיודכאו חלקית או מלאה בנוכחות נוגדנים.

ישנם שלושה מרכיבים המעורבים ב-PH:

• 1) וירוס;
• 2) סרום המכיל נוגדנים;
• 3) חפץ ביולוגי (חיות מעבדה, עוברי עוף מתפתחים, תרביות רקמה), שהבחירה בו תלויה בסוג הנגיף איתו אמורים להתבצע מחקר.

PH משמש לזיהוי פתוגן מבודד או לזיהוי וטיטרציה של נוגדנים בסרה. במקרה הראשון, נעשה שימוש בסרה של חיות מעבדה שחוסנו במיוחד או אנשים שהחלימו. במקרה השני, נעשה שימוש בסרה שנלקחה בשלב הראשוני של המחלה ובמהלך תקופת ההבראה.

נוגדנים מנטרלים וירוסים בסרום של אנשים שהחלימו, בניגוד לאנטי-המגלוטינינים או נוגדנים מקובעים משלימים, נמשכים שנים רבות, ובחלק מזיהומים ויראליים (למשל, חצבת) אפילו לכל החיים. הדבר מאפשר במקרים מסוימים להשתמש במאגר הסרה של מחלימים רבים כתרופה התייחסות, אשר לאחר מילוי באמפולות וליאופיליזציה מתאימה לעבודת אבחון לאורך זמן.

בעת זיהוי פתוגנים מבודדים, נעשה שימוש בסרה היפראימונית מוכנה מראש של בעלי חיים שונים: ארנבות, חולדות ועכברים לבנים, חזירי ניסיונות, קופים, כבשים, סוסים וכו'. הפעילות של סרה היפראימונית עבור PH תלויה בשיטת החיסון של בעלי חיים.

לפני הגדרת כל ניסוי נטרול, הנגיף עובר טיטרציה מראש, תוך קביעת הדילול הסופי שגורם נזק לתרבית רקמה או זיהום של חיות מעבדה (או עוברי תרנגולת). טיטר הנגיף מבוטא כמנה של 50% (TCID50 - 50% מינון זיהומיות לתרבית רקמה).

שיטות אבחון גנטיות מולקולריות בפרקטיקה וירולוגית. שיטות של ביולוגיה מולקולרית פותחו בשנות ה-50. המאה העשרים. הם התאפשרו הודות לעובדה שבגנום של כל וירוס קיימים רצפי נוקלאוטידים ייחודיים למין, על ידי זיהוי אשר ניתן לזהות כל גורם זיהומי. שיטות אלו הן החשובות ביותר בזיהוי מיקרואורגניזמים ארוכי טווח או קשים לטיפוח בשיטות קונבנציונליות. בשנות ה-70, נעשה שימוש בזיהוי בדיקה של DNA כדי לזהות גורם זיהומי או מוטציה, על בסיס הכלאה של בדיקות אוליגונוקלאוטידים ספציפיות המסומנות באיזוטופ רדיואקטיבי (או פלואורכרום) עם דגימת DNA מבודדת. ניתוח הכלאה משתמש ביכולת של חומצות גרעין בתנאים מסוימים ליצור קומפלקסים ספציפיים עם חומצות גרעין שיש להן רצפים משלימים. השיטה לגילוי פתוגנים זיהומיים על ידי הכלאה של DNA התבררה כעומלנית ביותר, גוזלת זמן ויקרה. בנוסף, רגישותו אינה מספקת לזיהוי מיקרואורגניזמים בחומרים קליניים כגון צואה ושתן.

הכלאת DNA הוחלפה בשיטה המחקה את השכפול הטבעי של ה-DNA ומאפשרת לזהות ולהעתיק שוב ושוב קטע DNA מסוים באמצעות DNA פולימראז תרמופילי. תגובת שרשרת פולימראז (PCR) היא שיטה אלגנטית המחקה שכפול DNA טבעי ומאפשרת לזהות פיסת DNA ספציפית ולהעתיק אותה שוב ושוב באמצעות DNA פולימראז תרמופילי.

בשל איכויות האבחון הגבוהות שלו, PCR הוא תוספת מוכרת בדרך כלל לשיטות המסורתיות המשמשות בווירולוגיה: התפשטות וירוסים בתרבית תאים, זיהוי אימונולוגי של אנטיגנים ויראליים ומיקרוסקופ אלקטרונים. יתרון משמעותי בשיטה זו הוא היכולת לזהות וירוסים בזיהומים סמויים (ציטומגלווירוס, וירוס הרפס) ונגיפים שקשה או עדיין לא אפשרי לטפח (וירוס כשל חיסוני אנושי, וירוס אפשטיין-בר, וירוס הפפילומה האנושי, וירוס הפטיטיס Vidr). הסיכויים לחקר מחלות כמו מחלת קרויצפלד-יעקב, מחלת אלצהיימר וטרשת נפוצה קשורים לשיטת ה-PCR.