אימונובלוטינג (אימונובלוט) היא שיטת התייחסות מאוד ספציפית ורגישה מאוד המאשרת את האבחנה למטופלים עם תוצאות בדיקה חיוביות או בלתי מוגדרות שהתקבלו כולל. באמצעות RIGA או ELISA. אימונובלוטינג הוא סוג של בדיקה חיסונית הטרוגנית.

שיטה זו לזיהוי נוגדנים לאנטיגנים פתוגנים בודדים מבוססת על ELISA על ממברנות ניטרוצלולוזה, עליהן מורחים חלבונים ספציפיים בצורה של להקות נפרדות, המופרדות על ידי אלקטרופורזה ג'ל. אם יש נוגדנים נגד אנטיגנים מסוימים, מופיע קו כהה בלוקוס הרצועה המקביל. ייחודו של האימונובלוט טמון בתכולת המידע הגבוהה שלו ובאמינות התוצאות המתקבלות.

החומר למחקר הוא סרום אנושי או פלזמה. למחקר על רצועה אחת, נדרשים 1.5-2 מ"ל של דם או 15-25 μl של סרום.

LLC "אבחון מעבדה" משתמש בערכות אימונובלוטינג לאיתור נוגדנים לפתוגנים של מחלות שונות של חברת "EUROIMMUN" (גרמניה), "MIKROGEN" (גרמניה):

HSV 1 ו HSV 2 IgM/IgG(זיהום בנגיף הרפס)

CMV IgM/IgG(זיהום ציטומגלווירוס)

אדמת IgG

פרופיל TORCH IgM(טוקסופלזמה, אדמת, ציטומגלווירוס, HSV 1 ו-HSV 2)

EBV IgMTIGG(זיהום בנגיף אפשטיין-בר)

HCV IgG(הפטיטיס C ויראלית)

ישנם שני סוגים של ערכות - כתם מערבי וכתם קו.

כתם מערבי:הערכות מכילות רצועות ממברנות בדיקה עם אנטיגנים מקומיים מופרדים אלקטרופורטית של גורמי הזיהומים המתאימים, כלומר. אנטיגנים מסודרים לפי סדר משקל מולקולרי. 1-2 קווים נוספים עם אנטיגנים משמעותיים מבחינה קלינית (Western Line blot) יכולים להיות מיושמים גם הם על הממברנות. זוהי שיטת אישור אמינה, המבטלת תוצאות חיוביות שגויות ותגובות צולבות.

כתם קו:במקרה זה, רק אנטיגנים בעלי משמעות קלינית (מקוריים, סינתטיים או רקומביננטיים) מוחלים על רצועות הבדיקה לפי סדר מסוים. גישה זו משמשת לאבחנה מבדלת של מספר זיהומים ברצועה אחת.

המהות שלו טמונה בהעברת מולקולות של החומר הנבדק מנשא מוצק אחד המשמש לפירוק של ביופולימרים למשנהו, שם הם מזוהים באופן ספציפי באמצעות תגובה אימונוכימית. שיטה מודרנית רגישה מאוד היא לזהות חלבונים, כולל אנטיגנים ויראליים. השיטה מבוססת על שילוב של אלקטרופורזה בג'ל ותגובת אנטיגן-נוגדנים. רמה גבוהה של רזולוציה מושגת הודות להפרדה אלקטרופורטית של חלבונים, גליקו וליפופרוטאינים והספציפיות המקסימלית של זיהוי סרה חיסונית או נוגדנים חד שבטיים. בתנאים אופטימליים, אימונובלוטינג יכול לזהות אנטיגן בכמויות של פחות מ-1 ng בנפח הבדיקה. מבחינה טכנית, אימונובלוטינג מתבצע בשלושה שלבים:

1) החלבונים לניתוח נתונים להפרדה בג'ל פוליאקרילאמיד בנוכחות חומרים דנטורטים: סודיום דודציל סולפט או אוריאה, תהליך זה מכונה לעתים קרובות SDS-PAGE; חלבונים מופרדים ניתן להמחיש לאחר צביעה ולהשוות עם דגימות התייחסות;

2) חלבונים מופרדים מועברים מהג'ל על ידי שכבת-על (כתמים).
מסנן ניטרוצלולוזה ומקובע עליו; במקרים רבים, אבל
לא תמיד, במהלך ההעברה, היחסים הכמותיים של חלבונים נשמרים;

3) המסננים מצופים בזיהוי פולי או חד שבטי
נוגדנים המכילים תווית רדיואיזוטופ או אנזים; ל
זיהוי של נוגדנים קשורים, נעשה שימוש גם בניתוח אנטי-מינים
סרום מסומן, במילים אחרות, בשלב הסופי, סופג
בדומה למבחנים חיסוניים בשלב מוצק.

יש לזכור שבמסגרת זו של אימונובלוטינג, החלבונים נמצאים במצב דנטורטי, ולכן הם עשויים שלא להיות מזוהים על ידי נוגדנים ספציפיים לחלבון המקומי, אלא בנוכחות סרה לכל הפפטידים המרכיבים את כל הפפטידים. הספקטרום של החלבון הנבדק מזוהה בו זמנית. אימונובלוטינג נמצא בשימוש נרחב במחקרים על מבנה נגיפי הפטיטיס, בפרט, כדי לבסס את הקשר האנטיגני בין זנים בודדים. הרזולוציה הגבוהה של אימונובלוטינג מאפשרת להשיג תוצאות טובות בתרגול האבחון, כאשר נדרש לזהות את הנגיף ברקמות או בהפרשות החולה.

בהתאם לחומר הנבדק, נבדלים DNA, RNA וחלבון - סופג.

זיהוי אימונוכימי של אנטיגנים יכול להתבצע באמצעות נוגדנים המצומדים עם תווית. לאחרונה, איזוטופים רדיואקטיביים או אנזימים (פרוקסידאז, פוספטאז אלקליין, לקטמאז וכו') היו בשימוש נרחב כתווית.

זמן בדיקת דיפוזיה הוא 36-48 שעות, אך הדרך המהירה והיעילה ביותר להעביר חלבונים מג'לים היא אלקטרו-בלוטינג, שהיא בדרך כלל 1-3 שעות, עבור חלק מהחלבונים במשקל מולקולרי גבוה יותר מ-12 שעות.

הבחירה הספציפית של סופגים לשינויים שונים של כתמים (ניטרוצלולוזה או נייר שטופלו בהתאם), בחירת התנאים לחסימה וזיהוי אימונוכימי של אנטיגנים תלויה לחלוטין באנטיגן, בכמותו, בשיטת ה-immunoassay ובמטרות המחקר.

היכולת לזהות נוגדנים לאנטיגנים פתוגנים ספציפיים מאפשרת להעריך את המשמעות של נוגדנים אלה (ספציפיות לגורם אטיולוגי נתון), כדי לשלול תגובה לאנטיגנים צולבים. זה מה שמבדיל את האימונובלוטינג מ-ELISA, שבו ניתן להשתמש בשילובים שונים של דטרמיננטים אנטיגנים כאנטיגן - גם ספציפי וגם לא, ונותנים תגובות צולבות עם פתוגנים אחרים. אחרת, כאשר מתקבלת תוצאת ELISA חיובית, אפשר רק להניח שזו תוצאה של תגובת צולבת, ובמקרה של אימונובלוטינג, זה מכריע.

שיטת IB, ממספר סיבות, הפכה לרווחת ביותר כשיטה המתאימה לשימוש כבדיקת אישור.

היתרון הבלתי מעורער של השיטה הוא האפשרות לבדוק נוגדנים לאנטיגנים חלשים או בלתי מסיסים לחלוטין והדרת שלב החדרת תווית רדיואקטיבית לאנטיגנים.

הרגישות במקרה של IB נשפטת לפי הכמות המגבילה של אנטיגן המופקדת על הג'ל, אשר, בעת חלוקת חלבונים, ניתן לזהות באופן אימונוכימי לאחר העברה מהג'ל לשלב המוצק (ניטרוצלולוזה). הרגישות הכוללת של המבחן תלויה במספר גורמים: התנאים לפרקציה וקיבוע של האנטיגן על נשא מוצק, רמת הרקע, הספציפיות והזיקה של הנוגדנים. יש חשיבות לסוג התווית שבה נעשה שימוש וכיצד היא מזוהה.

לפיכך, שיטת האימונובלוטינג מאפשרת לזהות אזורים של אנטיגן על הפאזה המוצקה מבלי לקשור את החלבון כולו לנוגדנים ספציפיים בסרום. אימונובלוטינג והשינויים שלו משמשים בעיקר להקלדת אנטיגנים ונוגדנים חיידקיים וויראליים, במיוחד במקרה של רזולוציה לא מספקת של מערכות קונבנציונליות, כמו גם בניתוח אימונוגלובולינים, חומצות גרעין, או כבדיקת אישור בשילוב עם שיטות אחרות.

קושי רב בפירוש תוצאות תגובות צולבות ובמקרים של שלבים ראשוניים של המרה סרוקית. במצב הראשון, בבדיקה חוזרת לאחר פרק זמן מסוים, לא מתגלים נוגדנים, ובאימונובלוט השני מופיעות פסים חדשים המעידים על הופעת נוגדנים לחלבוני HIV או גליקופרוטאין, המאפיינות את דינמיקת התגובה של התגובה החיסונית. לאנטיגנים של וירוסים.

זוהי למעשה שיטת האימות הסופית בשרשרת הבדיקות הסרולוגיות, המאפשרת להגיע למסקנה סופית לגבי חיוביות ה-HIV של המטופל או לדחות אותה. להגדרת IB, נעשה שימוש ברצועות ניטרוצלולוזה, עליהן מועברים חלבוני HIV מראש בשיטה של ​​אימונופורזה אופקית ולאחר מכן אנכית בסדר הגדלת המשקל המולקולרי שלהם. הנוגדנים של הסרה שנבדקה מקיימים אינטראקציה עם חלבונים באזורים מסוימים של הרצועה. מהלך התגובה הנוסף אינו שונה מזה של ELISA, כלומר, הוא כולל טיפול ברצועה (רצועה) עם מצומד ומצע כרומוגן, שטיפת רכיבים לא קשורים ועצירת התגובה במים מזוקקים. הפרדה אלקטרופורטית ראשונית של חלבונים וקיבועם על ניטרוצלולוזה מאפשרת לזהות נוגדנים לחלבונים ספציפיים בהתאם לנוכחות (או היעדר) של צביעה (כחול-אפרפר) של האזורים המתאימים של הרצועה. אימונובלוטינג לא יכול לשמש למחקר סקר המוני בשל עלותו הגבוהה והיא שיטה של ​​ארביטראז' אינדיבידואלי בשלב הסופי של מחקר סרולוגי.

יש מתאם ברור למדי בין תוצאות המחקר של סרה ב-IB ו-ELISA. פעמיים חיוביות ב-ELISA (במערכות בדיקה שונות) סרה מתפרשת לאחר מכן ב-IB כחיובית ל-HIV ב-97-98% מהמקרים. סרומים חיוביים ב-ELISA רק באחת משתי מערכות הבדיקה שבהן נעשה שימוש, מתבררים כבעלי HIV ב-IB לא יותר מאשר ב-4% מהמקרים. כאשר עורכים מחקרים מאששים, כ-5% מה-IBs יכולים לתת תוצאות שנקראות "בלתי מוגדרות", אשר, ככלל, מתאימות ל-ELISA חיובי, אך לא ל-RIP. בכ-20% מהמקרים, IBs "בלתי מוגדרים" נגרמים על ידי נוגדנים לחלבוני גאג HIV-1 (p55, p25, p18). כאשר משיגים תוצאות מפוקפקות של אימונובלוטינג, יש צורך לחזור על המחקר לאחר 3 חודשים, ואם אי הוודאות של התוצאה נמשכת, לאחר 6 חודשים.

שיטת רדיו-אימונית (RIM) (ניתוח רדיואימונולוגי, RIA) Radioimmunoassay היא שיטה לקביעה כמותית של חומרים פעילים ביולוגית (הורמונים, אנזימים, תרופות וכו') בנוזלים ביולוגיים, המבוססת על קשירה תחרותית של החומרים היציבים והדומים הרצויים המסומנים ברדיונוקליד בעל מערכות קישור ספציפיות. האחרונים הם לרוב נוגדנים ספציפיים. בשל העובדה שהאנטיגן המסומן מתווסף בכמות מסוימת, ניתן לקבוע את חלק החומר שנקשר לנוגדנים, ואת החלק שנותר לא קשור כתוצאה מתחרות עם האנטיגן הלא מסומן המתגלה. המחקר מתבצע במבחנה. עבור ר' ו. לייצר ערכות סטנדרטיות של ריאגנטים, שכל אחת מהן נועדה לקבוע את הריכוז של כל חומר אחד. המחקר מתבצע במספר שלבים: מערבבים את החומר הביולוגי עם ריאגנטים, מדגרים את התערובת למשך מספר שעות, מפרידים את החומר הרדיואקטיבי החופשי והקשור, מבצעים רדיומטריה של הדגימות ומחושבות התוצאות. השיטה רגישה ביותר, ניתן להשתמש בה באבחון מחלות של מערכת הלב וכלי הדם, האנדוקרינית ואחרות, לקביעת הגורמים לאי-פוריות, הפרעות התפתחותיות של העובר, באונקולוגיה לקביעת סמני גידול ומעקב אחר יעילות הטיפול, לקביעת ריכוז האימונוגלובולינים, אנזימים וחומרים רפואיים. במקרים מסוימים מתבצעים מחקרים על רקע בדיקות העמסה תפקודיות (למשל קביעת תכולת האינסולין בסרום בדם על רקע בדיקת סבילות לגלוקוז) או בדינמיקה (למשל קביעת הורמוני המין בדם במהלך המחזור החודשי).

בעזרת ערכה מסחרית מבית ABBOTT - Austria II-I 125 ניתן לזהות HBsAg בריכוזים של עד 0.1 ng/ml. יתרונות השיטה כוללים אפשרות לסטנדרטיזציה ואוטומציה של השיטה עם קבלת תשובות במונחים מספריים. החיסרון של השיטה הוא המגבלות שנקבעות על פי אופן הפעולה עם חומר רדיואקטיבי, וחיי המדף הקצרים יחסית של ערכת האבחון, הקשורים לדעיכה של התווית הרדיואקטיבית.

ערכות אבחון לזיהוי אנטיגנים שונים של נגיפי הפטיטיס A, B ו-D ונוגדנים אליהם מיוצרות על ידי איזוטופ (טשקנט) וכמה חברות זרות (למשל, ABBOTT). חרוזי פוליסטירן (ABBOTT) או מבחנות (איזוטופ) משמשים כשלב המוצק. האיזוטופ הנפוץ ביותר לתיוג נוגדנים או אנטיגנים הוא I 125, בעל זמן מחצית חיים של 60 יום ורדיואקטיביות ספציפית גבוהה. המדידה של תווית רדיואקטיבית, כלומר קרינה, מתבצעת על מונים מיוחדים - ספקטרומטרים רדיו. ספירת הפולסים הרדיואקטיביים הן בדגימות הבקרה והן בדגימות הבדיקה מתבצעת בזמן קבוע אחד, בדרך כלל תוך דקה אחת. כאשר מנתחים את תוצאות התגובה, יש צורך לקחת בחשבון נוכחות של רקע של רדיואקטיביות, אשר יכול להשפיע על התוצאה הסופית של התגובה. הסיבות לרקע המוגבר עשויות להיות: זיהום של מיכל הדגימה או הקן; הגדרה לא נכונה של המכשיר; נוכחות של מקור קרינה חזק ליד המכשיר.

כדי לאשר תוצאה חיובית שהתקבלה מההקרנה הראשונית של דגימות, מומלץ לבצע RIA חוזר או בדיקה חלופית. אם מתגלה HBsAg, יש לבצע בדיקת אישור.

טבלה 1. סיווג חיסונים

בִּיבּלִיוֹגְרָפִיָה:

חובה:

1. Khaitov R.M., Ignatieva G.A., Sidorovich I.G. אימונולוגיה: ספר לימוד.-מ': רפואה, 2000.- 432 עמ': איל (ספרות לימוד לסטודנטים לרפואה).

2. Kovalchuk L.V ואחרים אימונולוגיה: סדנה: ספר לימוד. קצבה - מ': GEOTAR-Media, 2012. - 176 עמ'.

3. Pozdeev O.K. מיקרוביולוגיה רפואית / עורך. acad. RAMS V.I. פוקרובסקי - מ': GEOTAR-Media, 2001. - 768 עמ'.

4. בוריסוב ל.ב. מדריך לתרגילים מעשיים במיקרוביולוגיה. מ' 1997

נוֹסָף:

1. Genkel P.A., מיקרוביולוגיה עם יסודות הווירולוגיה. מ', 1974

2. Korotyaev A.I., Babichev S.A. מיקרוביולוגיה רפואית, אימונולוגיה ווירולוגיה: ספר לימוד לדבש. אוניברסיטאות - מהדורה שלישית, מתוקנת. ועוד - סנט פטרסבורג, SpetsLit. 2002. - 591 עמ'.

3. Borisov L.B., Smirnova A.M., Medical microbiology, virology, immunology, M., Medicine. 1994

4. Timakov V.D., Levashov V.S., Borisov L.B. מִיקרוֹבִּיוֹלוֹגִיָה. מ' 1983

סיכה חיסונית (אימונובלוט, ווסטרן כתם, ווסטרן כתם)- משלב בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים (ELISA) עם העברה אלקטרופורטית ראשונית של אנטיגנים של וירוסים לרצועת ניטרוצלולוזה (רצועה).

בשם המדעי היפה הזה, "כתם" מתורגם ככל הנראה כ"כתם", ו"מערבי" כ"מערבי" משקף את כיוון ההפצה של "כתם" זה על הנייר משמאל לימין, כלומר במפה גיאוגרפית, זה מתאים לכיוון ממערב למזרח". המהות של שיטת "כתם חיסוני" היא שהתגובה האימונו-אנזימטית מתבצעת לא עם תערובת של אנטיגנים, אלא עם אנטיגנים של HIV, שהופצו בעבר על ידי אימונופורזה לשברים הממוקמים על פי משקל מולקולרי על פני קרום ניטרוצלולוזה. כתוצאה מכך, החלבונים העיקריים של HIV, נשאים של דטרמיננטים אנטיגנים, מופצים על פני השטח בצורה של להקות נפרדות, המופיעות במהלך בדיקת האנזים החיסונית.

אימונובלוט כולל מספר שלבים:

הכנת רצועה.נגיף הכשל החיסוני (HIV), שטוהר בעבר והושמד למרכיביו, נתון לאלקטרופורזה, בעוד שהאנטיגנים המרכיבים את HIV מופרדים לפי משקל מולקולרי. לאחר מכן, על ידי סופג (בדומה לסחיטת עודפי דיו על "פלוטר"), האנטיגנים מועברים לרצועה של ניטרוצלולוזה, המכילה כעת ספקטרום של פסים אנטיגנים האופייניים ל-HIV, בלתי נראים לעין.

מחקר לדוגמה.חומר הבדיקה (סרום, פלזמת דם של המטופל וכו') מורחים על רצועת הניטרוצלולוזה, ואם יש נוגדנים ספציפיים בדגימה, הם נקשרים לרצועות האנטיגניות התואמות לחלוטין (משלימות). כתוצאה ממניפולציות עוקבות, תוצאת האינטראקציה הזו מוצגת - הופכת לגלויה.

פרשנות התוצאה.הנוכחות של להקות באזורים מסוימים של צלחת ניטרוצלולוזה מאשרת את הנוכחות בסרום הנחקר של נוגדנים לאנטיגנים של HIV מוגדרים בקפדנות.

נתיב A - בקרה חיובית

נתיב B - שליטה חיובית חלשה

נתיב C - שליטה שלילית

רצועה D - מדגם חיובי (נוגדנים ל-HIV-1 זוהו)

נכון לעכשיו, ספיגת מערכת החיסון (אימונובלוט) היא השיטה העיקרית לאישור נוכחותם של נוגדנים ספציפיים לווירוס בסרום הבדיקה. במקרים מסוימים של זיהום ב-HIV, לפני המרת סרוק, נוגדנים ספציפיים מזוהים בצורה יעילה יותר על ידי אימונובלוטינג מאשר על ידי ELISA. מחקר סופג חיסוני גילה כי נוגדנים ל-gp 41 מתגלים לרוב בסרום של חולי איידס, וזיהוי p24 באנשים שנבדקו למטרות מניעתיות מצריך מחקרים נוספים לנוכחות זיהום ב-HIV. מערכות בדיקת אימונובלוט המבוססות על חלבונים רקומביננטיים מהונדסים גנטית הוכחו כספציפיות יותר ממערכות קונבנציונליות המבוססות על ליזאט וירוס מטוהר. כאשר משתמשים באנטיגן רקומביננטי, לא נוצרת פס אנטיגן מפוזר, אלא מוגדר בבירור, הנגיש בקלות לחשבונאות והערכה.

סרום של אנשים שנדבקו ב-HIV-1, מזהה נוגדנים לחלבונים ולגליקופרוטאינים העיקריים הבאים - חלבוני מעטפת מבניים (env) - gp160, gp120, gp41; גרעינים (gag) - p17, p24, p55, כמו גם אנזימי וירוס (pol) - p31, p51, p66. עבור HIV-2, נוגדנים ל-env אופייניים - gp140, gp105, gp36; gag - p16, p25, p56; pol-p68.

בין שיטות המעבדה הנחוצות לביסוס הספציפיות של התגובה, זיהוי נוגדנים לחלבוני מעטפת HIV-1 - gp41, gp120, gp160 ו-HIV-2 - gp36, gp105, gp140 הוא בעל ההכרה הגדולה ביותר.

ארגון הבריאות העולמי רואה סרה חיובית אם מתגלים נוגדנים לשני גליקופרוטאינים של HIV על ידי אימונובלוטינג. לפי המלצות אלו, אם יש תגובה עם אחד מחלבוני המעטפת בלבד (rp 160, rp 120, rp 41) בשילוב או ללא תגובה עם חלבונים אחרים, התוצאה נחשבת בספק ומומלץ לבצע בדיקה שנייה באמצעות ערכה מסדרה אחרת או מחברה אחרת. אם לאחר מכן התוצאה נותרת בספק, מומלצת השגחה של 6 חודשים (מחקר לאחר 3 חודשים).

נוכחות של תגובה חיובית עם אנטיגן p24 עשויה להעיד על תקופה של המרה סרוקית, שכן לעיתים מופיעים לראשונה נוגדנים לחלבון זה. במקרה זה, מומלץ, בהתאם לנתונים הקליניים והאפידמיולוגיים, לחזור על המחקר עם דגימת נסיוב שנלקחה לפחות שבועיים לאחר מכן, וזה בדיוק המקרה כאשר יש צורך בסרה מזווגת בהדבקה ב-HIV.

תגובות חיוביות עם חלבוני gag ו-pol ללא נוכחות של תגובה עם חלבוני env עשויות לשקף את השלב של המרה סרוקית מוקדמת, ועשויות גם להצביע על זיהום HIV-2 או תגובה לא ספציפית. אנשים עם תוצאות כאלה לאחר בדיקת HIV-2 נבדקים מחדש לאחר 3 חודשים (תוך 6 חודשים).

תיאור

שיטת קביעהאימונובלוט.

חומר במחקרנַסיוֹב

ביקור בית זמין

נוגדנים אנטי-גרעיניים הם משפחה של נוגדנים עצמיים הנקשרים לחומצות ריבונוקלאיות ולחלבונים הקשורים אליהן. הם מופיעים בלמעלה מ-90% מהחולים עם מחלות רקמת חיבור מפוזרות, ונצפים לעתים קרובות גם במחלות כבד אוטואימוניות ובמספר מצבים אחרים. עד כה אופיינו כ-200 סוגים של משפחה זו של נוגדנים עצמיים, אך לא בכולם ניתן להשתמש בתרגול קליני.

האימונובלוט של נוגדנים אנטי-גרעיניים מאפשר לימוד בו-זמנית של 15 סוגים עיקריים של נוגדנים אנטי-גרעיניים בבדיקה אחת, מה שמבטיח אבחנה מבדלת של המחלות הראומטיות הסיסטמיות העיקריות. כל סוג של נוגדנים עצמיים המתגלה על ידי אימונובלוט נצפה בדרך כלל בחולים עם תמונה קלינית אופיינית, כך שספקטרום הנוגדנים העצמיים מאפשר לא רק לאבחן את המחלה, אלא גם לקבוע את הסיכון לפתח ביטויים קליניים מסוימים.

מומלץ להשתמש באימונובלוט של נוגדנים אנטי-גרעיניים בשלב השני של בדיקה סרולוגית עם תוצאה חיובית של בדיקות אחרות המעידות על נוכחות של נוגדנים אנטי-גרעיניים בסרום של הנבדק. בדיקות אלו כוללות קביעת נוגדנים אנטי-גרעיניים (סקר ELISA), זיהוי של גורם אנטי-גרעיני (ANF) על תאי Hep2 (), נוגדנים אנטי-גרעיניים ונוגדנים לאנטיגן הגרעיני הניתן לחילוץ (ENA,).

שיטת האימונובלוט של נוגדנים אנטי-גרעיניים באבחון מחלות ראומטיות מערכתיות מאופיינת בספציפיות קלינית גבוהה. אבל לא תמיד ניתן לקבוע את הספציפיות של נוגדנים אנטי-גרעיניים, אפילו בטיטר גבוה של ANF (), מכיוון שמספר אנטיגנים נוגדנים אנטי-גרעיניים עדיין לא מאופיינים. תוצאת immunoblot שלילית במקרה זה אינה שוללת את האבחנה של מחלות ראומטיות מערכתיות. ניתן לזהות מספר נוגדנים אנטי-גרעיניים באמצעות אימונובלוט - פאנל של נוגדנים עצמיים ספציפיים למיוזיטיס () ואימונובלוט - פאנל של נוגדנים עצמיים בסקלרודרמה ().

סִפְרוּת

1. Lapin S.V. טוטוליאן א.א. אבחון מעבדה אימונולוגי של מחלות אוטואימוניות / הוצאה לאור "Chelovek", סנט פטרסבורג - 2010. 272 ​​p.
2. Nasonov E.L., Aleksandrova E.N. תקנים מודרניים לאבחון מעבדתי של מחלות ראומטיות. הנחיות קליניות / BHM, M - 2006.
3. Conrad K, Schlosler W., Hiepe F., Fitzler M.J. נוגדנים עצמיים במחלות אוטואימוניות ספציפיות לאיבר: אסמכתא אבחנתית/ PABST, דרזדן - 2011. 300 עמ'.
4. Conrad K, Schlosler W., Hiepe F., Fitzler M.J. נוגדנים אוטומטיים במחלות אוטואימוניות מערכתיות: אסמכתא אבחנתית/ PABST, דרזדן - 2007. 300 עמ'.
5. Gershvin ME, Meroni PL, Shoenfeld Y. Autoantibodies 2nd ed./ Elsevier Science - 2006. 862 p.
6. Shoenfeld Y., Cervera R, Gershvin ME Criteria Diagnostic in Autoimmune Diseases / Humana Press - 2008. 598 p.
7. הוראות ערכת ריאגנטים.

הכנה

עדיף לעמוד 4 שעות לאחר הארוחה האחרונה, אין דרישות חובה.

אינדיקציות לקביעת תור

הבדיקה מיועדת לאבחון ולאבחנה מבדלת של המצבים הבאים:

• זאבת אדמנתית מערכתית;
• זאבת עורית תת-חריפה וסוגים אחרים של זאבת עורית;
• מחלת רקמת חיבור מעורבת;
• תסמונת סיוגרן ומחלות נלוות;
• סקלרודרמה מפוזרת ומקומית, תסמונת CREST;
• מיופתיות דלקתיות (פולימיוזיטיס ודרמטומיוזיטיס);
• דלקת מפרקים כרונית לנוער;
• דלקת כבד אוטואימונית;
• שחמת מרה ראשונית וכולנגיטיס טרשתי;
• השימוש בבדיקה זו מיועד לאיתור טיטרים גבוהים של גורם אנטי-גרעיני, נוגדנים אנטי-גרעיניים, נוגדנים לאנטיגן גרעיני הניתן לחילוץ, נוגדנים ל-DNA, נוגדנים לנוקלאוזומים ונוגדנים אנטי-פוספוליפידים.

פרשנות של תוצאות

פירוש תוצאות הבדיקה מכיל מידע עבור הרופא המטפל ואינו מהווה אבחנה. אין להשתמש במידע בסעיף זה לצורך אבחון עצמי או טיפול עצמי. אבחון מדויק נעשה על ידי הרופא, תוך שימוש הן בתוצאות בדיקה זו והן במידע הדרוש ממקורות אחרים: היסטוריה, תוצאות בדיקות אחרות וכו'.

יחידות מדידה: בדיקה איכותית, התוצאה מוצגת בצורה של "זוהה" או "לא נמצאה".

כאשר מתגלה פס המאפיינת נוכחות של כל סוג של נוגדן, עוצמת הצבע של הלהקה מתוארת בנוסף לפי מספר הפלוסים ("הצלבות") עבור כל אחד מסוגי הנוגדנים שזוהו. עלייה במידת החיוביות משקפת בעקיפין את התוכן והזיקה של נוגדנים עצמיים.

ערכי התייחסות: נוגדנים ל-Sm, RNP/Sm, SS-A (60 kDa), SS-A (52 kDa), SS-B, Scl-70, PM-Scl, PCNA, CENP-B, dsDNA, היסטון, נוקלאוזום , Rib P, AMA-M2, Jo-1 לא נמצאו.

התוצאה של קביעת נוגדנים עצמיים מוצגת ב"צלבים" עבור כל אנטיגן תואם. עלייה במידת הסרו-חיוביות משקפת בעקיפין את התוכן והזיקה של נוגדנים עצמיים. אפשרויות ציון סרוחיוביות מפורטות להלן:

1. לא נמצאו נוגדנים.
2. +/- - תוצאה גבולית;
3. + - תכולה נמוכה של נוגדנים עצמיים לאנטיגן ספציפי;
4. ++ הוא התוכן הממוצע של נוגדנים עצמיים לאנטיגן ספציפי;
5. +++ - תכולה גבוהה של נוגדנים עצמיים לאנטיגן ספציפי.

המחלות העיקריות הקשורות לאיתור נוגדנים אנטי-גרעיניים:

אַנְטִיגֵן	מַשְׁמָעוּת
Sm (Smith)	סמן ספציפי לזאבת אדמנתית מערכתית (כלול בקריטריון העשירי ל-SLE של ה-American College of Rheumatology, ACR)
SS-A (Ro52)	הוא מצויין במחלות אוטואימוניות שונות, לעתים קרובות יותר בזאבת אדמנתית מערכתית ובצורות העור שלה, מחלות ראומטיות מערכתיות, דלקת מפרקים שגרונית, מחלות כבד אוטואימוניות וכו'.
SS-A (Ro60)	זאבת אריתמטית מערכתית, צורות עוריות של זאבת אדמתית, רגישות לאור בזאבת אדמנתית מערכתית, סיכון גבוה לזאבת מולדת ומחלת לב עוברית. האינדיקטור הסרולוגי העיקרי בתסמונת סיוגרן. זה מופיע לעתים קרובות יחד עם נוגדנים לאנטיגן SS-A (Ro52).
SS-B	תסמונת סיוגרן, זאבת אדמנתית מערכתית.
PCNA	זאבת אדמנתית מערכתית, סיכון לזאבת נפריטיס.
ריבוזומים (Ribo P)	זאבת אדמנתית מערכתית, סיכון לפגיעה במערכת העצבים המרכזית.
נוקלאוזומים	זאבת אדמנתית מערכתית, סיכון גבוה לזאבת גלומרולונפריטיס.
DNA גדילי כפול	סמן ספציפי של זאבת אדמנתית מערכתית (כלול בקריטריון ה-10 של SLE ACR), סיכון גבוה לדלקת זאבת.
snRNP/Sm	מחלת רקמת חיבור מעורבת, זאבת אדמנתית מערכתית עם סיכון נמוך לנזק לכליות, סקלרודרמה.
היסטונים	זאבת אדמנתית מערכתית, זאבת הנגרמת על ידי תרופות, סקלרודרמה.
Scl-70	טרשת מערכתית עם נגעים מפוזרים של העור והאיברים הפנימיים.
PM-Scl	סקלרודרמה עם פולימיוזיטיס.
CENP-B	תסמונת CREST עם סקלרודקטיליה, טלנגיאקטזיות, הסתיידויות תת עוריות, תסמונת Raynaud, esophagitis.
ג'ו-1	פולימיוזיטיס בצורה של תסמונת אנטי סינתטאז.
AMA-M2	שחמת מרה ראשונית, תסמונת סיוגרן.

ברוסיה, נכון לעכשיו, ההליך הסטנדרטי לאבחון מעבדה של זיהום HIV הוא איתור נוגדנים ל-HIVבאמצעות בדיקת אנזים אימונוואחריו אישור של הספציפיות שלהם בתגובה סיכה חיסונית.

נוגדנים ל-HIV מופיעים ב-90-95% מהנדבקים תוך 3 חודשים לאחר ההדבקה, ב-5-9% - לאחר 6 חודשים מרגע ההדבקה, וב-0.5-1% - במועד מאוחר יותר. הזמן המוקדם ביותר לגילוי נוגדנים הוא שבועיים מרגע ההדבקה.

גילוי נוגדנים ל-HIV כולל 2 שלבים. בשלב הראשוןזיהוי הספקטרום הכולל של נוגדנים נגד אנטיגנים ל-HIV מתבצע באמצעות בדיקות שונות: בדיקת אנזים אימונו, אגלוטינציה, משולב, מסרק, מסנן ממברנה או מפוזר ממברנה. בשלב השני immunoblotting משמש לקביעת נוגדנים לחלבונים בודדים של הנגיף. בעבודה, מותר להשתמש רק במערכות בדיקה בעלות הרשאה לשימוש על ידי משרד הבריאות של הפדרציה הרוסית. יש לבצע הליכי אבחון רק בהתאם להנחיות מאושרות לשימוש בבדיקות המתאימות.

דגימת דם עשוי מהווריד הקוביטלי למבחנה נקייה ויבשה בכמות של 3-5 מ"ל. ניתן לקחת דם טבורי מיילודים. את החומר המתקבל (דם מלא) לא מומלץ לאחסן יותר מ-12 שעות בטמפרטורת החדר ולמעלה מיום אחד במקרר ב-4-8 מעלות צלזיוס. ההמוליזה הקרובה עשויה להשפיע על תוצאות הניתוח. הסרום מופרד על ידי צנטריפוגה או על ידי מעקב אחר דם לאורך דופן המבחנה בעזרת פיפטה פסטר או מוט זכוכית. הסרום המופרד מועבר למבחנה נקייה (רצוי סטרילית), בקבוקון או מיכל פלסטיק, ובצורה זו ניתן לאחסן אותו עד 7 ימים בטמפרטורה של 4-8 מעלות צלזיוס. בעת העבודה יש ​​להקפיד על כללי הבטיחות הניתנים ב"הוראות על משטר אנטי-מגפה במעבדות לאבחון איידס" מס' 42-28 / 38-90 מיום 5 ביולי 1990.

קביעת סך הנוגדנים ל-HIV.

עם קבלת התוצאה החיובית הראשונה, הניתוח מתבצע 2 פעמים נוספות (עם אותו סרום ובאותה מערכת בדיקה). אם התקבלה לפחות תוצאה חיובית אחת (שתי תוצאות חיוביות מתוך שלוש בדיקות ELISA), הסרום נשלח למעבדת הייחוס.

במעבדת ההתייחסות, הסרה החיובית הראשונית (כלומר אלו שנתנו שתי תוצאות חיוביות במערכת הבדיקה הראשונה) נבדקות מחדש ב-ELISA במערכת הבדיקה השנייה (האחרת) שנבחרה לאישור.

עם קבלת תוצאה חיובית של הניתוח במערכת הבדיקה השנייה, יש לבדוק את הסרום ב-IS.

אם מתקבלת תוצאה שלילית במערכת הבדיקה השנייה, הסרום נבדק מחדש במערכת הבדיקה השלישית.

אם מתקבלת תוצאת בדיקה שלילית הן במערכת הבדיקה השנייה והשלישית, מתקבלת מסקנה על היעדר נוגדנים ל-HIV.

כאשר מתקבלת תוצאה חיובית במערכת הבדיקה השלישית, הסרום נשלח גם לניתוח בסיכה חיסונית.

סיכה חיסונית.

עיקרון השיטה הוא זיהוי נוגדנים לחלבונים מסוימים של הנגיף המקובעים על ממברנת ניטרוצלולוזה. חלבוני המעטפת (env) של HIV-1 מכונים בדרך כלל גליקופרוטאינים ("gp" או "gp"), כאשר משקלים מולקולריים מתבטאים בקילודלטון (cd): 160 kd, 120 kd, 41 kd. ב-HIV-2 לגליקופרוטאין יש משקל של 140 kd, 105 kd, 36 kd. לחלבוני ליבה (גאג) (המכונה בדרך כלל חלבונים - "p" או "r") ב-HIV-1 יש משקל מולקולרי של 55 kd, 24 kd, 17 kd, בהתאמה, ו-HIV-2 -56 kd, 26 kd , 18 קילו. לאנזימי HIV-1 (pol) משקל מולקולרי של 66 kd, 51 kd, 31 kd, HIV-2-68 kd.

תוצאות אימונובלוטינג מתפרשות כחיוביות, בלתי מוגדרות ושליליות.

חִיוּבִי(חיובי) נחשבות לדגימות שבהן מתגלים נוגדנים ל-2 או 3 גליקופרוטאין HIV.

שלילי(שלילי) הם סמים שאינם מזהים נוגדנים לאף אחד מהאנטיגנים (חלבונים) של HIV.

דגימות המזהות נוגדנים לגליקופרוטאין HIV אחד ו/או לכל אחד מחלבוני HIV נחשבות מפוקפק(לא מוגדר או בלתי ניתן לפירוש).

כאשר מתקבלת תוצאה בלתי מוגדרת עם נוגדנים לחלבוני הליבה (גאג) בכתם החיסון עם אנטיגנים של HIV-1, מתבצעת בדיקה עם אנטיגנים של HIV-2.

עם קבלת תוצאות חיוביות של ספיגת מערכת החיסון, מסקנה לגבי נוכחותם של נוגדנים ל-HIV בחומר הבדיקה.

עם קבלת תוצאת בדיקה שלילית, ה-IB מוציא מסקנה שאין נוגדנים ל-HIV.

עם קבלת תוצאה בלתי מוגדרת (אם האנטיגן p24 לא זוהה), בדיקות חוזרות לנוגדנים ל-HIV מתבצעות לאחר 3 חודשים,

ותוך שמירה על תוצאות בלתי מוגדרות לאחר 3 חודשים נוספים. אם התגלה אנטיגן p24, בדיקה שנייה מתבצעת שבועיים לאחר קבלת התוצאה הבלתי מוגדרת הראשונה.

אם, 6 חודשים לאחר הבדיקה הראשונה, שוב מתקבלות תוצאות בלתי מוגדרות, ולמטופל אין גורמי סיכון לזיהום ותסמינים קליניים של הדבקה ב-HIV, התוצאה נחשבת חיובית כוזבת. (אם קיימות אינדיקציות אפידמיולוגיות וקליניות, מחקרים סרולוגיים חוזרים על עצמם כפי שנקבע).

סופג חיסון באמצעות פוליפפטידים ספציפיים לווירוס רקומביננטי "HIV blot" שונה בכך שהוא אינו משתמש בחלבונים הנגיפיים עצמם, אלא בפוליפפטידים רקומביננטיים - אנלוגים לאנטיגנים של HIV ("Env1", "Gag1", "Poll", "Env2"). הפוליפפטיד הרקומביננטי Env1 מזהה נוגדנים ישירות ל-HIV-1 gp120 ו-gp41, הפוליפפטיד Gag1 לאנטיגנים p17 ו-p24, הפוליפפטיד Po11 לאנטיגן p51, הפוליפפטיד Env2 לאנטיגנים HIV-2 gp110 ו-gp38. הסרום נחשב חיובי אם הוא מגיב עם Env1 או Env2 או שניהם עם Env (זיהום כפול מסוג HIV מסוג 1 ו-2). תגובה עם Poll ו-Gag בלבד נחשבת לתוצאה בלתי מוגדרת, ובמקרה זה המעקב מתבצע בדומה למקרים של תוצאות בלתי מוגדרות של אימונובלוט קלאסי באמצעות lysate HIV.

הייחודיות של אבחנה סרולוגית של זיהום ב-HIV בילדים שנולדו מאמהות נגועות ב-HIV היא שלילדים נגועים ולא-נגועים ב-6-12 החודשים הראשונים לחייהם יש נוגדנים ל-HIV ממקור אימהי, אשר יכולים להיעלם. הקריטריון המצביע על נוכחות של זיהום ב-HIV בילד הוא זיהוי של נוגדנים ל-HIV בגיל 18 חודשים ומעלה. היעדר נוגדנים ל-HIV בילד בן 18 חודשים שנולד לאם נגועה ב-HIV הוא קריטריון נגד הדבקה ב-HIV.

על פי המלצת WHO, אימונובלוטינג (Western blot) משמש באבחון של זיהום ב-HIV כשיטה נוספת של מומחה, שאמורה לאשר את תוצאות ה-ELISA. בדרך כלל משתמשים בשיטה זו כדי לבדוק פעמיים תוצאת ELISA חיובית, מכיוון שהיא נחשבת רגישה וספציפית יותר, אם כי מורכבת ויקרה יותר.

Immunoblotting משלב בדיקת אנזים אימונו (ELISA) עם הפרדה אלקטרופורטית ראשונית של חלבוני וירוס בג'ל והעברתם לממברנת ניטרוצלולוזה. הליך האימונובלוט מורכב ממספר שלבים (איור 27). ראשית, מטוהר מראש והושמד למרכיביו המרכיבים, HIV נתון לאלקטרופורזה, בעוד שכל האנטיגנים המרכיבים את הנגיף מופרדים לפי משקל מולקולרי. לאחר מכן, באמצעות סופג, האנטיגנים מועברים מהג'ל לרצועה של ניטרוצלולוזה או מסנן ניילון, המכילים כעת ספקטרום של חלבונים האופייניים ל-HIV, בלתי נראה לעין. לאחר מכן, מורחים על הרצועה את חומר הבדיקה (סרום, פלזמה של המטופל וכו', ובמידה ויש בדגימה נוגדנים ספציפיים הם נקשרים לרצועות חלבוני האנטיגן התואמות אותם בהחלט. כתוצאה ממניפולציות עוקבות (כמו ELISA), תוצאת האינטראקציה הזו מוצגת - הופכת לגלויה. נוכחות של פסים באזורים מסוימים של הרצועה מאשרת את נוכחותם של נוגדנים בסרום הנחקר לאנטיגנים של HIV מוגדרים בקפדנות.

אימונובלוטינג משמש לרוב כדי לאשר את האבחנה של זיהום ב-HIV. ארגון הבריאות העולמי רואה סרה חיובית אם מתגלים נוגדנים לכל שניים מחלבוני מעטפת ה-HIV על ידי אימונובלוטינג. על פי המלצות אלו, אם יש תגובה רק עם אחד מחלבוני המעטפת (