Molekulinė diagnostika naudojant PGR metodą. Kas yra PGR diagnostika? Kokias ligas tai lemia? Kaip vyksta procedūra?

PGR analizė – kas tai? Tai efektyvus molekulinės biologijos metodas, naudojamas kartu su tradiciniais imunologiniais, morfologiniais ir biocheminiais tyrimais. Infekcinės ligos vystosi ir vystosi, kaip ir pati žmonija. Kasmet jų daugėja, o diagnozuoti darosi vis sunkiau. Veiksniai, provokuojantys ligų atsiradimą ir įtakojantys jų vystymąsi, taip pat palaipsniui prisitaiko prie aplinkinių išorinių sąlygų, kinta kartu su jomis. Dėl šios priežasties medicinoje pradėjo atsirasti naujų metodų ir technologijų, padedančių gauti tikslesnius rezultatus diagnozuojant tam tikrą ligą.

Šis laboratorinės infekcinių ligų diagnostikos metodas pagrįstas gydytojo įtarimo tyrimo medžiagoje nustačius infekcijos sukėlėją. Polimerazės grandininė reakcija juos identifikuos, nustatydama atitinkamą genetinę medžiagą (RNR arba DNR) mėginiuose, paimtuose iš paciento.

PGR išrado amerikiečių mokslininkas Kary Mullis 1983 m.

Dauguma infekcijų, jei jos nustatomos anksti, yra gerai išgydomos. Štai kodėl PGR metodas yra toks efektyvus, nes jis gali aptikti net virusus ar bakterijas, kurių ląstelės yra pavienės medžiagoje. Be to, tokia diagnozė identifikuoja virusą, nustato jo išvaizdos pobūdį, jėgą, kuria jis veikia kūną, net mikrobų skaičių paciento organizme. Gydytojas galės panaudoti visą polimerazės grandininės reakcijos metodu gautą informaciją, parinkti tinkamus vaistus ir paskirti tinkamą gydymą.

PGR tyrimas

Pagal patį veikimo principą viskas vyksta gana paprastai. Iš paciento paimta biologinė medžiaga dedama į specialų reaktorių. Tada ten pridedami specifiniai fermentai, galintys susisiekti su medžiagoje esančio mikrobo DNR ir susintetinti jo kopiją.

Kopijavimas pagrįstas grandininės reakcijos principu. Tai reiškia, kad visam procesui reikės kelių etapų. Iš pradžių 1 DNR molekulė suformuoja 2 naujas molekules, vėliau iš jų padaromos 4 naujos ir taip iki šimtų ir tūkstančių kopijų. Po to bus atlikta analizė ir dekodavimas.

Mikrobų DNR fragmentai gali būti įvairiose biologinėse medžiagose:

biologiniuose skysčiuose (seilėse, sąnarių skystyje, vaisiaus vandenyse, pleuros skystyje, smegenų skystyje, prostatos sultyse);
kraujyje ir serume, plazmoje;
epitelio ląstelių grandymo metu (grandant iš gimdos kaklelio kanalo, iš šlaplės - tiek moterims, tiek vyrams);
šlapime (rytinis šlapimas, ty pirmoji jo dalis, bus reikalinga analizei);
skrepliuose;
gleivėse ir kitose biologinėse išskyrose;
skrandžio ir dvylikapirštės žarnos biopatijose.

Kokias ligas galima nustatyti PGR?

Gydytojai tokio tipo diagnozę laiko viena tiksliausių. Šis tyrimas leidžia aptikti beveik visas šiuo metu medicinai žinomas virusines ligas. Labai svarbus aspektas yra tai, kad tarp jų yra infekcijų, kurios žmogaus organizme gyvena ilgus metus, niekaip nepasireikšdamos. Jie tiesiog auga laukdami, kada jiems bus patogiausia pasireikšti (sumažėjęs imunitetas, išsekęs organizmas ir pan.). Tokių latentinių infekcijų nustatymas ypač svarbus urologinėje ir ginekologinėje srityse.

Štai keletas ligų, kurioms dažnai atliekama polimerazės grandininės reakcijos analizė:

hepatitas B ir C;
daugelis lytiniu keliu plintančių ligų (chlamidiozė, ureaplazmozė, mikoplazmozė, lytinių organų kandidozė, bakterinė vaginozė, trichomonozė, infekcinė mononukleozė, papilomos viruso infekcija (ŽPV), AIDS ir kt.);
herpeso infekcija (įskaitant lytinių organų pūslelinę);
tuberkuliozė ir helikobakteriozė.

PGR metodas duoda gerų rezultatų, nes dauguma šių ligų pasižymi tuo, kad jų simptomai (ypač ankstyvoje stadijoje) nėra itin pastebimi. Tačiau jų pasekmės organizmui yra labai neigiamos ir dažnai labai pavojingos sveikatai ir net gyvybei.

Pavyzdžiui, lytiniu keliu plintančios ligos gali žymiai padidinti moterų gimdos kaklelio vėžio riziką, neigiamai paveikti nėštumą ar sukelti nevaisingumą. Be to, jos negimusio kūdikio sveikata priklauso nuo motinos sveikatos. Todėl labai svarbu, esant menkiausiam įtarimui dėl paslėptų infekcijų, laiku paaukoti kraują diagnostikai, kad vaisius neužsikrėstų prasiskverbus patogenams. Vyrams pasekmės ne mažiau neigiamos: sumažėjęs spermatozoidų judrumas ir gyvybingumas, išsivystęs vyrų nevaisingumas ir prostatitas, pažeidžiama šlaplė ir kt.

Tokia analizė labai aktuali ir norint laiku nustatyti virusinį hepatitą, tuberkuliozę, įvairias žarnyno infekcijas. Kai reikia nedelsiant gydyti, labai svarbu suprasti, koks patogenas paveikė organizmą ir su kuo reikia kovoti. Paciento kraujas ar bet kuri kita biologinė medžiaga padės atlikti išsamią ir teisingą diagnozę bei paskirs gydymą, kuris padės greitai atkurti organizmo funkcijas ir paskatins sveikimą.

Herpes taip pat yra labai patvarus ir pavojingas. Iš neaktyvaus režimo jis gali lengvai pereiti į progresuojančią, pažeidžiančią centrinę nervų sistemą, įtakojančią tokių baisių ligų, kaip meningitas ir encefalitas, atsiradimą ir vystymąsi.

Analizės stenograma

Atlikę tyrimą galite gauti teigiamą arba neigiamą rezultatą. Būtent teigiami rezultatai parodys, kad jūsų organizme yra ta ar kita infekcija. Neigiamas rezultatas reiškia, kad paciento kūne nėra įtariamos infekcijos. Tai yra, tyrimams pateiktoje biologinėje medžiagoje nieko nerasta.

Bet kokius rodiklius turi iššifruoti ir jums pranešti gydytojas. Nesijaudinkite ir nebijokite blogų rezultatų, nes reakcija atskleidė ligą, o tai reiškia, kad po papildomų tyrimų gydytojas galės skirti visavertį gydymą. Svarbiausia nesigydyti savimi ir neatidėti proceso.

Pasiruošimas analizei: ką reikia žinoti?

Norint nustatyti įvairias ligas, reikės skirtingų biologinių medžiagų. Prieš atlikdami PGR, būtinai pasikonsultuokite su atitinkamu specialistu ir atidžiai pasiruoškite būsimai procedūrai.

Norėdami tai padaryti, turėsite griežtai laikytis visų gydytojo rekomendacijų ir nurodymų. Atminkite, kad kraujas dažniausiai imamas tuščiu skrandžiu. Norint paimti tepinėlį iš makšties ar šlaplės, reikia 1-2 dienas susilaikyti nuo lytinių santykių, vakare atlikti visas būtinas lytinių organų higienas, o ryte tik nuplauti šiltu vandeniu. Taip pat svarbu nustoti vartoti vaistus maždaug savaitei, nebent nurodė gydytojas. O 2-3 valandas prieš darydami tyrimą nesišlapinkite. Moterims verta manyti, kad optimalus laikas atlikti tyrimą yra kelios dienos prieš menstruacijas arba iškart po jų.

PGR metodas: pagrindiniai privalumai ir trūkumai

Šio tipo diagnozė turi daug privalumų.

Pirma, bet kokie infekcinių ligų sukėlėjai nustatomi tiesiogiai nurodant juos, priešingai nei kiti tradiciniai laboratoriniai tyrimai.

Antra, ši analizė yra tiesiog universali, nes jai įgyvendinti yra prieinamos beveik visos biologinės medžiagos, kurios dažnai nėra priimtinos jokiam kitam tyrimo metodui.

Labai svarbus momentas yra tai, kad atliekant šią diagnozę, tiriamoje medžiagoje išskiriamas DNR fragmentas, kuris bus būdingas tik konkrečiam patogenui, tai yra labai specifiniam virusui ar bakterijoms. Tai rodo, kokia specifinė ši reakcija.

Kitas argumentas šios diagnozės naudai bus didelis jos atlikimo greitis. Jei bet kokiems kultūros tyrimams patogenui išskirti ir auginti ląstelių kultūroje reikia ne dienų, o net savaičių, tai šis metodas leis gauti rezultatus per 4-5 valandas.

PGR leidžia aptikti ne tik infekciją, kuri jau yra pasiekusi ligos pikas, bet ir lėtines ligas, bet kokius pavienius virusus ar bakterijas. Ši diagnozė įmanoma dėl labai didelio metodo jautrumo. Tai taip pat turėtų apimti faktą, kad infekcija bus aptikta, net jei analizei pateiktoje biologinėje medžiagoje yra tik viena konkretaus viruso ar bakterijos ląstelė.

Reakcija į klaidingai neigiamus rezultatus yra labai reta.

Tiesa, metodas turi ir trūkumų. Vienas iš jų yra galimybė gauti klaidingai teigiamą rezultatą. Taip dažnai nutinka dėl to, kad infekcija jau buvo nužudyta, tačiau jos epitelio ląstelės dar nėra atnaujintos, todėl reakcija vis tiek matys savo negyvas palaikus ir ją klonuotų. Todėl reikėtų arba palaukti, kol negyvos infekcijos ląstelės visiškai pasišalins iš organizmo (po mėnesio iki dviejų po gydymo), arba ankstyvoje stadijoje naudoti kitus metodus: sėti ar pasėti. Vėliau bus galima atlikti kontrolę naudojant PGR.

Kitas analizės trūkumas yra visų mikroorganizmų kintamumas. Tai reiškia, kad kai kurių genotipų patogenų, kurie jau mutavo organizme, bandymo sistema nepastebės ir nebus jokios reakcijos. Šiuo tikslu vykdomi įvairūs šio metodo tobulinimo darbai.

Žmonės pirmą kartą pradėjo kalbėti apie PGR analizę 1983 m. Šią techniką sukūrė Kary Mullis ir jo laboratorijos nariai. Nuo tada tyrimo populiarumas nuolat auga, nes ji turi daug privalumų prieš kitus metodus.

Šiandien PGR diagnostika yra etalonas arba standartas nustatant infekcijas ir patogenus, ypač tuos, kurie yra besimptomiai. Visų pirma, tai yra ikiklinikinė diagnostika.

Analizės atlikimas PGR aparatu

PGR analizės esmė ta, kad mėgintuvėlyje klonuojamos (daug kartų padidinamos) tam tikro tipo patogenui būdingos nukleorūgščių sekos (DNR arba RNR).

Santrumpa PCR reiškia polimerazės grandininę reakciją.

Pagrindinis šio metodo skiriamasis bruožas yra amplifikacija, t.y. sukuriant daugybę reikiamo geno ar jo fragmento kopijų. Visa tai gaminama už kūno ribų, t.y. in vitro.

Taigi, jei atliekama 20 PGR ciklų, gaunama maždaug 1 milijonas ar daugiau kopijų. Tai leidžia aptikti infekciją net tada, kai jos kiekis pirminėje medžiagoje yra nereikšmingas, kai kiti analizės metodai yra bejėgiai. Tai lemia didelį šio metodo jautrumą.

Paprastais žodžiais tariant, galima nupiešti tokią analogiją: ant grindų nepastebėsite vieno mažo smėlio grūdelio, bet padidinus smėlio grūdelių skaičių milijoną kartų (PGR), smėlio krūva jau bus aiškiai matoma. .

Pagrindiniai infekcijų tyrimo naudojant PGR metodą pranašumai yra šie:

didžiausias jautrumas ir specifiškumas, palyginti su kitais infekcijos sukėlėjų aptikimo metodais;
gebėjimas aptikti mikroorganizmus įvairiose biologinėse medžiagose (kraujyje, šlapime, makšties sekrete, seilėse ir kt.);
galimybė vienu metu nustatyti kelis sukėlėjus mikroorganizmus, jei tokių yra. Palyginimui, bakteriologinių metodų naudojimas tokios galimybės nesuteikia, nes įvairiems patogeniniams mikrobams auginti būtina naudoti skirtingas terpes;
galimybė transportuoti biologinę medžiagą, nes Norint nustatyti patogeną, nebūtina jo išlaikyti gyvą;
analizės greitis;
etiologinės diagnozės tikslumas;
galimybė kiekybiškai nustatyti patogenus – ypač svarbu oportunistiniams mikrobams, kurie tik pasiekę tam tikrą koncentraciją gali sukelti ligą;
gebėjimas kontroliuoti infekcinio proceso eigą gydymo metu.

PGR analizė infekcijoms nustatyti

Šiuo metu dauguma lytiškai plintančių (ir kitų) infekcinių ligų nustatomos polimerazės grandininės reakcijos metodu. Diagnostika tapo plačiai paplitusi dėl didelio jautrumo ir specifiškumo.

Chlamidijų PGR analizė yra ypač populiari.

Taip yra dėl to, kad šie mikroorganizmai gyvena tarpląstelėje, o tai sukelia tam tikrų sunkumų juos aptikti.

PGR diagnostika leidžia aptikti net minimalų chlamidijų kiekį, kuris, kaip taisyklė, dar nesukelia klinikinių simptomų. Net jei tiriamojoje medžiagoje yra tik 2 nukleorūgščių molekulės, galima nustatyti sukėlėją.

Ir tai yra raktas į sėkmingą gydymą, kuris prasideda ikiklinikinėje stadijoje.

Taip pat nustatomos infekcijos:

virusinis hepatitas;
tuberkuliozė;
erkinio encefalito;
įvairios lytiniu keliu plintančios ligos ir kt.

PGR diagnostika leidžia išspręsti daugybę kitų svarbių problemų:

stebėti terapiją ir įvertinti jos efektyvumą;
„viruso krūvio“ nustatymas, pagal kurį parenkama individuali vaisto dozė;
farmakologiškai atsparių (nejautrių vaistams) mikroorganizmų padermių nustatymas.

Pasiruošimas testui

Nereikia specialiai ruoštis tyrimui, kuris bus atliekamas naudojant PGR metodą. Tačiau labai svarbu, kad specialistas surinktų medžiagą laikydamasis visų būtinų sterilumo sąlygų.

Taigi, pavyzdžiui, kraujui paimti reikia naudoti specialias vakuumines sistemas, lytinių organų sekretams paimti specialius vamzdelius ir pan.

Kai kuriais atvejais medžiaga turi būti gabenama į laboratoriją. Norint tai padaryti teisingai, būtina hermetiškai uždaryti talpyklą biologine medžiaga. Taip bus išvengta kitų išorinėje aplinkoje gyvenančių mikroorganizmų prasiskverbimo.

PGR analizės rezultatai gali būti dviejų variantų:

teigiamas – aptiktas patogenas;
neigiamas – sukėlėjas nenustatytas.

Turėtumėte žinoti, kad net nesant klinikinių simptomų galima gauti teigiamą rezultatą.

Šiuo atveju būtina sutelkti dėmesį į polimerazės reakcijos duomenis, nes tai leidžia nustatyti ligą ikiklinikinėje stadijoje.

Kartais galima gauti abejotiną atsakymą, kai aptiktų kopijų skaičius atitinka viršutinę normos ribą. Norint išsiaiškinti ligos priežastį, analizė turėtų būti kartojama, ypatingą dėmesį skiriant biologinės medžiagos rinkimo sąlygoms.

Kiek tiksli yra PGR diagnostika?

Pagrindiniai PGR diagnostikos pranašumai gali būti suformuluoti kelių tezių forma:

galimybė gauti daugybę patogeninių mikroorganizmų kopijų;
didelis kopijų skaičius yra raktas į sėkmingą seką (aptikimą).

Tai užtikrina aukštą PGR analizės tikslumą, kad būtų galima aptikti tarpląstelinius patogenus ir lėtai augančius mikroorganizmus.

Todėl metodas yra ypač informatyvus nustatant tuberkuliozės mikobakterijas ir kitus panašius infekcinius sukėlėjus. Jis pasižymi didžiausiu tikslumu ir nereikia dar kartą tikrinti gautų rezultatų (išskyrus atsitiktinius atvejus).

Norint gauti patikimiausius rezultatus, būtina įvykdyti dvi pagrindines sąlygas, kurios užkerta kelią egzogeninei (išorinei) infekcijai:

teisingas medžiagos pasirinkimas;
teisingas transportavimas.

Turinys

Tie, kurie domisi naujais diagnostikos metodais, turėtų pasidomėti, kas yra PGR metodas. Šiuolaikinės techninės galimybės laboratorinių tyrimų srityje suteikia galimybę daugelį ligų aptikti pradinėse stadijose. Polimerazės grandininė reakcija (PGR) šiuo metu laikoma tiksliausiu ir nauju metodu.

PGR analizė

PGR analizė – kas tai? Šis metodas naudoja molekulinės biologijos principus. Medžiagai tirti naudojami specialūs fermentai, kurie pakartotinai ir greitai kopijuoja patogenų DNR ir RNR fragmentus. Priklausomai nuo tiriamos medžiagos (kraujo, šlapimo, išmatų ir kt.), yra įvairių PGR analizės tipų. Po apdorojimo laboratorijos darbuotojai gautą rezultatą palygina su duomenų baze, nustato patogeno koncentraciją ir tipą.

PGR analizė dedama į specialų ciklerį (įrenginį), kuris šildo ir aušina mėgintuvėlius su biomedžiaga. Fragmentų replikacijai būtini temperatūros pokyčiai. Rezultato tikslumas priklausys nuo temperatūros režimo tikslumo. Polimerazės grandininės reakcijos metodas padeda nustatyti:

infekcinė mononukleozė;
citomegalovirusinė infekcija;
virusinis hepatitas G, C, B, A;
lytiniu keliu plintančios infekcijos/ligos (LPI/LPL): gardnereliozė, trichomonozė, ureaplazmozė;
herpeso infekcija;
onkogeniniai virusai;
listeriozė;
Helicobacter pylori infekcija;
erkinis encefalitas, boreliozė;
tuberkuliozė;
kandidozė.

Kraujas

Šiuo metu dėl technologijos naujumo PGR kraujo tyrimas vis dar turi didelę kainą. Norint paruošti biomedžiagą, nereikia atitikti tam tikrų reikalavimų. Netgi sudėties pokyčiai, kuriuos sukelia fizinis aktyvumas, stresas ar mitybos pokyčiai, neturi įtakos tyrimo rezultatams. PGR kraujo tyrimas gali būti sugadintas tik vartojant antibakterines medžiagas, todėl prieš atlikdami tyrimą turite padaryti pertrauką tarp gydymo ir tyrimo.

PGR kraujo tyrimas yra labiausiai paplitęs būdas diagnozuoti lėtines, ūmias infekcines patologijas su virusinėmis ar netipinėmis apraiškomis. Serologinių tyrimų metodai turi tam tikrų sunkumų juos įgyvendinant – patogeno buvimą lemia antikūnų buvimas žmogaus organizme. Rezultatas gali būti klaidingai neigiamas, jei paciento būklė neleido jiems vystytis.

tepinėlis

Ginekologijos srityje PGR tepinėlio analizė naudojama infekcinių mikroorganizmų buvimui tirti. Darbas su medžiaga vykdomas pagal tą patį principą kaip ir su krauju: daugkartinis patogeno DNR fragmentų padidinimas, siekiant lengvai jį identifikuoti. Tai taip pat padeda aptikti paslėptas moters infekcijas. Analizei galima paimti įvairių biologinių skysčių: seilių, skreplių, šlapimo, kraujo. Ginekologijoje, norint tiksliai nustatyti, dažnai naudojamas tepinėlis iš makšties gleivinės iš gimdos kaklelio kanalo.

Yra tam tikrų PGR atlikimo indikacijų. Dažnai tai reikia padaryti siekiant nustatyti antibiotikams atsparų patogeną. Moterims pagrindinės indikacijos diagnozuoti naudojant šį metodą yra šios:

sunkus nėštumas;
ūminė LPI fazė;
jei yra įtarimas, kad LPI perėjo į lėtinę stadiją;
ieškant nevaisingumo priežasčių.

Kala

Norėdami nustatyti infekciją, gydytojas gali paskirti PGR išmatų tyrimą. Kad po tyrimo gautumėte patikimiausius rezultatus, prieš rinkdami biomedžiagą, turite laikytis šių taisyklių:

prieš kelias dienas nustokite vartoti vidurius laisvinančius vaistus: aliejus, žvakutes;
neįtraukti vaistų, kurie suteikia išmatoms specifinę spalvą, pavyzdžiui, kurių sudėtyje yra geležies.

Šlapimas

Jei reikia, gydytojas gali paimti šlapimą tyrimui. Didelis tikslumas atveria galimybę dirbti su bet kokiu biologiniu skysčiu, iš kurio galima išskirti virusinę DNR. Norėdami atlikti PGR šlapimo tyrimą, prieš rinkdami medžiagą turite laikytis šių apribojimų:

nutraukti lytinius santykius likus bent 1 dienai iki procedūros;
Likus 3 savaitėms iki tyrimo, bet koks antibakterinis gydymas turi būti baigtas, nes vaistai sugadins vaizdą;
Testą reikia atlikti tuščiu skrandžiu (skysčiai taip pat draudžiami);
Turite paimti pirmąją rytinę medžiagos dalį.

PGR tyrimo rezultatai

Iš to, kas išdėstyta aukščiau, aišku, kas yra PGR analizė, ir matomi aiškūs šio tyrimo metodo pranašumai. Kitas šios diagnostikos procedūros privalumas yra rezultatų iššifravimo paprastumas. Atsižvelgiant į tai, kiek laiko užtrunka PGR analizė (pats procesas trunka apie 5 valandas, bet laboratorija duomenis pateikia per 1-2 dienas), šis diagnostikos metodas tampa geriausiu pasirinkimu daugeliui infekcijų identifikuoti. Remdamasis rezultatais, gydytojas gali pasakyti, kad tyrimas:

Neigiamas – tiriamojoje medžiagoje nebuvo norimo patogeno.
Teigiama – rasta patogeno RNR ir DNR.

Kartais atliekamas kiekybinis mikroorganizmų nustatymas. Tai būtina ligoms, kurias sukelia oportunistiniai patogenai. Šių virusų ypatumas yra tas, kad jų atsiranda tik pertekliniai kiekiai, o juos rasti atliekant įprastinius tyrimus yra nepaprastai sunku. Šis veiksnys svarbus pasirenkant terapinę taktiką veiksmingai gydyti virusines infekcijas, pavyzdžiui, hepatitą, ŽIV.

12 infekcijų

Norint visiškai suprasti, kas yra infekcijų PGR diagnostika ir kiek ji efektyvi, reikia žinoti, kad ji gali išskirti iki 12 patogenų. Tekstas atliekamas tik laboratorinėmis sąlygomis. Tyrimams naudojami specialūs fermentai, kurie daug kartų padidina viruso RNR ir DNR fragmentų kiekį. 12 infekcijų PGR analizė gali aptikti:

Mycobacterium tuberculosis;
citomegalovirusas;
hepatitas C, G, B, A;
herpes 1, 2 tipai;
Epstein-Barr virusas (infekcinė mononukleozė);
lytiniu keliu plintančios infekcijos, pavyzdžiui, chlamidijos;
listeriozė;
Candida infekcija;
Helicobacter pylori;
boreliozės, erkinio encefalito.

Dėl hepatito C

Šis diagnostikos metodas padeda nustatyti viruso buvimą kraujyje. Tai suteikia gydytojams galimybę kalbėti apie jo buvimą ar nebuvimą. Yra dviejų tipų hepatito C PGR analizė: kokybinė ir kiekybinė. Pirmoji parinktis nurodo tik jos buvimą ir gali turėti formulę „aptikta“ / „neaptikta“. Šio tipo testų jautrumas yra 10-500 IU/ml. Tai rodo, kad jei patogeno kiekis organizme yra mažas, analizė nebus „aptikta“.

Kiekybinė analizė yra tikslesnė ir parodys infekcijos koncentraciją kraujyje. Šis rodiklis vadinamas „virusine apkrova“ ir matuojamas viruso RNR kiekiu konkrečiame kraujo tūryje. Dekodavimas įvairiose laboratorijose gali skirtis. Be IU/ml matavimo, naudojami „kopijos“ vienetai. Galite suskaičiuoti kopijas vienam TV, naudodami formulę: 1 TV = 4 kopijos. Jei viruso buvimo dekodavimo vertė viršija 800 000 TV/ml (arba 800*103), tai rodo didelį patogeno kiekį.

Dėl tuberkuliozės

Tyrimas turi būti atliktas ryte. Tai svarbu, kad iš skrandžio nepatektų visa per naktį susidariusi skreplių masė. Tuberkuliozės PGR analizė yra tokia pat svarbi kaip ELISA, Mantoux ir tomografija. Tyrimas padeda nustatyti mikobakterijų buvimą, šlapimo būklę, bendrą imunoglobulino kiekį, AKS, nustatyti plaučių būklę šiuo metu. Siekiant užtikrinti tikslius rezultatus analizuojant PGR, ji turi būti atliekama laikantis šių taisyklių:

Sėjama 3 kartus, tačiau visiškas skrandžio turinio aspiravimas turėtų būti atliekamas tik ligoninėje.
Mažiau nei 50% diagnozių mikobakterijos aptinkamos išauginus skrandyje esamas mases. Net ir susidarius optimalioms sąlygoms, vietoj to rekomenduojama atlikti ultragarsą.
Net jei rezultatas yra neigiamas, negalima visiškai atmesti galimybės susirgti tuberkulioze su ESR, imunoglobulino ar kitų rodiklių pokyčiais.
Medžiagų kultūra PGR metu yra mažiau jautri patologinėms sąlygoms, jei ji gaunama atliekant bronchoskopinį tyrimą, o tai atmeta įtarimą dėl TB vaikui.

Dėl ŽIV

Daugeliui žmonių ši diagnozė laikoma mirties nuosprendžiu. Dėl šios priežasties po dažnų lytinių santykių žmogus tampa dėmesingesnis signalams, kuriuos jo kūnas duoda (o kartais ir sugalvoja). Patikimiausias būdas gauti patvirtinimą ar paneigti šią ligą yra PGR tyrimas dėl ŽIV. Testas gali būti naudojamas siekiant nustatyti šias galimas sveikatos problemas:

ŽIV buvimo seronegatyviuoju laikotarpiu paneigimas / patvirtinimas.
ŽIV-1, ŽIV-2 genotipo nustatymas.
Patologinio proceso aprašymo patikslinimas esant abejotiniems imunobloto rezultatams.
Infekcija po kraujo perpylimo.
ŽIV statuso nustatymas vaikams, gimusiems motinoms, kurios yra ligos nešiotojai.
Padeda stebėti organizmo virusų kiekį.

Dėl ŽPV

Papilomos virusą galima aptikti kiekvienam žmogui, jis gali ilgai išlikti latentinis. Vystymąsi provokuoja susilpnėjęs imunitetas, stresas ar emociniai protrūkiai. ŽPV PGR tyrimas padeda nustatyti viruso koncentraciją kraujyje. Dėl šios priežasties rekomenduojama atlikti kiekybinius, o ne kokybinius sprendimus. Šie duomenys padės numatyti piktybinės infekcijos tikimybę.

ŽPV buvimo diagnozavimo metodas pagrįstas pagrindine PGR savybe išskirti viruso DNR iš medžiagos. Dėl didelio tyrimo jautrumo bus aptikti net nedideli bakterijų kiekiai. Kiekybiniai tyrimai suteikia gydytojams galimybę nustatyti ligos pavojingumo laipsnį ir numatyti ateities prognozę. Ši diagnozė yra privaloma visiems vyrams ir moterims, kurie atrado kondilomas. Kiekybinė PGR analizė padės nustatyti, kas sukėlė ŽPV vystymąsi: laikinas imuniteto sumažėjimas ar lėtinė liga.

Dėl herpeso

Šio tipo mikrobiologijos diagnostika padeda labai tiksliai atlikti PGR analizę dėl herpeso. Viruso DNR fragmentų kopijavimas įvyks tik tuo atveju, jei medžiagoje yra norimas genas. Tokiu atveju tyrimo rezultatai gali rodyti patogeno buvimą ar nebuvimą. Jį galima aptikti net esant mažoms koncentracijoms kraujyje.

Kitas PGR tyrimo privalumas yra tai, kad jis gali aptikti herpeso virusinę infekciją iš karto po užsikrėtimo, dar nepasireiškus klinikiniams simptomams. Galite nustatyti pūslelinės tipą (1 arba 2); tyrimui atlikti nereikia specialaus pasiruošimo, tačiau gydytojai rekomenduoja prieš paimant kraują atsisakyti:

keptas;
ūminis;
alkoholis;
riebalų.

Nėštumo metu

Nešiojant vaiką labai svarbu atlikti šį tyrimą, kad būtų užregistruota moters būklė. PGR analizė nėštumo metu yra įtraukta į efektyviausių įvairių ligų nustatymo metodų sąrašą. Tyrimas reikalingas ne tik patologijoms nustatyti, bet ir vaiko užsikrėtimo gimdoje tikimybei nustatyti. Tik PGR diagnostikos dėka tapo įmanoma nustatyti daugelio infekcijų gimdos viduje progresavimo laipsnį ir vystymąsi.

PGR testų priėmimas

Jei jums įdomu, kaip atliekama PGR analizė, reikėtų apsvarstyti kiekvieną atskirą atvejį, atsižvelgiant į biomedžiagos tipą. Šveitimas, tepinėlis ar kraujo paėmimas turi savo ypatybes, pavyzdžiui:

plazma dovanojama ryte;
šlapimas imamas tik iš pradžių ryte, laboratorinėmis sąlygomis steriliame inde;
tepinėlis ar įbrėžimas bus orientacinis tik susilaikius nuo lytinių santykių ne trumpiau kaip 3 dienas;
Jūs negalite imti tepinėlio menstruacijų metu ir 2 dienas po jų.

Kur atlikti PGR tyrimą

Šio tipo tyrimai susiję su šiuolaikiniais ir aukštųjų technologijų diagnostikos metodais. Tyrimai, naudojant PGR metodą, turėtų būti atliekami laboratorijose, kuriose yra visa reikalinga įranga norint gauti pilnus rezultatus. Kvalifikuotas ir apmokytas personalas atlieka ne mažiau svarbų vaidmenį. Pirmenybę teikite didelėms, rimtoms, gerai žinomoms laboratorijoms. Tai ne tik padės greitai pasiekti rezultatus, bet ir užtikrins jų patikimumą.

Kaina

Kitas dažnai pacientus dominantis klausimas: kiek kainuoja PGR tyrimas? Dėl metodo naujumo ir būtinybės įsigyti brangios įrangos, testo kaina yra gana didelė. PGR kaina priklauso nuo infekcijos, dėl kurios asmuo bus tiriamas, tipo. Apytikslė testų kaina ir laikas yra tokie:

LPI bus patikrinta per 1 dieną, kaina 400-500 rublių.
Herpesas, ŽPV, Epstein-Barr virusas, citomegalovirusas nustatomi per 24 valandas, kaina – 300-500 rublių.
Hepatito analizė atliekama per 5 dienas, kokybinio varianto kaina yra 500 rublių, kiekybinė - 2000 rublių.
Helicobacter pylori aptinkamas per 24 valandas, kaina 400 rublių.
Antigenai, ŽIV antikūnai, kaina - nuo 380 rublių.
Kokybinė ŽIV RNR analizė, kaina – nuo 3500 rublių.
Kiekybinė ŽIV RNR analizė, kaina – nuo 11 000 rub.

Vaizdo įrašas

Dėmesio! Straipsnyje pateikta informacija skirta tik informaciniams tikslams. Straipsnyje pateiktos medžiagos neskatina savęs gydyti. Tik kvalifikuotas gydytojas gali nustatyti diagnozę ir pateikti gydymo rekomendacijas, atsižvelgdamas į individualias konkretaus paciento savybes.

Radote klaidą tekste? Pasirinkite jį, paspauskite Ctrl + Enter ir mes viską ištaisysime!

PGR (polimerazės grandininė reakcija) yra molekulinės biologijos pasiekimas, vienas pagrindinių XX amžiaus pabaigos ir XXI amžiaus pradžios klinikinės laboratorinės diagnostikos metodų, atnešęs didžiulę naudą įvairiose medicinos mokslo srityse.

Taigi, net jei tarp milijonų žmogaus kūno ląstelių prarandamas ne pats gyvas virusas, o tik jo DNR dalelė, PGR, jei niekas jai netrukdo, greičiausiai susidoros su užduotimi ir praneš apie buvimą. „nepažįstamojo“ su teigiamu rezultatu. Tai yra PGR esmė ir pagrindinis jos pranašumas.

Privalumai ir trūkumai

PGR diagnostiką atliekančiai laboratorijai keliami aukščiausi reikalavimai įrangai, tyrimų sistemoms ir medicinos personalo kvalifikacijai. Tai aukštųjų technologijų laboratorija, turinti itin jautrių ir labai specifinių reagentų arsenalą, todėl neturi jokių ypatingų trūkumų. Nebent tai duoda teigiamą rezultatą, nesant klinikinių apraiškų ir dėl to gydytojui kyla dilema: ar verta pradėti gydymą, ar ne?

Pacientą stebintis gydytojas pradeda abejoti tyrimo rezultatų patikimumu, nes nemato jokių ligos požymių. Tačiau vis dėlto, atsižvelgiant į didelį PGR sistemos jautrumą, reikia atsiminti, kad ji aptinka patogeną net ikiklinikinėje stadijoje, o teigiamas rezultatas šiuo atveju yra daugiau privalumas nei trūkumas. Remdamasis tuo, gydantis gydytojas pats turi nuspręsti dėl terapijos tikslingumo, atsižvelgdamas į kitus argumentus „už“ ir „prieš“.

Diagnostikos, naudojant polimerazės grandininę reakciją, pranašumai yra akivaizdūs:

Didelis specifiškumas, pasiekiantis 100 %, nes pasirinktame mėginyje yra nukleorūgščių dalelių, būdingų konkrečiam organizmui, bet svetimų žmogui;
Didelis našumas, nes PGR yra aukštųjų technologijų automatizuota technika, suteikianti galimybę tyrimus atlikti mėginio paėmimo dieną ir taip atleisti pacientą nuo nereikalingų rūpesčių;
PGR, dirbant su vienu mėginiu, gali atlikti kelis tyrimus ir aptikti kelis patogenus, jei ji turi tokią užduotį. Pavyzdžiui, diagnozuojant chlamidinę infekciją, kai PGR yra vienas pagrindinių metodų, kartu su chlamidijomis galima aptikti ir sukėlėją Neisseria (gonokoką). Be to, tai neturi neigiamos įtakos rezultatų patikimumui;
PGR tyrimas inkubaciniu laikotarpiu atskleidžia pavojingus mikroorganizmus, kai jie dar nespėjo padaryti didelės žalos organizmui, tai yra ankstyva diagnostika įspėja apie artėjantį patologinio proceso vystymąsi, o tai leidžia jam pasiruošti ir imtis visiškai pasiruošus.

Be to, siekiant išvengti nesusipratimų, kurie kartais kyla diagnostikos metu, PGR apsisaugo ir tuo, kad jos rezultatai gali būti įrašomi (nuotrauka, kompiuteris), kad prireikus būtų galima juos panaudoti ekspertiniams tikslams.

PGR atsako norma yra neigiamas rezultatas., nurodant, kad nėra svetimų nukleorūgščių fragmentų, teigiamas atsakymas parodys, kad organizme yra infekcija, skaitmeninės reikšmės rodo viruso būklę ir jo koncentraciją tyrimo metu. Tačiau išsamų analizės aiškinimą atlieka gydytojas, praėjęs specialų mokymą tema „PGR“. Nėra prasmės bandyti interpretuoti rezultatus patiems, nes galite, kaip greičiausiai, klaidingai suprasti ir pradėti nerimauti iš anksto.

Ko PGR „bijo“, ką jis gali padaryti ir kaip jai pasiruošti?

Kaip ir atliekant bet kurį kitą tyrimą, kartais tyrimo rezultatai būna klaidingai teigiami arba klaidingai neigiami, kur PGR nėra išimtis. Tai gali atsitikti šiais atvejais:

Technologinio proceso pažeidimai viename iš reakcijos etapų;
Medžiagos surinkimo, saugojimo ar transportavimo taisyklių nesilaikymas;
Pašalinių priemaišų buvimas medžiagoje.

Tai rodo, kad PGR infekcijų diagnostika turi būti atliekama atsargiai, atsargiai ir tiksliai, nes priešingu atveju medžiagos mėginiai gali pakeisti savo struktūrinę struktūrą arba visiškai subyrėti.

PGR diagnostikos etapai. Klaidingus rezultatus gali sukelti pažeidimai bet kuriame tyrimo etape.

Infekcijų PGR diagnostika tarp kitų laboratorinių metodų priskiriama „auksinių standartų“ kategorijai, todėl ją galima naudoti ieškant daugelio ligų, iš pirmo žvilgsnio nieko bendro neturinčių, sukėlėjų:

Įvairių lokalizacijų tuberkuliozė, pneumonija (įskaitant netipinę, sukelta chlamidijų);
Vaikų infekcijos (tymų raudonukė, kiaulytė, tymai);
difterija;
Salmoneliozė;
Zoonozinė infekcinė liga – listeriozė (liga pasižymi įvairiais simptomais, kai pažeidžiami limfmazgiai, centrinė nervų sistema, vidaus organai);
Epstein-Barr viruso sukeltos ligos (infekcinė mononukleozė ir kt.);
Onkologinė patologija, kurią sukelia žmogaus papilomos viruso infekcija (ŽPV ir jo rūšys);
boreliozė (Laimo liga, erkinis encefalitas);
Helicobacter pylori infekcija, kurios sukėlėjas yra žmogaus skrandyje gyvenantis mikrobas Helicobacter pylori. Įrodyta, kad Helicobacter sukelia skrandžio ar dvylikapirštės žarnos vėžio vystymąsi;
ir beveik viskas.

Lytiniu keliu plintančių infekcijų PGR diagnostika yra ypač svarbi, nes tokiu būdu sukeltos ligos dažnai tęsiasi ilgą laiką be jokių klinikinių apraiškų, tačiau nėštumo metu jos pradeda suaktyvėti ir taip kelia grėsmę kūdikio sveikatai ir net gyvybei. vaikas. Jie elgiasi panašiai. Kai kurie iš jų („torch“) taip pat nurodo LPI, todėl pastarąsias reikia apsvarstyti išsamiau. Su populiariausiais metodais skaitytojas galės susipažinti kitose straipsnio dalyse.

Kaip tinkamai pasiruošti norint gauti patikimų rezultatų?

Iš karto atkreipkime dėmesį, kad pasiruošimas PGR yra gana paprastas ir nereikalauja jokių ypatingų paciento pastangų. Jums tereikia atlikti tris paprastas užduotis:

Neturėti lytinių santykių 24 valandas prieš atliekant tyrimą;
Norint paimti ir tirti kraują iš venos, reikia ateiti tuščiu skrandžiu, beje, gerti irgi negalima;
Šlapimą reikia duoti nakčiai (ryte – steriliame indelyje, pirktame prieš dieną vaistinėje).

PGR gali veikti bet kurioje biologinėje aplinkoje

PGR metodas nėra „kraujo ištroškęs“, todėl tinka bet kokiai biologinei terpei, kurioje yra įtariamas infekcinis agentas. pasirinkti, ką pasiimti tyrimams, lieka gydytojui.

Taigi, ieškant patogeno, be kraujo tyrimo (nors tai taip pat tinka ir daugeliu atvejų imamas lygiagrečiai su kita medžiaga), galite naudoti:

(išskyros iš urogenitalinio trakto);
Burnos ertmės, junginės, nosiaryklės, lytinių takų gleivinės grandymas (moterims imamas iš gimdos kaklelio ir makšties, vyrams – iš šlaplės);
Seilės;
Sperma;
Prostatos sultys;
Placentos audinys ir vaisiaus vandenys (amniono skystis);
šlapimo nuosėdos (po centrifugavimo), pavyzdžiui, kai kurioms LPI ir Mycobacterium tuberculosis aptikti;
skrepliai ir pleuros skystis tam pačiam tikslui;
Eksudatai;
Smegenų skystis, jei įtariama centrinės nervų sistemos infekcija;
Biopsijos medžiaga (bioptatas), paimta iš kepenų, dvylikapirštės žarnos, skrandžio ir kt.

Prie to, kas išdėstyta pirmiau, noriu pridurti, kad visais atvejais tyrimams medžiagos pakaks, net įbrėžimų ir išskyrų, nes tiriant PGR nereikia didelių kiekių, analizei pakanka kelių mikrolitrų, kurie dažniausiai paimami. į Eppendorf mikromėgintuvėlį ir išsiųstas tirti.tyrimą.

Ligos ir PGR naudojimas

ŽIV ir polimerazės grandininė reakcija

Paprastai atliekant anoniminį tyrimą, esant teigiamiems imunoblotingo rezultatams, diagnozė kartojama dar kartą. Jei diagnozė patvirtinama, pacientui skiriami papildomi tyrimai:

Imunologinėmis reakcijomis absoliučių CD 4 limfocitų (imunokompetentingų ląstelių – T pagalbininkų arba pagalbininkų) skaičiaus nustatymas, kurį infekcija paveikia pirmiausia, po to jie praranda savo pagrindines savybes ir negali atskirti „savęs“ ir „užsienio“. Jie klaidingai laiko kraujo plazmoje cirkuliuojančią virusinę RNR normaliomis kūno ląstelėmis ir į jas nereaguoja;
Viruso RNR aptikimas PGR metodu ir viruso dalelių koncentracijos apskaičiavimas, siekiant remiantis šiais duomenimis nustatyti patologinio proceso stadiją, sunkumą ir prognozę.. Žinoma, žodis „norma“ šiuo atžvilgiu neegzistuoja, nes reakcija visada yra teigiama, o skaitmeninių verčių iššifravimas priklauso gydytojo kompetencijai.

PGR ir hepatitas

PGR metodu galima aptikti patogenus, dažniausiai tyrimas naudojamas diagnozuoti hepatitą C, kurį kitais metodais sunku nustatyti.

Hepatito C virusas (turintis RNR) savo elgesiu žmogaus kūne primena ŽIV. Įspraustas į kepenų ląstelių (hepatocitų) genomą, jis lieka ten laukti sparnuose, o tai gali ateiti mažiausiai po 2 metų, net po 20 metų, todėl gydytojai pravardžiuoja „švelniuoju žudiku“. Dėl hepatito C kepenų parenchimoje susidaro piktybinis procesas, kuris pasireiškia vėlesnėse stadijose. Imuninė sistema nepastebi visų šių įvykių, painiodama virusą su hepatocitu. Tiesa, tam tikri kiekiai gaminami antikūnų prieš virusą, tačiau jie nesuteikia tinkamo imuninio atsako. Diagnozuojant hepatitą C ELISA nėra labai informatyvus, nes rodo, kad virusas paliko pėdsakus, tačiau ar jis savaime išnyko, nežinoma. Su HCV yra žinomi savaiminio išgydymo atvejai, o antikūnai prieš virusą išlieka ir cirkuliuoja visą gyvenimą (imunologinė atmintis). PGR pastebimai lenkia antikūnų susidarymą ir viruso dalelę gali aptikti per 1–1,5 savaitės, o antikūnai gali atsirasti nuo 2 mėnesių iki šešių mėnesių

PGR diagnostika, įtarus, kad žmogaus organizme siaučia hepatito C virusas, yra optimaliausias tyrimo metodas, nes tik jis gali atpažinti „švelniojo priešo“ buvimą paciento kraujyje ar kepenų biopsijoje.

Tačiau kartais pasitaiko atvejų, kai antikūnai būna teigiami, tačiau PGR rezultatas – neigiamas. Taip kartais nutinka, kai viruso kiekis yra labai mažas arba kai jis kepenyse yra „miegančioje“ būsenoje ir nepatenka į kraują. Kad vis tiek rastų tiesą, pacientui skiriamas antras arba net ne vienas tyrimas.

Žmogaus papilomos viruso infekcija

Jei savaiminis išgydymas neįvyksta, jis taip pat gali, niekaip nepasirodydamas, ilgai išlikti savininko kūne, kuris to net neįtaria, nes nebuvo atlikta PGR ir nebuvo jokių simptomų. liga. Tačiau papilomos viruso infekcijos buvimas, nors ir latentinis, toli gražu nėra abejingas žmonių sveikatai, nes tam tikros viruso rūšys, sukeliančios vėžį (16, 18 tipai), kelia ypatingą pavojų.

Dažniau pusė gyventojų kenčia nuo ŽPV, nes virusas teikia pirmenybę moterų lytinių organų sričiai, o ypač gimdos kakleliui, kur kai kurios virusų rūšys prisideda prie displazijos procesų vystymosi, o vėliau gimdos kaklelio vėžys, jei displazija negydoma. ir virusui suteikiama laisvė. Taigi, polimerazės grandininė reakcija aptiks viruso DNR ir tada parodys, kad moters kūne apsigyveno „blogasis“ arba „gerasis“ (onkogeninis ar neonkogeninis) tipas.

Kitos LPI ir TORCH infekcijos

Akivaizdu, kad polimerazės grandininės reakcijos metu galima rasti bet kokią svetimą struktūrą, susidedančią iš nukleino rūgščių, todėl šis testas yra tinkamas visoms STD ir TORCH infekcijoms nustatyti, tačiau jis naudojamas ne visada. Kam, tarkime, daryti tokius brangius tyrimus gonokokams aptikti, jei yra prieinamesnių ir pigesnių?

TORCH infekcijos ir LPI yra taip tarpusavyje susijusios, kad kartais sunku nustatyti, kuriai grupei konkretus patogenas turėtų būti priskirtas. Apskritai jas suprasti gali būti sunku, nes tai gana įvairios mikroorganizmų grupės, kurios gali būti lytiškai plintančios visada arba tik tam tikromis sąlygomis (imunodeficitas) ir gali būti įdomios tik nėštumo metu dėl galimo neigiamo poveikio. jos eiga ir vaisius.

PGR yra pagrindinis paslėptų infekcijų nustatymo metodas

Klinikinių apraiškų vystymasis grindžiamas skirtingais patogenais, kuriuos galima aptikti tik PGR, kuris yra pagrindinė jo užduotis, kartais kartu su ELISA, o kartais kaip vienintelis patvirtinantis tyrimas, ypač jei nėra ligos simptomų. Tokią sudėtingą situaciją gali sukurti polimikrobinė infekcija, kuri, be akivaizdžių patogenų, apima ir oportunistinius patogenus.

Ureaplazma dažnai laikoma kartu su mikoplazma. Ir tai ne be priežasties. Šios rūšys, kaip ir chlamidijos, nėra nei virusai, nei bakterijos, jos gyvena ląstelių viduje ir priskiriamos LPI, nors jų buvimas sveikame organizme taip pat nėra neįprasta. Taigi, norint atskirti sveiką nešioją nuo sergančio žmogaus, reikalingi specialūs metodai, kai PGR yra laikomas patikimiausiu, nes dėl šių mikroorganizmų struktūrinių ypatybių ir elgesio kiti tyrimai yra neveiksmingi.

Kalbant apie (1, 2 tipo) ir, taip pat priklausančius herpeso virusams (5 tipas), situacija čia taip pat dviprasmiška. Pasaulio gyventojų užsikrėtimo lygis artėja prie 100%, todėl šiuo atveju labai svarbus viruso ir jo dozės identifikavimas, o tai ypač svarbu nėštumo metu, nes suaugusiam žmogui į organizmą įsišaknijęs virusas. dažnai nesukelia jokių rūpesčių ir neduoda ligos požymių.

Todėl nereikėtų ignoruoti tokio gydytojo paskirto tyrimo, nes kai kuriais atvejais polimerazės grandininė reakcija yra privalomas ir būtinas laboratorinės diagnostikos metodas, galintis apsaugoti ne tik moterį, bet ir mažą, dar negimusį žmogų nuo rimtų komplikacijų.

Baigdamas norėčiau pažymėti, kad toks nuostabus metodas kaip PGR tarnauja žmonijai daugiau nei 30 metų. Tuo pačiu metu tyrimo tikslai neapsiriboja infekcinių ligų sukėlėjų paieška. Polimerazės grandininė reakcija, gimusi molekulinės biologijos pagrindu, yra neatsiejamai susijusi su genetika, sėkmingai naudojamas kriminalistikoje asmens tapatybei nustatyti, teismo medicinoje tėvystei nustatyti, veterinarijoje, jei gyvūnų klinikoje yra galimybė įsigyti brangios įrangos, taip pat kitose srityse (pramonė, žemės ūkis ir kt.).

Vaizdo įrašas: PGR - esmė ir taikymas

Tačiau tuo metu ši idėja liko nepriimta. Polimerazės grandininę reakciją 1983 metais iš naujo atrado Kary Mullis. Jo tikslas buvo sukurti metodą, kuris leistų DNR amplifikuoti kelis kartus iš eilės dubliuojant pradinę DNR molekulę, naudojant fermentą DNR polimerazę. Praėjus 7 metams nuo šios idėjos paskelbimo, 1993 m., Mullis už tai gavo Nobelio premiją.

Metodo naudojimo pradžioje, po kiekvieno šildymo-aušinimo ciklo, į reakcijos mišinį reikėjo pridėti DNR polimerazės, nes ji greitai buvo inaktyvuota aukštoje temperatūroje, reikalinga atskirti DNR spiralės grandines. Procedūra buvo labai neefektyvi ir pareikalavo daug laiko bei fermentų. 1986 metais jis buvo gerokai patobulintas. Buvo pasiūlyta naudoti termofilinių bakterijų DNR polimerazes. Šie fermentai pasirodė esantys termostabilūs ir galėjo atlaikyti daugybę reakcijos ciklų. Jų naudojimas leido supaprastinti ir automatizuoti PGR. Viena pirmųjų termostabilių DNR polimerazių buvo išskirta iš bakterijų Thermus aquaticus ir pavadintas Taq- polimerazė. Šios polimerazės trūkumas yra tai, kad klaidingo nukleotido įvedimo tikimybė yra gana didelė, nes šis fermentas neturi klaidų taisymo mechanizmų (3"→5" egzonukleazės aktyvumas). Polimerazės Pfu Ir Pwo, išskirtos iš archajų, turi tokį mechanizmą, jų naudojimas žymiai sumažina DNR mutacijų skaičių, tačiau jų darbo greitis (procesiškumas) yra mažesnis nei Taq. Šiuo metu naudojami mišiniai Taq Ir Pfu kad būtų pasiektas didelis polimerizacijos greitis ir didelis kopijavimo tikslumas.

Metodo išradimo metu Mullis dirbo korporacijoje Cetus, kuri užpatentavo PGR metodą. 1992 m. Cetus pardavė metodo teises ir naudojimo patentą Taq- polimerazės kompanija Hoffmann-La Roche (en: Hoffmann-La Roche) už 300 mln. Tačiau paaiškėjo, kad Taq-polimerazę 1980 metais charakterizavo rusų biochemikas Aleksejus Kaledinas, o Promega bandė priversti Roche atsisakyti išskirtinių teisių į šį fermentą. JAV PGR metodo patentas pasibaigė 2005 m. kovo mėn.

PGR atlikimas

Metodas pagrįstas pakartotiniu selektyviu tam tikros DNR dalies kopijavimu naudojant fermentus dirbtinėmis sąlygomis ( in vitro). Tokiu atveju nukopijuojamas tik tas skyrius, kuris atitinka nurodytas sąlygas, ir tik tuo atveju, jei jis yra tiriamame pavyzdyje. Skirtingai nuo DNR amplifikacijos gyvuose organizmuose (replikacijos), santykinai trumpos DNR dalys amplifikuojamos naudojant PGR. Įprasto PGR proceso metu nukopijuotų DNR sekcijų ilgis yra ne didesnis kaip 3000 bazinių porų (3 kbp). Naudojant įvairių polimerazių mišinį, naudojant priedus ir tam tikromis sąlygomis, PGR fragmento ilgis gali siekti 20-40 tūkstančių nukleotidų porų. Tai vis dar yra žymiai mažiau nei eukariotinės ląstelės chromosominės DNR ilgis. Pavyzdžiui, žmogaus genomą sudaro maždaug 3 milijardai bazinių porų.

Reakcijos komponentai

Norint atlikti PGR paprasčiausiu atveju, reikalingi šie komponentai:

DNR matrica, kuriame yra DNR dalis, kurią reikia amplifikuoti.
Du gruntai, papildantis priešingus norimos DNR fragmento skirtingų grandžių galus.
Termiškai stabilus DNR polimerazė- fermentas, katalizuojantis DNR polimerizacijos reakciją. Polimerazė, skirta naudoti PGR, turi išlikti aktyvi aukštoje temperatūroje ilgą laiką, todėl naudojami iš termofilų išskirti fermentai - Thermus aquaticus(Taq polimerazė), Pyrococcus furiosus(Pfu polimerazė), Pyrococcus woesei(Pwo polimerazė) ir kt.
Deoksinukleozidų trifosfatai(dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
Mg 2+ jonai, būtini polimerazės veikimui.
Buferinis tirpalas, užtikrinant reikiamas reakcijos sąlygas – pH, tirpalo joninę stiprumą. Sudėtyje yra druskų, galvijų serumo albumino.

Kad reakcijos mišinys neišgaruotų, į mėgintuvėlį įpilkite aukštai verdančio aliejaus, pvz., vazelino. Jei naudojate termociklerį su šildomu dangčiu, to nereikia.

Pirofosfatazės pridėjimas gali padidinti PGR reakcijos išeigą. Šis fermentas katalizuoja pirofosfato, nukleotidų trifosfatų pridėjimo prie augančios DNR grandinės šalutinio produkto, hidrolizę iki ortofosfato. Pirofosfatas gali slopinti PGR reakciją.

Gruntai

PGR specifiškumas pagrįstas komplementarių kompleksų susidarymu tarp šablono ir pradmenų, trumpų sintetinių 18-30 bazių ilgio oligonukleotidų. Kiekvienas iš pradmenų papildo vieną iš dvigrandinio šablono gijų ir riboja sustiprintos srities pradžią ir pabaigą.

Po šablono hibridizacijos su pradmeniu (prijungimas), pastarasis naudojamas kaip DNR polimerazės pradmuo sintezės metu papildomos šablono grandinės (žr.).

Svarbiausia pradmenų charakteristika yra pradmenų ir matricų komplekso lydymosi temperatūra (Tm). T m yra temperatūra, kurioje pusė DNR šablonų sudaro kompleksą su oligonukleotido pradmeniu. Lydymosi temperatūrą galima apytiksliai nustatyti pagal formulę , kur n X yra nukleotidų X skaičius pradmenyje. Jei pradmens ilgis ir nukleotidų sudėtis arba atkaitinimo temperatūra parinkta neteisingai, gali susidaryti iš dalies papildantys kompleksai su kitomis DNR šablono sritimis, dėl kurių gali atsirasti nespecifinių produktų. Viršutinę lydymosi temperatūros ribą riboja optimali polimerazės veikimo temperatūra, kurios aktyvumas mažėja esant aukštesnei nei 80 °C temperatūrai.

Renkantis gruntus, patartina laikytis šių kriterijų:

Stiprintuvas

Ryžiai. 1: PGR ciklas

PGR atliekama termocikleryje – įrenginyje, kuris periodiškai vėsina ir kaitina mėgintuvėlius, dažniausiai ne mažesniu kaip 0,1 °C tikslumu. Šiuolaikiniai dviračiai leidžia nustatyti sudėtingas programas, įskaitant „karštojo paleidimo“, „Touchdown“ PGR (žr. toliau) ir paskesnį amplifikuotų molekulių saugojimą 4 °C temperatūroje. Realaus laiko PGR atveju gaminami prietaisai su fluorescenciniu detektoriumi. Taip pat yra prietaisų su automatiniu dangteliu ir skyreliu mikroplokštelėms, kurios leidžia jas integruoti į automatizuotas sistemas.

Reakcijos eiga

Gelio, kuriame yra žymeklio DNR (1) ir PGR reakcijos produktų (2, 3), nuotrauka. Skaičiai rodo DNR fragmentų ilgį nukleotidų poromis

Paprastai PGR apima 20-35 ciklus, kurių kiekvienas susideda iš trijų etapų (2 pav.).

Denatūravimas

Dviejų grandžių DNR šablonas kaitinamas iki 94-96°C (arba iki 98°C, jei naudojama ypač termostabili polimerazė) 0,5-2 minutes, kad būtų atskirtos DNR grandinės. Šis etapas vadinamas denatūravimas, nes vandeniliniai ryšiai tarp dviejų DNR grandinių yra sunaikinami. Kartais prieš pirmąjį ciklą (prieš pridedant polimerazės) reakcijos mišinys pašildomas 2-5 minutes. visiškai denatūruoti šabloną ir pradmenis. Ši technika vadinama karšta pradžia, tai leidžia sumažinti nespecifinių reakcijos produktų kiekį.

Atkaitinimas

Kai sruogos atsiskiria, temperatūra sumažinama, kad gruntai galėtų prisijungti prie viengubo šablono. Šis etapas vadinamas atkaitinimas. Atkaitinimo temperatūra priklauso nuo gruntų sudėties ir paprastai parenkama 4-5°C žemesnė už jų lydymosi temperatūrą. Scenos laikas – 0,5-2 min. Neteisingai pasirinkus atkaitinimo temperatūrą, pradmenys prastai prisiriša prie šablono (per aukštoje temperatūroje) arba surišami netinkamoje vietoje ir atsiranda nespecifinių produktų (per žemoje temperatūroje).

Pailgėjimas

PGR tipai

„Nested“ PGR (liet. įdėtas PGR) naudojamas šalutinių reakcijos produktų skaičiui sumažinti. Naudojamos dvi poros pradmenų ir atliekamos dvi nuoseklios reakcijos. Antroji pradmenų pora amplifikuoja DNR sritį pirmosios reakcijos produkte.
„Apversta“ PGR (atvirkštinė PGR) – naudojama, jei žinomas tik nedidelis norimos sekos regionas. Šis metodas yra ypač naudingas, kai reikia nustatyti gretimas sekas po DNR įterpimo į genomą. Norint atlikti apverstą PGR, atliekama eilė DNR pjūvių su restrikcijos fermentais, po kurių sujungiami fragmentai (ligavimas). Dėl to žinomi fragmentai atsiduria abiejuose nežinomo regiono galuose, o po to PGR galima atlikti kaip įprasta.
Atvirkštinės transkripcijos PGR (RT-PGR) naudojama žinomai sekai iš RNR bibliotekos amplifikuoti, išskirti arba identifikuoti. Prieš atliekant įprastą PGR, vienos grandinės DNR molekulė sintetinama ant mRNR šablono, naudojant atvirkštinę analizę, ir gaunama vienos grandinės cDNR, kuri naudojama kaip PGR šablonas. Šis metodas dažnai nustato, kur ir kada šie genai yra išreikšti.
Asimetrinė PGR Asimetrinė PGR) – atliekama, kai reikia amplifikuoti daugiausia vieną iš pradinės DNR grandžių. Naudojamas kai kuriuose sekos nustatymo ir hibridizacijos analizės metoduose. PGR atliekama kaip įprasta, išskyrus tai, kad vienas iš pradmenų imamas dideliu pertekliumi.
Kiekybinė PGR (Q-PGR) naudojama norint greitai išmatuoti specifinės DNR, cDNR arba RNR kiekį mėginyje.
Kiekybinė realaus laiko PGR – šis metodas naudoja fluorescenciniu būdu pažymėtus reagentus, kad tiksliai išmatuotų besikaupiančio reakcijos produkto kiekį.
Touchdown (Stepdown) PGR (Touchdown PCR) – naudojant šį metodą, sumažėja nespecifinio pradmenų surišimo įtaka produkto susidarymui. Pirmieji ciklai atliekami esant aukštesnei nei atkaitinimo temperatūrai, tada temperatūra mažinama kas kelis ciklus. Tam tikroje temperatūroje sistema praeis per optimalaus pradmenų specifiškumo juostą DNR.
Molekulinės kolonijos metodas (PGR gelyje, anglų k. Polony – PGR kolonija) - akrilamido gelis polimerizuojamas su visais PGR komponentais ant paviršiaus ir atliekama PGR. Taškuose, kuriuose yra analizuojama DNR, amplifikacija vyksta formuojant molekulines kolonijas.
PGR su greitu cDNR galų amplifikavimu Greitas cDNR galų amplifikavimas, RACE-PGR )
Ilgo fragmento PGR Ilgo nuotolio PGR) – PGR modifikacija, skirta išplėstų DNR sekcijų (10 tūkst. bazių ir daugiau) amplifikacijai. Naudojamos dvi polimerazės, viena iš kurių yra Taq polimerazė, turinti didelį procesyvumą (tai yra, vienu žingsniu galinti susintetinti ilgą DNR grandinę), o antroji – DNR polimerazė, turinti 3"-5" endonukleazės aktyvumą. Antroji polimerazė yra būtina norint ištaisyti pirmosios padarytas klaidas.
RAPD PGR Atsitiktinis polimorfinės DNR PGR amplifikavimas , PGR su atsitiktine polimorfinės DNR amplifikacija – naudojama, kai reikia atskirti organizmus, kurie yra artimi genetine seka, pavyzdžiui, skirtingų veislių auginamų augalų, šunų veislių ar artimai giminingų mikroorganizmų. Šiam metodui dažniausiai naudojamas vienas mažas gruntas (20–25 bp). Šis pradmuo iš dalies papildys atsitiktines tiriamų organizmų DNR dalis. Pasirinkus sąlygas (pradiklio ilgį, sudėtį, temperatūrą ir kt.), galima pasiekti patenkinamą dviejų organizmų PGR modelio skirtumą.

Jei šablono nukleotidų seka iš dalies žinoma arba visai nežinoma, galite naudoti išsigimę pradmenys, kurios sekoje yra išsigimusių pozicijų, kuriose gali būti bet kokios bazės. Pavyzdžiui, pradmenų seka gali būti: ...ATH..., kur H yra A, T arba C.

PGR taikymas

PGR naudojamas daugelyje sričių bandymams ir moksliniams eksperimentams.

Kriminalistika

PGR naudojama vadinamiesiems „genetiniams pirštų atspaudams“ palyginti. Reikalingas genetinės medžiagos mėginys iš nusikaltimo vietos – kraujo, seilių, spermos, plaukų ir kt. Tai lyginama su įtariamojo genetine medžiaga. Pakanka labai mažo DNR kiekio, teoriškai vienos kopijos. DNR suskaidoma į fragmentus ir amplifikuojama naudojant PGR. Fragmentai atskiriami naudojant DNR elektroforezę. Gautas DNR juostų išsidėstymo vaizdas vadinamas genetinis pirštų atspaudas(Anglų) genetinis pirštų atspaudas).

Tėvystės nustatymas

Ryžiai. 3: DNR fragmentų, amplifikuotų PGR, elektroforezės rezultatai. (1) Tėvas. (2) Vaikas. (3) Motina. Vaikas paveldėjo kai kurias abiejų tėvų genetinio atspaudo ypatybes, todėl atsirado naujas unikalus įspaudas.

Nors genetiniai pirštų atspaudai yra unikalūs (išskyrus identiškų dvynių atvejus), šeimos santykius vis tiek galima užmegzti padarius kelis pirštų atspaudus (3 pav.). Tas pats metodas gali būti taikomas, šiek tiek pakeistas, siekiant nustatyti evoliucinį organizmų ryšį.

Medicininė diagnostika

PGR leidžia žymiai pagreitinti ir palengvinti paveldimų ir virusinių ligų diagnostiką. Dominantis genas amplifikuojamas PGR, naudojant tinkamus pradmenis, o tada sekvenuojamas, kad būtų nustatytos mutacijos. Virusinės infekcijos gali būti aptiktos iškart po užsikrėtimo, likus savaitėms ar mėnesiams iki simptomų atsiradimo.

Individualizuota medicina

Žinoma, kad dauguma vaistų veikia ne visus pacientus, kuriems jie skirti, o tik 30-70 proc. Be to, kai kuriems pacientams daugelis vaistų yra toksiški arba alergizuojantys. To priežastys iš dalies yra dėl individualių vaistų ir jų darinių jautrumo ir metabolizmo skirtumų. Šie skirtumai nustatomi genetiniame lygmenyje. Pavyzdžiui, vienam pacientui tam tikras citochromas (kepenų baltymas, atsakingas už pašalinių medžiagų apykaitą) gali būti aktyvesnis, kitam – mažiau. Norint nustatyti, kokio tipo citochromas yra tam tikram pacientui, prieš vartojant vaistą, siūloma atlikti PGR analizę. Ši analizė vadinama preliminariu genotipo nustatymu. numatomas genotipų nustatymas).

Genų klonavimas

Genų klonavimas (nepainioti su organizmų klonavimu) yra genų išskyrimo ir dėl genų inžinerijos manipuliacijų didelio kiekio tam tikro geno produkto gavimo procesas. PGR naudojamas amplifikuoti geną, kuris vėliau įterpiamas į vektorius- DNR fragmentas, pernešantis svetimą geną į tą patį ar kitą patogų auginimui organizmą. Pavyzdžiui, plazmidės arba virusinė DNR naudojamos kaip vektoriai. Genų įterpimas į svetimą organizmą dažniausiai naudojamas to geno produktui – RNR arba dažniausiai baltymui gaminti. Tokiu būdu pramoniniais kiekiais gaunama daug baltymų, skirtų naudoti žemės ūkyje, medicinoje ir kt.

Ryžiai. 4: Genų klonavimas naudojant plazmidę. .
(1) A organizmo chromosominė DNR. (2) PGR. (3) Daug organizmo A geno kopijų. (4) Geno įterpimas į plazmidę. (5) Plazmidė su organizmo A genu. (6) Plazmidės įvedimas į organizmą B. (7) Organizmo A geno kopijų skaičiaus dauginimas organizme B.

DNR sekos nustatymas

Atliekant sekos nustatymo metodą, naudojant dideoksinukleotidus, paženklintus fluorescencine žyme arba radioaktyviu izotopu, PGR yra neatsiejama dalis, nes būtent polimerizacijos metu į DNR grandinę įterpiami fluorescencine arba radioaktyvia žyme pažymėti nukleotidų dariniai. Tai sustabdo reakciją, leidžiančią nustatyti konkrečių nukleotidų padėtis po to, kai gelyje yra atskirtos susintetintos grandinės.

Mutagenezė

Šiuo metu PGR tapo pagrindiniu mutagenezės metodu. PGR naudojimas leido supaprastinti ir pagreitinti mutagenezės procedūrą, taip pat padaryti ją patikimesnę ir atkuriamesnę.