Tiesioginiai ir netiesioginiai virusologiniai tyrimo metodai. Virusologinių tyrimų metodai mikrobiologijoje

Virusologinių tyrimų metodai- virusų biologijos tyrimo ir jų identifikavimo metodai. Virusologijoje plačiai naudojami molekulinės biologijos metodai, kurių pagalba buvo galima nustatyti viruso dalelių molekulinę struktūrą, kaip jos prasiskverbia į ląstelę ir virusų dauginimosi ypatumus, pirminę virusinių nukleorūgščių struktūrą. ir baltymai. Kuriami virusų nukleorūgščių ir baltymų aminorūgščių sudedamųjų elementų sekos nustatymo metodai. Atsiranda galimybė susieti nukleorūgščių ir jų koduojamų baltymų funkcijas su nukleotidų seka ir nustatyti tarpląstelinių procesų, vaidinančių svarbų vaidmenį e-viruso infekcijoje, priežastis.

Virusologiniai tyrimo metodai taip pat pagrįsti imunologiniais procesais (antigeno sąveika su antikūnais), viruso biologinėmis savybėmis (gebėjimu hemagliutinuotis, hemolizei, fermentiniu aktyvumu), viruso sąveikos su ląstele-šeimininke ypatumais (citopatinės ląstelės prigimtimi). poveikis, tarpląstelinių intarpų susidarymas ir kt.) .

Virusinių infekcijų diagnostikoje, auginant, išskiriant ir identifikuojant virusus, taip pat ruošiant vakcinų preparatus, plačiai taikomas audinių ir ląstelių kultūros metodas. Naudojamos pirminės, antrinės, stabilios ištisinės ir diploidinės ląstelių kultūros. Pirminės kultūros gaunamos išsklaidant audinius proteolitiniais fermentais (tripsinu, kolagenaze). Ląstelių šaltinis gali būti žmogaus ir gyvūnų embrionų audiniai ir organai (dažniau inkstai). Ląstelių suspensija maistinėje terpėje dedama į vadinamuosius čiužinius, butelius arba Petri lėkštes, kur, prisitvirtinus prie indo paviršiaus, ląstelės pradeda daugintis. Virusinei infekcijai dažniausiai naudojamas vienas ląstelių sluoksnis. Maistinis skystis nupilamas, viruso suspensija įvedama tam tikrais praskiedimais, o po kontakto su ląstelėmis įpilama šviežios maistinės terpės, dažniausiai be serumo.

Daugumos pirminių kultūrų ląstelės gali būti subkultūros ir vadinamos antrinėmis kultūromis. Toliau perduodant ląsteles, susidaro į fibroblastus panašių ląstelių, galinčių greitai daugintis, populiacija, kurių dauguma išlaiko pradinį chromosomų rinkinį. Tai vadinamosios diploidinės ląstelės. Serijiniu būdu auginant ląsteles, gaunamos stabilios ištisinės ląstelių kultūros. Persėjimų metu atsiranda greitai besidalijančios vienarūšės ląstelės su heteroploidiniu chromosomų rinkiniu. Stabilios ląstelių linijos gali būti vienasluoksnės ir suspensijos. Vienasluoksnės kultūros auga ištisinio sluoksnio pavidalu ant stiklo paviršiaus, suspensinės kultūros auga suspensijų pavidalu įvairiuose induose naudojant maišytuvus. Yra daugiau nei 400 ląstelių linijų, gautų iš 40 skirtingų gyvūnų rūšių (įskaitant primatus, paukščius, roplius, varliagyvius, žuvis, vabzdžius) ir žmones.

Atskirų organų ir audinių gabalai (organų kultūros) gali būti auginami dirbtinėse maistinėse terpėse. Tokio tipo kultūros išsaugo audinių struktūrą, o tai ypač svarbu nediferencijuotose audinių kultūrose nesidauginančių virusų (pavyzdžiui, koronavirusų) išskyrimui ir pernešimui.

Užkrėstose ląstelių kultūrose virusus galima aptikti pagal ląstelių morfologijos pokyčius, citopatinį poveikį, kuris gali būti specifinis, inkliuzų atsiradimą, nustatant viruso antigenus ląstelėje ir kultūros skystyje; viruso palikuonių biologinių savybių kultūros skystyje nustatymas ir virusų titravimas audinių kultūroje, viščiukų embrionuose ar jautriuose gyvūnuose; aptinkant atskiras virusines nukleorūgštis ląstelėse molekulinės hibridizacijos būdu arba nukleorūgščių grupes citocheminiu metodu, naudojant fluorescencinę mikroskopiją.

Virusų išskyrimas yra sunkus ir ilgas procesas. Ji atliekama siekiant nustatyti populiacijoje cirkuliuojančio viruso tipą ar variantą (pavyzdžiui, nustatyti viruso a serovarantą, laukinę ar vakcininę viruso a padermę ir kt.); tais atvejais, kai būtina imtis skubių epidemiologinių priemonių; kai atsiranda naujų virusų tipų ar variantų; jei reikia, patvirtinti preliminarią diagnozę; virusų indikacijai aplinkos objektuose. Išskiriant virusus, atsižvelgiama į jų išlikimo žmogaus organizme galimybę, taip pat į mišrios infekcijos, kurią sukelia du ar daugiau virusų, atsiradimą. Iš vieno viriono gauta genetiškai vienalytė viruso populiacija vadinama viruso klonu, o jo gavimo procesas – klonavimu.

Virusams išskirti naudojami imlių laboratorinių gyvūnų infekcija, vištų embrionai, tačiau dažniausiai naudojama audinių kultūra. Viruso buvimą paprastai lemia specifinė ląstelių degeneracija (citopatinis poveikis),

simpplastų ir sincitų susidarymas, tarpląstelinių intarpų aptikimas, taip pat specifinis antigenas, nustatytas naudojant imunofluorescenciją, hemadsorbciją, hemagliutinaciją (hemagliutinuojančiuose virusuose) ir kt. Šiuos požymius galima aptikti tik po 2–3 viruso perdavimų.

Daugeliui virusų, pavyzdžiui, a virusų, išskirti naudojami viščiukų embrionai, kai kuriems Coxsackie virusams ir daugeliui arbovirusų – naujagimių pelių. Išskirtų virusų identifikavimas atliekamas serologiniais tyrimais ir kitais metodais.

Dirbant su virusais nustatomas jų titras. Virusų titravimas dažniausiai atliekamas audinių kultūroje, nustatant didžiausią viruso turinčio skysčio praskiedimą, kuriam esant vyksta audinių degeneracija, susidaro inkliuzai ir virusui būdingi antigenai. Apnašų metodas gali būti naudojamas titruoti daugybę virusų. Plokštelės arba neigiamos virusų kolonijos yra vieno sluoksnio audinių kultūros, padengtos agaru, virusų sunaikintų ląstelių židiniai. Kolonijų skaičiavimas leidžia kiekybiškai analizuoti virusų infekcinį aktyvumą, remiantis tuo, kad viena infekcinio viruso dalelė sudaro vieną plokštelę. Plokštelės identifikuojamos nudažant kultūrą gyvybiškai svarbiais dažais, dažniausiai neutralia raudona spalva; apnašos neadsorbuoja dažų, todėl matomos kaip šviesios dėmės nudažytų gyvų ląstelių fone. Viruso titras išreiškiamas apnašas formuojančių vienetų skaičiumi 1 ml.

Virusų gryninimas ir koncentravimas paprastai atliekamas diferencine ultracentrifugavimu, po kurio centrifuguojama koncentracijos arba tankio gradientais. Virusams išvalyti naudojami imunologiniai metodai, jonų mainų chromatografija, imunosorbentai ir kt.

Laboratorinė virusinių infekcijų diagnostika apima patogeno ar jo komponentų aptikimą klinikinėje medžiagoje; viruso išskyrimas iš šios medžiagos; serodignozė. Laboratorinės diagnostikos metodo pasirinkimas kiekvienu individualiu atveju priklauso nuo ligos pobūdžio, ligos laikotarpio ir laboratorijos galimybių. Šiuolaikinė virusinių infekcijų diagnostika pagrįsta greitaisiais metodais, kurie leidžia gauti atsakymą praėjus kelioms valandoms po klinikinės medžiagos paėmimo ankstyvosiose ligos stadijose, įskaitant elektroninę ir imuninę elektroninę mikroskopiją,

taip pat imunofluorescencija, molekulinės hibridizacijos metodas, lgM klasės antikūnų nustatymas ir kt.

Neigiamai nudažytų virusų elektroninė mikroskopija leidžia diferencijuoti virusus ir nustatyti jų koncentraciją. Elektroninės mikroskopijos naudojimas diagnozuojant virusines infekcijas apsiriboja tais atvejais, kai viruso dalelių koncentracija klinikinėje medžiagoje yra pakankamai didelė (10 5 iš 1). ml ir aukštesnis). Metodo trūkumas yra nesugebėjimas atskirti virusų, priklausančių tai pačiai taksonominei grupei. Šis trūkumas pašalinamas naudojant imuninę elektroninę mikroskopiją. Metodas pagrįstas imuninių kompleksų susidarymu, kai į viruso daleles pridedamas specifinis serumas, tuo pačiu metu vykstant viruso dalelių koncentracijai, kuri leidžia jas identifikuoti. Metodas taip pat naudojamas antikūnams aptikti. Ekspresinės diagnostikos tikslais atliekamas audinių ekstraktų, išmatų, skysčio iš pūslelių, nosiaryklės paslapčių tyrimas elektroniniu mikroskopu. Elektroninė mikroskopija plačiai naudojama viruso morfogenezei tirti, jos galimybės plečiamos naudojant žymėtus antikūnus.

Molekulinės hibridizacijos metodas, pagrįstas virusui būdingų nukleorūgščių aptikimu, leidžia aptikti pavienes genų kopijas ir neturi lygių pagal jautrumą. Reakcija pagrįsta komplementarių DNR arba RNR grandinių (zondų) hibridizacija ir dvigrandžių struktūrų susidarymu. Pigiausias zondas yra klonuota rekombinantinė DNR. Zondas paženklintas radioaktyviais pirmtakais (dažniausiai radioaktyviuoju fosforu). Kolorimetrinių reakcijų naudojimas yra perspektyvus. Yra keli molekulinės hibridizacijos variantai: taškinė hibridizacija, blotinė hibridizacija, sumuštinių hibridizacija, hibridizacija in situ ir kt.

LgM klasės antikūnai atsiranda anksčiau nei G klasės antikūnai (3-5 ligos dieną) ir išnyksta po kelių savaičių, todėl jų aptikimas rodo neseną infekciją. IgM klasės antikūnai aptinkami imunofluorescenciniu arba fermentiniu imuniniu tyrimu, naudojant anti-m antiserumus (anti-IgM sunkiosios grandinės serumus).

Serologiniai virusologijos metodai yra pagrįsti klasikinėmis imunologinėmis reakcijomis (žr. Imunologinių tyrimų metodai ): komplemento fiksavimo reakcijos

hemagliutinacijos slopinimas, biologinė neutralizacija, imunodifuzija, netiesioginė hemagliutinacija, radialinė hemolizė, imunofluorescencija, fermentinis imunologinis tyrimas, radioimuninis tyrimas. Daugelio reakcijų mikrometodai buvo sukurti, o jų metodai nuolat tobulinami. Šie metodai naudojami virusams identifikuoti naudojant žinomų serumų rinkinį ir serodiagnostikai, siekiant nustatyti antikūnų padidėjimą antrajame serume, palyginti su pirmuoju (pirmasis serumas imamas pirmomis dienomis po ligos, antrasis – po ligos). 2-3 savaites). Diagnostinė vertė yra ne mažiau kaip keturis kartus padidėjęs antikūnų kiekis antrajame serume. Jei lgM klasės antikūnų aptikimas rodo, kad neseniai užsikrėtėte, tai lgC klasės antikūnai išlieka keletą metų, o kartais ir visą gyvenimą.

Norint nustatyti atskirus virusų antigenus ir antikūnus prieš juos sudėtinguose mišiniuose be išankstinio baltymų gryninimo, naudojamas imunoblotas. Šis metodas apjungia baltymų frakcionavimą, naudojant poliakrilamido gelio elektroforezę, su vėlesniu baltymų imunologiniu tyrimu, naudojant fermentinį imuninį tyrimą. Baltymų atskyrimas sumažina antigeno cheminio grynumo reikalavimus ir leidžia identifikuoti atskiras antigeno-antikūno poras. Ši užduotis aktuali, pavyzdžiui, ŽIV infekcijos serodiagnostikai, kai klaidingai teigiamos fermentų imunologinės analizės reakcijos atsiranda dėl to, kad yra antikūnų prieš ląstelių antigenus, kurie atsiranda dėl nepakankamo virusinių baltymų gryninimo. Antikūnų nustatymas pacientų serume prieš vidinius ir išorinius viruso antigenus leidžia nustatyti ligos stadiją, o analizuojant populiacijas – viruso baltymų kintamumą. Imunoblotavimas ŽIV infekcijos atveju naudojamas kaip patvirtinantis testas, siekiant nustatyti atskirus viruso antigenus ir antikūnus prieš juos. Analizuojant populiacijas, metodas naudojamas viruso baltymų kintamumui nustatyti. Didelė metodo vertė yra galimybė išanalizuoti antigenus, susintetintus naudojant rekombinantinės DNR technologiją, nustatyti jų dydį ir antigeninių determinantų buvimą.

Bibliografija: Bukrinskaya A.G. Virusologija, M., 1986; Virusologija, metodai, red. B. Meikhi, vert. iš anglų k., M., 1988; Mikrobiologinių ir virusologinių tyrimų metodų vadovas, red. M.O. Birgeris, M., 1982 m.

Virusinio pobūdžio ligų diagnostikos tyrimai. Tai būtina norint nustatyti virusą, ištirti jo biologiją ir gebėjimą paveikti gyvūnų ir žmogaus ląsteles. Taigi tampa įmanoma suprasti virusinių ligų patogenezę ir atitinkamai pasirinkti tinkamą gydymo metodą.

Kokia diagnozė?

gyvose ląstelėse. Norint jį ištirti, būtina jį kultivuoti eksperimentinio organizmo lygmeniu arba Tam medicinos praktikoje ir apskritai mikrobiologijoje atliekami virusologiniai tyrimo metodai, kurie turi šiuos pagrindinius metodus:

tiesus;
netiesioginis;
serologinis.

Medžiagoje gali būti tiesiogiai tiriama, ar nėra nukleino rūgščių, viruso antigeno, arba, pavyzdžiui, norint išskirti ir identifikuoti virusą iš klinikinės medžiagos.

Be galimybės nustatyti ligos etiologiją, stebėti terapinį poveikį, virusologiniai tyrimo metodai atlieka svarbų vaidmenį kovos su epidemijomis priemonėse. Išskirdami ir naudodami viščiukų embrionus, laboratorinius gyvūnus arba ląstelių kultūras.

Kaip jie tiriami?

Greičiausias yra tiesioginis metodas. Tai leidžia aptikti virusą, antigeną arba NA (nukleorūgštį) pačioje klinikinėje medžiagoje. Tai trunka nuo dviejų valandų iki dienos.

EM – elektroninė mikroskopija. Virusą aptinka tiesiogiai.
IEM – imuninė elektroninė mikroskopija. Naudoja specifinius antikūnus prieš virusus.
RIF – imunofluorescencinė reakcija. Naudoja su dažais susietus antikūnus. Tokie virusologinio tyrimo metodai plačiai naudojami kaip greitas SARS (ūminių kvėpavimo takų virusinių infekcijų) etiologijos atkodavimas, kai tamponai paimami iš viršutinių kvėpavimo takų gleivinės.
ELISA – fermentinis imunologinis tyrimas – viruso antigenų nustatymas, panašus į RIF, bet pagrįstas antikūnų žymėjimu fermentais.
RIA – radioimuninis tyrimas. Naudoja antikūnų žymėjimą radioizotopais, kad būtų užtikrintas didelis viruso antigeno aptikimo jautrumas.
Molekulinė – NK hibridizacija arba viruso genomų išskyrimas naudojant PGR (polimerazės grandininę reakciją).
Citologija – retai naudojama, tačiau esant tam tikroms infekcijoms šie virusologiniai tyrimo metodai yra labai veiksmingi. Tiriamos biopsijos medžiagos, skrodimai ir tepinėliai, apdoroti dažymui ir analizei mikroskopu.

Kokia tyrimo esmė?

Siekiant sėkmingo virusų išskyrimo, klinikinė medžiaga paimama atsižvelgiant į patogenezę ir kuo anksčiau. Dažnai prieš atliekant tam tikrus virusologinius tyrimus šis procesas reikalauja kelių pasažų.

Mikrobiologija yra mikroskopinių būtybių tyrimas. Ir jos sritis – ne tik medicina. Tai fundamentalus žemės ūkio, veterinarijos, kosmoso ir technikos pramonės bei geologijos mokslas.

Bet žinoma, viskas sukurta žmogui ir jo vystymuisi šioje nuostabioje planetoje. Todėl labai svarbu laiku pastebėti pavojų ir jį neutralizuoti. Virusai skiriasi nuo bakterijų. Tai dariniai, kurie patenka į organizmą ir sukelia naujos kartos formavimąsi. Jie atrodo kaip kristalai ir yra skirti kontroliuoti savo dauginimosi procesą, nors patys nesimaitina, neauga ir neišskiria medžiagų apykaitos produktų.

Virusas gali sukelti rimtą ligą bet kuriame gyvame organizme, į kurį jis pateko. Be to, jis gali vystytis. Štai kodėl mikrobiologijos virusologinių tyrimų metodai turi būti plėtojami ir tobulinami, nes gali iškilti grėsmė visai žmogaus civilizacijai.

medžiagų

Norint aptikti ir identifikuoti virusus medicinoje, paprastai reikia:

nosiaryklės plovimas (kvėpavimo takų infekcijos);
paraudimas ir išmatos (enterovirusinės infekcijos);
įbrėžimai, pūslelių turinys (odos pažeidimai, gleivinės, pvz., pūslelinė, vėjaraupiai);
paraudimas (egzanteminės infekcijos, pvz., tymai, raudonukės);
kraujas, smegenų skystis (arbovirusinės infekcijos).

Fazės

Visi virusologinio tyrimo metodo etapai apima:

medžiagos rinkimas;
parinkimas, testavimo sistemos gavimas, jos gyvybingumo nustatymas;
bandymo sistemos infekcija;
viruso indikacija;
viruso tipo nustatymas.

Iš esmės patogeniniai virusai skiriasi audinių buvimu ir tipo specifiškumu. Paimkime, pavyzdžiui, poliomielito virusą, kuris dauginasi tik primatuose (jų ląstelėse). Atitinkamai, tam tikram virusui išskirti naudojama specifinė audinių kultūra. Jeigu kalbame apie nežinomą patogeną, tuomet būtų patartina vienu metu užkrėsti tris, o geriausia – keturias ląstelių kultūras.

Taigi, galbūt vienas iš jų bus jautrus. Norėdami nustatyti viruso buvimą užkrėstose kultūrose, pažiūrėkite į specifinės ląstelių degeneracijos raidą, tarpląstelinius inkliuzus, specifinio antigeno aptikimą, teigiamus hemagliutinacijos ir hemadsorbcijos testus.

Visi virusologiniai tyrimo metodai (tiesioginiai ir netiesioginiai, serologiniai) turi būti parinkti kaip tinkamiausi konkrečiam įtariamos infekcijos atvejui.

Netiesioginiai metodai yra pagrįsti viruso išskyrimu ir identifikavimu. Jie yra daug pastangų reikalaujantys, ilgi, bet tikslūs.

Serodiagnostika

Ši diagnozė reiškia metodą, pagrįstą antigeno ir antikūno reakcija. Dažniausiai naudojami suporuoti kraujo serumai, imami kelių savaičių intervalais. Jei antikūnų titras padidėja 4 ar daugiau kartų, reakcija laikoma teigiama. Norint nustatyti viruso tipo specifiškumą, naudojamas viruso neutralizavimo testas. Norint nustatyti grupės specifiškumą, reikia gauti komplemento fiksavimo reakciją.

Plačiai naudojami įvairūs fermentinio imunologinio tyrimo variantai, hemagliutinacijos slopinimo reakcija, pasyvioji hemagliutinacija, atvirkštinė pasyvioji hemagliutinacija, RIF. Net genų inžinerijoje buvo sukurtas monokloninių antikūnų gavimo metodas. Siaurą monoklonų specifiškumą galima įveikti naudojant kelis monokloninius antikūnus prieš įvairius viruso determinantus. Taigi, antigenų nustatymo tyrimo specifiškumas ir jautrumas buvo padidintas.

Kai kurios funkcijos

Šiandien sukurta daug įvairių testavimo sistemų, skirtų imunologinei infekcijų, atsiradusių dėl viruso patekimo į gyvą organizmą, diagnostikai.

Taigi virusologiniai tyrimo metodai yra virusų išskyrimo, jų savybių tyrimo ir etiologinio ryšio su tam tikromis ligomis nustatymo metodai.

Virusologinių tyrimų metodai— virusų biologijos tyrimo ir jų identifikavimo metodai. Virusologijoje plačiai naudojami molekulinės biologijos metodai, kurių pagalba buvo galima nustatyti viruso dalelių molekulinę struktūrą, kaip jos prasiskverbia į ląstelę ir virusų dauginimosi ypatumus, pirminę virusinių nukleorūgščių struktūrą. ir baltymai. Kuriami virusų nukleorūgščių ir baltymų aminorūgščių sudedamųjų elementų sekos nustatymo metodai. Atsiranda galimybė susieti nukleorūgščių ir jų koduojamų baltymų funkcijas su nukleotidų seka ir nustatyti tarpląstelinių procesų, vaidinančių svarbų vaidmenį virusinės infekcijos patogenezėje, priežastis.

Virusų išskyrimas yra sunkus ir ilgas procesas. Ji atliekama siekiant nustatyti tarp gyventojų cirkuliuojančio viruso tipą ar variantą (pavyzdžiui, nustatyti gripo viruso seroviantą, laukinį ar vakcininį poliomielito viruso padermę ir pan.); tais atvejais, kai būtina imtis skubių epidemiologinių priemonių; kai atsiranda naujų virusų tipų ar variantų; jei reikia, patvirtinti preliminarią diagnozę; virusų indikacijai aplinkos objektuose. Išskiriant virusus, atsižvelgiama į jų išlikimo žmogaus organizme galimybę, taip pat į mišrios infekcijos, kurią sukelia du ar daugiau virusų, atsiradimą. Iš vieno viriono gauta genetiškai vienalytė viruso populiacija vadinama viruso klonu, o jo gavimo procesas – klonavimu.

Virusams išskirti naudojami imlių laboratorinių gyvūnų infekcija, vištų embrionai, tačiau dažniausiai naudojama audinių kultūra. Viruso buvimą dažniausiai lemia specifinė ląstelių degeneracija (citopatinis poveikis), simpplastų ir sincitų susidarymas, intraląstelinių inkliuzų aptikimas, taip pat specifinis antigenas, aptiktas naudojant imunofluorescenciją, hemadsorbciją, hemagliutinaciją (hemagliutinuojančių virusų atveju) ir kt. . Šiuos požymius galima aptikti tik po 2–3 viruso perdavimų.

Daugeliui virusų, tokių kaip gripo virusai, išskirti naudojami viščiukų embrionai, kai kuriems Coxsackie virusams ir daugeliui arbovirusų išskirti naudojamos naujagimių pelės. Išskirtų virusų identifikavimas atliekamas serologiniais tyrimais ir kitais metodais.

Laboratorinė virusinių infekcijų diagnostika apima patogeno ar jo komponentų aptikimą klinikinėje medžiagoje; viruso išskyrimas iš šios medžiagos; serodignozė. Laboratorinės diagnostikos metodo pasirinkimas kiekvienu individualiu atveju priklauso nuo ligos pobūdžio, ligos laikotarpio ir laboratorijos galimybių. Šiuolaikinė virusinių infekcijų diagnostika remiasi ekspresiniais metodais, leidžiančiais gauti atsaką praėjus kelioms valandoms po klinikinės medžiagos paėmimo ankstyvosiose ligos stadijose, tai yra elektroninė ir imuninė elektroninė mikroskopija, taip pat imunofluorescencija, molekulinės hibridizacijos metodas, lgM klasės antikūnų aptikimas ir kt.

IgM klasės antikūnai atsiranda anksčiau nei G klasės antikūnai (3-5 ligos dieną) ir išnyksta po kelių savaičių, todėl jų aptikimas rodo neseną infekciją. IgM klasės antikūnai aptinkami imunofluorescenciniu arba fermentiniu imuniniu tyrimu, naudojant anti-m antiserumus (anti-IgM sunkiosios grandinės serumus).

Serologiniai virusologijos metodai yra pagrįsti klasikinėmis imunologinėmis reakcijomis (žr. Imunologinių tyrimų metodai ): komplemento fiksavimo reakcijos, hemagliutinacijos slopinimas, biologinė neutralizacija, imunodifuzija, netiesioginė hemagliutinacija, radialinė hemolizė, imunofluorescencija, fermentinis imunologinis tyrimas, radioimuninis tyrimas. Daugelio reakcijų mikrometodai buvo sukurti, o jų metodai nuolat tobulinami. Šie metodai naudojami virusams identifikuoti naudojant žinomų serumų rinkinį ir serodiagnostikai, siekiant nustatyti antikūnų padidėjimą antrajame serume, palyginti su pirmuoju (pirmasis serumas imamas pirmomis dienomis po ligos, antrasis – po ligos). 2-3 savaites). Diagnostinė vertė yra ne mažiau kaip keturis kartus padidėjęs antikūnų kiekis antrajame serume. Jei lgM klasės antikūnų aptikimas rodo, kad neseniai užsikrėtėte, tai lgC klasės antikūnai išlieka keletą metų, o kartais ir visą gyvenimą.

virusų biologijos tyrimo ir jų identifikavimo metodai. Virusologijoje plačiai naudojami molekulinės biologijos metodai, kurių pagalba buvo galima nustatyti viruso dalelių molekulinę struktūrą, kaip jos prasiskverbia į ląstelę ir virusų dauginimosi ypatumus, pirminę virusinių nukleorūgščių struktūrą. ir baltymai. Kuriami virusų nukleorūgščių ir baltymų aminorūgščių sudedamųjų elementų sekos nustatymo metodai. Atsiranda galimybė susieti nukleorūgščių ir jų koduojamų baltymų funkcijas su nukleotidų seka ir nustatyti tarpląstelinių procesų, vaidinančių svarbų vaidmenį virusinės infekcijos patogenezėje, priežastis.

Laboratorinė virusinių infekcijų diagnostika apima patogeno ar jo komponentų aptikimą klinikinėje medžiagoje; viruso išskyrimas iš šios medžiagos; serodignozė. Laboratorinės diagnostikos metodo pasirinkimas kiekvienu individualiu atveju priklauso nuo ligos pobūdžio, ligos laikotarpio ir laboratorijos galimybių. Šiuolaikinė virusinių infekcijų diagnostika remiasi ekspresiniais metodais, leidžiančiais gauti atsaką praėjus kelioms valandoms po klinikinės medžiagos paėmimo ankstyvosiose ligos stadijose, tai yra elektroninė ir imuninė elektroninė mikroskopija, taip pat imunofluorescencija, molekulinės hibridizacijos metodas, lgM klasės antikūnų aptikimas ir kt.

LgM klasės antikūnai atsiranda anksčiau nei G klasės antikūnai (3-5 ligos dieną) ir išnyksta po kelių savaičių, todėl jų aptikimas rodo neseną infekciją. IgM klasės antikūnai aptinkami imunofluorescenciniu arba fermentiniu imuniniu tyrimu, naudojant anti-μ antiserumus (anti-IgM sunkiosios grandinės serumus).

Serologiniai virusologijos metodai yra pagrįsti klasikinėmis imunologinėmis reakcijomis (žr. Imunologiniai tyrimo metodai) : komplemento fiksavimo reakcijos, hemagliutinacijos slopinimas, biologinė neutralizacija, imunodifuzija, netiesioginė hemagliutinacija, radialinė hemolizė, imunofluorescencija, fermentinis imunologinis tyrimas, radioimuninis tyrimas. Daugelio reakcijų mikrometodai buvo sukurti, o jų metodai nuolat tobulinami. Šie metodai naudojami virusams identifikuoti naudojant žinomų serumų rinkinį ir serodiagnostikai, siekiant nustatyti antikūnų padidėjimą antrajame serume, palyginti su pirmuoju (pirmasis serumas imamas pirmomis dienomis po ligos, antrasis – po ligos). 2-3 savaites). Diagnostinė vertė yra ne mažiau kaip keturis kartus padidėjęs antikūnų kiekis antrajame serume. Jei lgM klasės antikūnų aptikimas rodo, kad neseniai užsikrėtėte, tai lgC klasės antikūnai išlieka keletą metų, o kartais ir visą gyvenimą.

- organinių medžiagų turinčių atliekų neutralizavimo metodai, pagrįsti jų kaitinimu dėl termofilinių aerobinių mikroorganizmų gyvybinės veiklos ...
Medicinos enciklopedija
- histocheminiai fermentų nustatymo metodai, pagrįsti kalcio arba magnio fosfato nuosėdų susidarymo reakcija lokalizuojant fermentinį aktyvumą inkubuojant audinių dalis su organinėmis ...
Medicinos enciklopedija
- histiocitų aptikimo nervų audinių ir įvairių organų preparatuose metodai, naudojant sidabro amoniako arba piridino-sodos tirpalus.
Medicinos enciklopedija
- prielaidų apie paveldėjimo pobūdį vertinimo metodai, pagrįsti stebimų ir tikėtinų sergančių ir sveikų asmenų santykio palyginimu paveldimomis ligomis sergančiose šeimose, atsižvelgiant į metodą ...
Medicinos enciklopedija
- naudojami žmonių, gyvūnų ir augalų ląstelių ir audinių struktūrai ir funkcijoms tirti normaliomis, patologinėmis ir eksperimentinėmis sąlygomis...
Medicinos enciklopedija
- cheminių medžiagų identifikavimo histologiniuose pjūviuose metodai. Neatsiejama G. m. yra citocheminiai metodai, aptinkantys chemines medžiagas paruoštų tepinėlių ir atspaudų ląstelėse ...
Medicinos enciklopedija
- kiekybinio ir kokybinio gliukozės kiekio kraujyje ir šlapime nustatymo metodai, pagrįsti gliukozės oksidavimu atmosferos deguonimi, dalyvaujant fermentui gliukozės oksidazei ...
Medicinos enciklopedija
- diagnostiniai tyrimo metodai, pagrįsti specifine antigenų ir antikūnų sąveika ...
Medicinos enciklopedija
- jungiamojo audinio ir neuroglijos pluoštinių struktūrų nustatymo histologiniuose preparatuose metodai, remiantis jų daugiaspalviu dažymu...
Medicinos enciklopedija
- 1) dermos histologinių preparatų dažymo metodas, naudojant Mayer's hemalun, kalio alūno ir rodamino tirpalą; ląstelių branduoliai nusidažo mėlynai, eleidinas nusidažo raudonai...
Medicinos enciklopedija
- medicinoje - su medicina ir sveikatos priežiūra susijusių objektų ir sistemų būklės ir elgsenos kiekybinio tyrimo ir analizės metodų rinkinys ...
Medicinos enciklopedija
- būdų, kaip tirti įvairius objektus naudojant mikroskopą ...
Medicinos enciklopedija
- pagrįstas optikos dėsnių, susijusių su elektromagnetinės spinduliuotės prigimtimi, sklidimu ir sąveika su medžiaga optiniame diapazone, naudojimu...
Medicinos enciklopedija
- aplinkos objektų kokybės tyrimo ir vertinimo metodai jutimo organų pagalba...
Medicinos enciklopedija
- bendras daugelio metodų, skirtų histologiniams preparatams impregnuoti sidabru, siekiant aptikti gliulines ir kitus argirofilinius pluoštus, pavadinimas ...
Medicinos enciklopedija
- yra skiriami tyrėjo ir teismo ypatingiems klausimams, kylantiems tiriant nusikaltimus ir nagrinėjant civilines bylas, spręsti. Jie taip pat rengiami pasiūlius teismo...
Medicinos enciklopedija

„Virusologinių tyrimų metodai“ knygose

Rage Against The Machine Killing In the Name (1992)

autorius Tsaleris Igoris

Rage Against The Machine Killing In The Name (1992) Los Andžele sukurtame Rage Against The Machine pirmame albume buvo sujungtas hiphopas ir hard rock, pabarstydami juos aktualiais politiniais manifestais ir, maloniai, nemaža doze tankaus funk ritmo. Dainoje „Killing in the name“, įtrauktoje į pirmąjį singlą,

James Brown Kelkis (I Feel Like Being A) Sekso mašina (1970)

Iš knygos Populiarioji XX amžiaus muzika: džiazas, bliuzas, rokas, pop, kantri, folkloras, elektroninė, soul autorius Tsaleris Igoris

James Brown Get Up (I Feel Like Being A) Sekso mašina (1970) Septintojo dešimtmečio pabaigoje Jamesas Brownas pradėjo eksperimentuoti. Širdį draskantis soulas iš „The Famous Flames“ užleido vietą šnypščiam „The J.B.“ fankui. Vienas iš svarbiausių artėjančios funk eros etapų buvo „Sekso mašina“, kurios dešimties minučių versija

Rage Against The Machine

Iš knygos „Prieš neįmanomą“ (straipsnių apie kultūrą rinkinys) autorius Koltašovas Vasilijus Georgijevičius

„Rage Against The Machine“ Tomas Morello: „Mūsų tikslas yra padėti žmonėms išsivaduoti iš melo ir smurto grandinių, įpainiojusių juos su vyriausybėmis, tarptautinėmis korporacijomis, žiniasklaida ir politinėmis partijomis, kad suteiktų žmonėms visame pasaulyje pasitikėjimo jausmą rytoj ir

Sveiki atvykę į mašiną

Iš knygos Varpo laikas autorius Smirnovas Ilja

Sveiki atvykę į mašiną. Perestroikos pradžią savo istorijoje galime datuoti 1987 m. sausio mėn. Tada įvyko liberalus Centrinio komiteto plenumas, ir mes gavome galimybę Yunost paskelbti neredaguotą šiuolaikinių sovietinio roko „žvaigždžių“ sąrašą, įskaitant DDT, CLOUD EDGE ir

Toyoda mašinų darbai

Iš knygos Gemba kaizen. Kelias į išlaidų mažinimą ir kokybės gerinimą pateikė Imai Masaaki

Toyoda Machine Works Pasak Yoshio Shima, Toyoda Machine Works direktoriaus, kokybės sistemos ir kokybės užtikrinimo standartų sukūrimo pranašumai išryškėjo devintajame dešimtmetyje, kai įmonė pristatė „visiško valdymo, pagrįsto kokybe“ sąvoką.

Mašina

Iš knygos Filosofinis žodynas autorius Comte Sponville André

Mašina (Mašina) „Jei šauliai austų patys“, – kartą pastebėjo Aristotelis, „amatininkams nereikėtų darbininkų, o šeimininkams nereikėtų vergų“ („Politika“, I, 4). Maždaug tai vadiname mašina – daiktu, galinčiu judėti, neturinčiu sielos (automato) ir

Iš knygos Internet Intelligence [Veiksmų vadovas] autorius Juščiukas Jevgenijus Leonidovičius

Svetainių archyvas Interneto archyvas Wayback Machine El. pašto adresas – http://web.archive.org Kiekvienas, pakankamai ilgą laiką rinkęs informaciją apie jį dominančią problemą, žino, kaip kartais svarbu rasti informaciją, paskelbtą svetainėje prieš keletą metų. Kartais tiesiog

Interneto archyvo „Wayback“ mašina

Iš knygos „Countering Black PR“ internete autorius Kuzinas Aleksandras Vladimirovičius

Svetainių archyvas Interneto archyvas Wayback Machine Labai dažnai juodaodžių viešųjų ryšių žmonių ataka jums ištinka netikėtai. Tokiu atveju pirmą kartą susiduriate su būtinybe atidžiai ištirti priešą. Jei net manėte tokią įvykių raidą (pavyzdžiui, in

4.9. Atsarginė kopija naudojant „Time Machine“.

autorė Skrylina Sofia

4.9. Atsarginių kopijų kūrimas naudojant „Time Machine Mac OS X Leopard“ leidžia reguliariai kurti atsargines kompiuterio kopijas naudojant „Time Machine“ programą. Nustačius atitinkamus nustatymus, programa bus automatiškai paleista

4.9.2. Sukurkite pirmąją atsarginę kopiją naudodami „Time Machine“.

Iš knygos „Macintosh Tutorial“. autorė Skrylina Sofia

4.9.2. Pirmosios atsarginės kopijos kūrimas naudojant „Time Machine“ Prieš pradėdami kurti pirmąją atsarginę kopiją, turite įdėti išorinį diską arba turėti laisvą standžiojo disko skaidinį, skirtą tik atsarginei kopijai kurti.

4.9.4. Laiko mašinos naudojimas

Iš knygos „Macintosh Tutorial“. autorė Skrylina Sofia

4.9.4. „Time Machine“ naudojimas Atlikę reikiamus „Time Machine“ nustatymus ir sukūrę daug atsarginių kopijų, galite pradėti ieškoti ir atkurti ankstesnių failų versijų. Tam: 1. Atidarykite Finder langą ir pasirinkite failą, kurį norite atkurti.2. Jeigu

Virusai, skirtingai nei bakterijos, dauginasi tik gyvose ląstelėse. Šiuo atžvilgiu virusų auginimas gali būti vykdomas eksperimentinio gyvūno (vištienos embrionas kaip besivystantis organizmas vadinamas eksperimentiniais gyvūnais) arba gyvos ląstelės, išaugintos už kūno ribų, lygmeniu, t.y. ląstelių kultūros lygiu.

Laboratorinių gyvūnų naudojimas. Vienas iš virusų išskyrimo ir kultivavimo būdų yra užkrėsti laboratorinius gyvūnus. Jie naudojami išskirti virusams, kurie nesukelia citopatinių pokyčių ląstelių kultūrose ir nesidaugina viščiukų embrionuose. Laboratorinių gyvūnų naudojimas taip pat leidžia nustatyti virusinės infekcijos pobūdį pagal klinikinių simptomų kompleksą. Laboratoriniams gyvūnams dažniausiai naudojamos baltosios pelės, žiurkėnai, jūrų kiaulytės, triušiai, priklausomai nuo darbo tikslo ir tiriamų virusų tipo. Iš stambesnių gyvūnų naudojamos įvairių rūšių beždžionės ir kai kurie kiti gyvūnai. Iš paukščių naudokite viščiukus, žąsis, antis. Pastaraisiais metais buvo auginami naujagimiai (jautresni virusams), „sterilūs gyvūnai“ (ištraukiami iš gimdos ir laikomi steriliomis sąlygomis naudojant sterilų orą ir sterilizuotą maistą) ir grynos linijos gyvūnai su žinomu paveldimumu (inbred arba linijiniai gyvūnai). dažniau naudojamas.

Į eksperimentą imami tik sveiki gyvūnai, pageidautina iš vieno darželio ir vienos partijos. Tuo pačiu metu matuojama kūno temperatūra, nes ji kasdien svyruoja. Tiriamoji medžiaga skiriama atsižvelgiant į virusų tropizmą tam tikriems audiniams. Taigi, norint išskirti neutrotropinius virusus, medžiaga suleidžiama į smegenis, pneumotropinių virusų išskyrimui - per nosį (taikant lengvą eterio anesteziją).

Laboratoriniams gyvūnams, užsikrėtus viruso turinčia medžiaga, svarbu laiku ir teisingai bei aseptiškai paimti medžiagą tolesniems tyrimams. Viruso išskyrimo rezultatai laikomi teigiamais, jei po atitinkamo inkubacinio laikotarpio gyvūnui pasireiškia infekcijos simptomai.

Viščiukų embrionų naudojimas. Embriono audiniuose, jo membranose, trynio maišelyje gali daugintis daug patogeninių žmogaus ir gyvūnų virusų. Šiuo atveju svarbus virusų selektyvumas konkrečiam audiniui: raupų virusai gerai dauginasi ir kaupiasi choriono-alantojo membranos ląstelėse, kiaulytės virusas amnione, gripo virusai amnione ir alantois, pasiutligės virusas. trynio maišelyje.

Virusų auginimas besivystančiose embrionuose turi nemažai pranašumų prieš kitus metodus: tankus apvalkalas gana patikimai apsaugo vidinį turinį nuo mikrobų; užkrečiant viščiukų embrionus, gaunamas didesnis virusų turinčios medžiagos derlius nei naudojant kitus auginimo būdus; vištų embrionų užkrėtimo būdas yra paprastas ir prieinamas bet kuriai virusologinei laboratorijai; embrionai turi pakankamą gyvybingumą ir atsparumą išorinių veiksnių patogenams. Tačiau vištienos embrionai ne visada yra be latentinių virusinių ir bakterinių infekcijų. Sunku stebėti patologinių pokyčių, atsirandančių embrione po užsikrėtimo virusu, dinamiką. Užkrėstų embrionų skrodimas dažnai neatskleidžia jokių matomų pakitimų, o virusas aptinkamas naudojant hemagliutinacijos testą ir kitus metodus. Užkrėstuose embrionuose neįmanoma stebėti antikūnų titro padidėjimo. Metodas tinka ne visiems virusams.

Virusologiniams tyrimams naudojami 7-12 dienų amžiaus embrionai, gauti iš paukštynų. Embrionus galite auginti įprastu termostatu, kurio apačioje dedami padėklai su vandeniu, kad sudrėkintų orą. Temperatūra termostate turi būti 37 ° C, o drėgmė - 60-65%. Rinkitės didelius, švarius (bet neplautus), apvaisintus baltų viščiukų kiaušinius, laikomus ne ilgiau kaip 10 dienų 5-10°C temperatūroje. Apvaisinti kiaušinėliai atpažįstami iš gemalinio disko, kuris, peršviečiamas ovoskopu, atrodo kaip tamsi dėmė.

Dirbant su virusais, gali būti naudojami įvairūs embrionų užkrėtimo būdai, tačiau praktiškiausias pritaikymas – viruso uždėjimas ant choriono-alantojo membranos, įvedimas į alantoinę, amniono ertmę ir trynio maišelį.

(10.5 pav.). Metodo pasirinkimas priklauso nuo tiriamo viruso biologinių savybių.

Ryžiai. 10.5.

Prieš užsikrėtimą embriono gyvybingumas nustatomas ovoskopu. Gyvi embrionai yra mobilūs, aiškiai matomas membranų kraujagyslių pulsavimas. Uždegdami ant kiauto paprastu pieštuku pažymėkite oro maišelio ribas arba embriono vietą, kurią lemia jo šešėlis ant kiauto.

Vištienos embrionai užkrečiami dėžutėje griežtai aseptinėmis sąlygomis, naudojant virimo sterilizuotus instrumentus.

Užsikrėtus choriono-alantoine membrana, labiausiai tinka 12 dienų amžiaus embrionai. Infekcijai alantoidinėje ertmėje naudojami 10-11 dienų embrionai, vaisiaus vandenų ertmėje - 7-11 dienų amžiaus, trynio maišelyje - 7 dienų amžiaus embrionai.

Kiaušiniai su užkrėstais embrionais dedami ant stovų buku galu į viršų. Temperatūros režimas ir inkubacinis laikotarpis priklauso nuo užkrėsto viruso biologinių savybių. Embrionų gyvybingumas kasdien stebimas ovoskopu. Embrionai, kurie mirė pirmą dieną po užsikrėtimo dėl sužalojimo, nėra tiriami.

Prieš renkant medžiagą, embrionai 18–20 valandų atšaldomi 4 °C temperatūroje, kad susitrauktų kraujagyslės ir būtų išvengta kraujavimo skrodimo metu. Embrionai atidaromi dėžutėje laikantis aseptikos taisyklių.

Alantoinis skystis siurbiamas pipete, sterilumas kontroliuojamas inokuliuojant į cukrų arba mėsos-peptono sultinį, patikrinama, ar hemagliutinacijos reakcijoje nėra viruso, ir laikomas 4 °C temperatūroje užšaldytas.

Norint gauti vaisiaus vandenų, pirmiausia išsiurbiamas alantojo skystis, tada vaisiaus vandenų membrana fiksuojama pincetu, šiek tiek pakeliama, o vaisiaus vandenys išsiurbiami Pasteur pipete.

Tiriant choriono-alantojo membranos pokyčius, ji perpjaunama žirklėmis ir visas turinys per skylutę supilamas į Petri lėkštelę. Choriono-alantojo membrana lieka apvalkalo viduje ir pincetu pašalinama į Petri lėkštelę su fiziologiniu tirpalu. Čia jis plaunamas, tiesinamas ir tiriamas židininių pažeidimų pobūdis tamsiame fone.

Norint gauti amniono membraną, vaisiaus vandenų maišelis, kuriame yra embrionas, yra perpjaunamas ir pašalinamas iš embriono, apžiūrimas, ar nėra pažeidimų.

Norint gauti trynio plėvelę, chorionas-alantois išpjaunamas, išsiurbiami alantojo ir amniono skysčiai, vaisius išimamas pincetu, atskiriamas virkštele, suimamas trynio maišelis ir dedamas į Petri lėkštelę. Stebėkite sterilumą, patikrinkite, ar nėra pažeidimų. Jei reikia, trynį galima išimti švirkštu, neišimant trynio maišelio.

Viruso buvimas infekuoto embriono alantoiniame ir vaisiaus vandenyse nustatomas atliekant hemagliutinacijos testą. Ištyrus sterilumą, skysčiai iš embrionų, kurių hemagliutinacija yra teigiami, sujungiami ir titruojami atliekant išplėstinį hemagliutinacijos testą.

Esant nedideliam viruso kiekiui arba kai neįmanoma jo aptikti tiriamojoje medžiagoje, viščiukų embrionai atliekami iš eilės. Jei po trijų paskesnių embrionų pasėjimų viruso tiriamojoje medžiagoje neaptinkama, rezultatas laikomas neigiamu.

Ląstelių kultūrų naudojimas. Norint auginti ląsteles už kūno ribų, reikia įvykdyti daugybę sąlygų. Vienas iš jų – griežtas sterilumo laikymasis darbo metu, nes naudojamos maistinės terpės yra puikus maistinių medžiagų substratas ir bakterijoms bei grybeliams. Audinių ląstelės yra labai jautrios sunkiųjų metalų druskoms. Todėl įvairių ingredientų, iš kurių gaminami druskos tirpalai ir maistinės terpės, kokybei, taip pat ląstelių kultūroje naudojamų indų ir guminių kamščių apdorojimo būdams turi būti teikiama išskirtinė reikšmė.

Viena iš sėkmingo darbo su ląstelėmis prielaidų yra aukšta distiliuoto vandens kokybė (tikrinama du kartus per savaitę). Darbui su ląstelėmis naudojamas bidistiliuotas arba dejonizuotas vanduo. Geriausi distiliuotojai yra įrenginiai iš stiklo arba legiruotojo plieno: iš tokios įrangos neišplaunami ląstelėms toksiški sunkiųjų metalų jonai. Dejonizuotas vanduo gaunamas specialiuose įrenginiuose, kuriuose vanduo išvalomas iš druskų, einant per kolonėles su anijonitu ir katijonu.

Auginant ląsteles, ypač aukšti reikalavimai keliami indų ir kamščių paruošimui ir sterilizavimui. Daugeliu atvejų būtent dėl jų netinkamo plovimo ir sterilizavimo ląstelės neprisiriša prie stiklo arba greitai degeneruojasi ląstelių vienasluoksnis sluoksnis.

Ląstelių augimui ir dauginimuisi už kūno ribų reikalingas sudėtingas fizikinių ir cheminių veiksnių rinkinys: tam tikra temperatūra, vandenilio jonų koncentracija, neorganiniai junginiai, angliavandeniai, aminorūgštys, baltymai, vitaminai, deguonis ir anglies dioksidas, todėl virusų auginimas ląstelių kultūrose, naudojamos sudėtingos sudėties maistinės terpės. Pagal jų sudėtį sudarančių komponentų pobūdį šios terpės skirstomos į dvi grupes.

1. Terpės, kurios yra druskos tirpalų (Hanks, Earl ir kt.) ir natūralių komponentų (gyvūnų ir žmonių kraujo serumo, albumino hidrolizato) mišiniai. Kiekvieno iš šių komponentų kiekis skirtingose terpėse yra skirtingas.
2. Sintetinės ir pusiau sintetinės terpės, susidedančios iš fiziologinių tirpalų (Earl, Hanks ir kt.), pridedant aminorūgščių, vitaminų, kofermentų ir nukleotidų (Eagle media, 199 ir kt.). Sintetinėse terpėse ląstelės gyvybingos būsenos gali egzistuoti trumpą laiką (iki 7 dienų). Norint juos ilgiau išlaikyti gyvybingoje būsenoje, taip pat sukurti geresnes sąlygas ląstelėms augti ir daugintis, į sintetinę terpę dedama gyvulių (karvių, veršelių ir kt.) kraujo serumo.

Virusams išskirti gali būti naudojami įvairūs ląstelių kultivavimo už kūno ribų metodai. Tačiau šiuo metu viensluoksnės pirminių tripsinizuotų ir persodintų ląstelių linijų kultūros gavo didžiausią praktinį pritaikymą. Vieno sluoksnio ląstelių kultūros auginamos 1 l, 250 ir 100 ml talpos stikliniuose plokščiasieniuose induose-čiužiniuose arba įprastuose bakteriologiniuose mėgintuvėliuose, apdorotuose tinkamu būdu.

Naudojant pirmines tripsinizuotas ląstelių kultūras, metodo esmė glūdi tarpląstelinių jungčių sunaikinimas audiniuose proteolitiniais fermentais ir ląstelių atskyrimas, kad ant stiklo paviršiaus išaugtų vienasluoksnis sluoksnis. Ląstelių gavimo šaltinis gali būti žmonių ir gyvūnų embrionų, paskerstų gyvūnų ir paukščių audiniai ir organai, taip pat iš žmogaus išgauti operacijos metu. Naudokite normalius ir piktybinius degeneruotus audinius, epitelio, fibroblastinio tipo ir mišrius. Gebėjimas daugintis iš organizmo išskirtų ląstelių yra glaudžiai susijęs su audinių diferenciacijos laipsniu. Kuo audinys mažiau diferencijuotas, tuo intensyvesnis jo ląstelių gebėjimas daugintis in vitro. Todėl embrioninių ir naviko audinių ląsteles daug lengviau kultivuoti už kūno ribų nei įprastas suaugusių gyvūnų ląsteles.

Kasdienės kultūros apžiūrimos mažo padidinimo mikroskopu, siekiant nustatyti jų augimo pobūdį. Jei ląstelės nesidaugina, atrodo apvalios, grūdėtos, tamsios ir nulupa nuo stiklo, stikliniai indai yra prastai apdoroti arba auginimo terpėje esantys ingredientai yra toksiški.

Kartu su pirminiais tripsinizuotais audiniais, virusų auginimui plačiai naudojamos persodintų ląstelių kultūros; ląstelių kultūros, galinčios neribotą laiką daugintis už kūno ribų. Dažniausiai naudojamos ląstelių kultūros, gautos iš normalių ir vėžinių žmogaus audinių. Plačiai žinoma HeLa ląstelių linija, gauta iš gimdos kaklelio naviko, Hep-2 iš gerklų karcinomos, KV iš burnos ertmės vėžio audinio. Tokios ląstelių kultūros ruošiamos ir iš normalių gyvūnų audinių – beždžionės, triušio ir kiaulės embriono (10.1 lentelė).

Persodintoms ląstelėms persodinti maistinė terpė išsiurbiama pipete ir išpilama. Susidaręs plonas ląstelių sluoksnis sunaikinamas tripsino tirpalu, o tokiu būdu išsiskyrusios ląstelės perkeliamos į naują indą su šviežiu maistinių medžiagų tirpalu, kur vėl susidaro vienasluoksnis ląstelių sluoksnis.

Viruso buvimo užkrėstose ląstelių kultūrose rodiklis gali būti:

a) specifinės ląstelių degeneracijos vystymasis;
b) tarpląstelinių intarpų aptikimas;
c) specifinio antigeno nustatymas imunofluorescencijos būdu;
d) teigiama hemadsorbcijos reakcija;
e) teigiama hemagliutinacijos reakcija;
e) apnašų susidarymas.

10.1 lentelė

Dažniausiai naudojamų ląstelių kultūrų sąrašas

Norint nustatyti specifinę degeneraciją užkrėstose kultūrose, ląstelės kasdien tiriamos mažo padidinimo mikroskopu. Daugelis virusų, besidaugindami ląstelėse, sukelia jų degeneraciją, t.y. turi citopatogeninį poveikį (CPA) (10.6 pav.).

Ryžiai. 10.6.

Užkrėstų ląstelių kultūrų vystymosi laiką ir citopatinių pokyčių pobūdį lemia užkrėsto viruso savybės ir dozė, taip pat ląstelių auginimo savybės ir sąlygos. Vieni virusai CPP sukelia per pirmąją savaitę po užsikrėtimo (raupai, poliomielitas, Coxsackie B ir kt.), kiti – po 1-2 savaičių. po užsikrėtimo (adenovirusai, paragripo virusai, ECHO ir kt.).

Virusai sukelia trijų pagrindinių tipų citopatinius pokyčius: susidaro daugiabranduolės milžiniškos ląstelės ir simpplastai, kurie yra daugelio ląstelių citoplazmos susiliejimo rezultatas; apvalių ląstelių degeneracija, atsirandanti dėl tarpląstelinių ryšių praradimo ir ląstelių apvalinimo; ląstelių dauginimosi židinių vystymasis, susidedantis iš kelių ląstelių sluoksnių.

Kai kuriems virusams dauginant ląstelių kultūrose, paveiktų ląstelių citoplazmoje arba branduolyje susidaro tarpląsteliniai intarpai. Ląstelių kultūros inkliuzams aptikti auginamos stiklinėse plokštelėse mėgintuvėliuose, užkrėstos virusu, o po tam tikrų inkubacinių laikotarpių paruošiami preparatai, dažant juos įprastais dažais.

Norint aptikti specifinį antigeną užkrėstose ląstelių kultūrose, preparatai ruošiami taip pat, kaip ir inkliuzams nustatyti naudojant MFA.

Apnašų metodas pagrįstas virusu užkrėstų ląstelių monosluoksnio susidarymu po pakitusios spalvos zonų, susidedančių iš išsigimusių (negyvų) ląstelių, sluoksniu. Šios sritys, vadinamos plokštelėmis, yra virusų kolonijos, dažniausiai susidarančios iš vienos viruso dalelės.

Nesant citopatinių pokyčių, tarpląstelinių inkliuzų, apnašų susidarymo, neigiamų hemadsorbcijos ir hemagliutinacijos reakcijų ląstelių kultūrose, užkrėstose tiriamąja medžiaga, atliekami du pasėjimai. Nesant šių pokyčių paskutiniame pasėjime, viruso išskyrimo rezultatas laikomas neigiamu.

Virusams aptikti infekcinėje medžiagoje gali būti naudojami šie metodai.

Mikroskopinis:

a) viroskopija;
b) tarpląstelinių intarpų nustatymas.

Imunologiniai:

a) imuninė elektroninė mikroskopija;
b) imunofluorescencija;
c) hemagliutinacija;
d) hemadsorbcija.

Virusų identifikavimas atliekamas naudojant imunologinius metodus, įskaitant šias reakcijas:

a) hemagliutinacijos slopinimas;
b) hemadsorbcijos vėlavimai;
c) komplemento surišimas;
d) neutralizavimas;
e) nusodinimas agaro gelyje.

mikroskopiniai metodai. Šviesos mikroskopu galima aptikti tik didelius virusus, didesnius nei 150 nm. Mažesnius virusus atpažinti įmanoma tik elektroniniu mikroskopu. Dideliems virusams aptikti galima naudoti šviesos, fazės kontrasto ir fluorescencinę mikroskopiją.

Virusinių infekcijų metu užkrėstose ląstelėse susidaro savotiški intarpai. Kai kurias infekcijas lydi intarpų susidarymas paveiktų ląstelių citoplazmoje (pasiutligė, raupų vakcina), kitos – citoplazmoje ir branduolyje (tymų, natūralūs ir vėjaraupiai, adenovirusinės ligos). Inkliuzai turi skirtingą pobūdį, struktūrą, formą ir dydį nuo 0,25 iki 25 mikronų. Remiantis šiuolaikiniais duomenimis, kai kurių infekcijų atveju inkliuzai yra viruso dauginimosi vieta ir atspindi jo sankaupas, apsuptas ląstelių medžiagų, o kitose jie yra ląstelių degeneracijos produktas.

Inkliuzai gali būti aptikti nudažytuose organų ir audinių atspauduose, ląstelių nuogranduose, paveikto audinio histologiniuose pjūviuose ir virusu užkrėstuose ląstelių kultūros preparatuose. Dažymas dažnai atliekamas pagal Romanovskio-Giemsa metodą. Norėdami dažyti šiuo metodu, preparatai fiksuojami Dubosque - Brazil - Bouin mišinyje, kurį sudaro pikrino rūgštis, formalinas, alkoholis, acto rūgštis. Daugumos virusinių infekcijų tarpląsteliniai intarpai yra oksifiliniai ir nusidažo rožine arba alyvine spalva pagal Romanovskio-Giemsa metodą.

Imunologiniai virusinių infekcijų diagnostikos metodai. Pastaraisiais metais šie metodai tapo pirmaujantys laboratorinėje virusinių infekcijų diagnostikoje. Taip yra daugiausia dėl ekonominių priežasčių, nes klasikiniai virusologinės analizės metodai yra gana brangūs. Be to, tyrimų taikant virusologinius metodus trukmė (savaitės), net jei jie yra gana veiksmingi, daro juos retrospektyviais.

Imunologiniai metodai taikomi tiek viruso antigenams įvairiuose biosubstratuose ir aplinkos objektuose nustatyti, tiek serodiagnostikai – antikūnų prieš virusinius antigenus nustatymui sergančių žmonių ir laboratorinių gyvūnų kraujo serume. Be to, imunologiniai tyrimo metodai yra būtini nustatant virionus.

Sąveikaujant su kūnu virusai sukelia antikūnų susidarymą, kurie, adsorbuoti ant virionų, neleidžia virionams prasiskverbti į ląsteles ir vystytis citopatiniam poveikiui (CPE); neutralizuoti mirtiną virusų poveikį jų dauginimosi metu viščiukų embrionams ir gyvūnams; inaktyvuoja viriono hemagliutininus ir neuraminidazę, užkertant kelią hemagliutinacijos reakcijai (RGA) ir hemadsorbcijos reakcijai (RGads) viruso paveiktose ląstelėse. Šie virusą neutralizuojantys antikūnai taip pat sukelia viruso dalelių agliutinaciją ir nusodinimą, o susidarę imuniniai kompleksai jungiasi su komplementu. Todėl virionams identifikuoti naudojama klasikinė ląstelių kultūrų, vištų embrionų ir gyvūnų neutralizacijos reakcija (PH) ir jos modifikacijos: hemagliutinacijos slopinimo reakcija (HITA); hemadsorbcijos slopinimo reakcija (RTGads). Tos pačios reakcijos naudojamos virusinių infekcijų serodiagnostikoje, siekiant nustatyti virusą neutralizuojančius antikūnus pacientų serume pagal žinomą viruso antigeną (diagnosticum).

Imunoelektroninės mikroskopijos (IEM) metodas. Šiuo metu elektroninė mikroskopija atlieka svarbų vaidmenį tiriant virusus. Būtent elektroninės mikroskopijos duomenys yra šiuolaikinės virusų klasifikacijos pagrindas.

Naujas elektroninio mikroskopinio virusų tyrimo vystymosi etapas yra imunoelektroninės mikroskopijos metodų naudojimas. Naudojant šį metodą, tapo įmanomas ne tik tiesioginis virusų aptikimas, bet ir jų identifikavimas, taip pat greitas viruso padermių serotipų nustatymas ir antikūnų prieš juos titravimas. IEM įgijo didelę reikšmę nustatant viruso antigenų lokalizaciją makroorganizmo ląstelėse.

Neabejotinas IEM pranašumas yra didelis jautrumas, palyginti su įprastais elektroninės mikroskopijos metodais.

Kai viruso antigenas arba viruso komponentas liečiasi su homologiniu antiserumu, susidaro antikūno ir antigeno kompleksas. Šis reiškinys yra technikos, naudojamos virusų antigenams arba antikūnams prieš juos aptikti ir identifikuoti, pagrindas. Būtent šiuos antigenų kompleksus su antikūnais po neigiamo dažymo galima stebėti elektroniniu mikroskopu. Klinikinėje diagnostikoje antigeninės medžiagos nereikia kruopščiai išvalyti. Taigi, nustačius gripo virusą, galima ištirti neišgrynintą alantojo skystį. Šiuo metu manoma, kad IEM tinka beveik bet kokia klinikinė medžiaga. Diagnostikos tikslais gali būti naudojami įprasti nefrakcionuoti serumai, taip pat sveikstančių pacientų serumai. Pažymėtina, kad antigeno ir antikūnų kiekių santykis turi didelę įtaką galutiniams rezultatams. Esant antigeno pertekliui, pastebima dalelių gausa; aglomeratų šiuo atveju bus nedaug. Esant antikūnų pertekliui, viruso dalelės yra apsuptos storu jų sluoksniu, beveik neįmanoma atskleisti smulkių viriono struktūrinių detalių; agregatų taip pat nedaug. Esant optimaliam antigeno ir antikūnų santykiui, agregatai padidinami ir gerai matomos virionų detalės. Atsižvelgiant į tai, kas išdėstyta pirmiau, imuninį serumą pageidautina naudoti keliais praskiedimais.

Ant atraminio tinklelio uždedama atraminė plėvelė iš paladžio. Naudojant mažas paladžio koncentracijas ir siekiant pagerinti substrato adsorbcijos savybes, jis yra sutvirtintas anglimi. Norėdami tai padaryti, ant gatavo sauso plėvelės substrato ant elektronų mikroskopinio tinklelio vakuume purškiama anglis. Plėvelės-pagrindo storis ir armuojantis anglies sluoksnis turi didelę įtaką smulkių objekto detalių kontrastui ir įvaizdžiui. Kiekvienas tyrėjas individualiai nustato pagrindo plėvelių ir anglies sluoksnio konkretų storį, remdamasis tuo, kad anglis yra elektroniškai skaidresnė nei paladis.

Virusai ir antikūnai prieš juos turi mažą elektronų tankį. Todėl biologinių objektų negalima aptikti naudojant elektroninį mikroskopą be išankstinio apdorojimo. Virusai vizualizuojami naudojant neigiamo kontrasto (arba neigiamos dėmės) metodą. Virusų ir virusų-antikūnų kompleksų neigiamam dažymui naudojamos įvairios sunkiųjų metalų druskos. Kontrastinės medžiagos (sunkiųjų metalų atomai) prasiskverbia į hidrofilines objektų sritis ir pakeičia jose vandenį. Dėl to objekto elektronų tankis didėja, jį galima stebėti elektroniniu mikroskopu.

Tiesioginis IEM metodas buvo labiausiai pritaikytas praktikoje. Viruso suspensija sumaišoma su neskiestu antiserumu. Po intensyvaus maišymo mišinys inkubuojamas 1 val

37°C, po to per naktį 4°C. Kitą dieną mišinys centrifuguojamas, kad nusodintų imuninius kompleksus. Nuosėdos resuspenduojamos lašelyje distiliuoto vandens ir veikiamos neigiamu kontrastu.

Vertinant IEM rezultatus, antigeno ir antikūno sąveikos produktai elektroniniu mikroskopu gali turėti skirtingą išvaizdą (viena viruso dalelė, visiškai arba iš dalies padengta antikūnais; virusinių dalelių aglomeratai). Aglomeratai gali užimti skirtingą plotą, turėti skirtingą išvaizdą ir turėti skirtingą dalelių skaičių. Todėl kartu su eksperimentiniais būtina tirti ir kontrolinius preparatus (su buferiniu tirpalu arba heterologiniu antiserumu).

Rezultatų, gautų naudojant IEM, vertinimo kriterijus yra tai, ar preparatuose nėra virusinių dalelių, agreguotų imuninio serumo, sankaupų. Antigeno aglomeratų ir specifinių antiserumo antikūnų buvimas yra teigiamos reakcijos požymis. Nepaisant to, reikia atsižvelgti į nespecifinio antigeno dalelių agregacijos galimybę veikiant didelio greičio centrifugavimui. Dėl šios priežasties daugelis autorių rekomenduoja įvertinti rezultatus sąlyginėje skalėje nuo 0 iki 4+. Jis pagrįstas agreguotų dalelių padengimo serumo antikūnais laipsnio įvertinimu.

Hemagliutinacijos ir hemadsorbcijos metodai. Daugelis virusų turi galimybę agliutinuoti griežtai apibrėžtų žinduolių ir paukščių rūšių eritrocitus. Taigi, gripo ir kiaulytės virusai agliutinuoja vištų, jūrų kiaulyčių ir žmonių eritrocitus; erkinio encefalito virusas – avies eritrocitai; Japoninio encefalito virusai – vienadienių viščiukų ir žąsų eritrocitai; adenovirusai – žiurkių, pelių, beždžionių eritrocitai. Hemagliutinacijos reakcijoje (HA) kaip tiriamoji medžiaga naudojami alantoinas, amniono skysčiai, vištų embrionų choriono-alantojo membranų suspensija, suspensijos ir ekstraktai iš virusais užkrėstų gyvūnų ląstelių ar organų kultūrų. Hemagliutinacijos reakciją galima nustatyti lašinimo būdu ant stiklo ir išplėstoje eilėje mėgintuvėliuose arba polistireno plokštelių šuliniuose. Pirmasis metodas yra orientacinis.

Kadangi RGA yra specifinė grupei, ji neleidžia nustatyti virusų rūšių. Jie nustatomi naudojant hemagliutinacijos slopinimo testą (HITA). Jo gamybai naudojami žinomi imuniniai antivirusiniai serumai. Į kiekvieną skiedimą įpilamas vienodas kiekis viruso turinčio skysčio. Kontrolė yra viruso sustabdymas.

Mišinys laikomas termostate, tada įpilama eritrocitų suspensija. Po kelių minučių nustatomas neutralizuojančio serumo titras, t.y. maksimalus jo praskiedimas, dėl kurio sulėtėjo eritrocitų agliutinacija.

Serologinėje virusinių ligų diagnostikoje RTHA rekomenduojama naudoti su poriniais serumais, kurių vienas gaunamas ligos pradžioje, kitas – po 1-2 savaičių ir daugiau. Keturis kartus padidėjęs antikūnų titras antrajame serume patvirtina siūlomą diagnozę.

Hemadsorbcijos reakcija (RGads) naudojama užkrėstose ląstelių kultūrose nurodyti virusą, pasižymintį hemagliutinuojančiu aktyvumu. Reakcijos esmė slypi tame, kad virusų hemagliutinuojančiam poveikiui jautrūs eritrocitai adsorbuojami virusais užkrėstų ląstelių paviršiuje. Pavyzdžiui, vištienos eritrocitai adsorbuojami ant varpų virusu užkrėstų ląstelių; tymų virusas – beždžionių eritrocitai; adenovirusai – beždžionės ir žiurkės ir kt.

Neutralizacijos reakcija (PH). Dauginantis ląstelių kultūrose, virusai sukelia įvairių rūšių CPD, pasireiškiančią apvalinimu, raukšlėjimu, sumažinimu arba, atvirkščiai, ląstelių dydžio padidėjimu, jų susiliejimu ir simpplastų susidarymu, citoplazmos ir branduolio sunaikinimu. Galiausiai viename ląstelių sluoksnyje, užkrėstame virusais, joms sunaikinus tam tikras ląstelės sluoksnio dalis, gali atsirasti „sterilių dėmių“ arba apnašų, kurios yra virusinės dalelės klonas, leidžiantis ne tik izoliuoti virusą, bet ir nustatyti jo titrą.

Labai sunku atpažinti virusą pagal plokštelių pobūdį, todėl jie imasi izoliuoto viruso PH nustatymo su žinomais virusą neutralizuojančiais serumais. Tuo tikslu iš paciento gautas virusas kaupiamas ląstelių kultūroje ir įvairūs jo skiedimai sumaišomi su neskiestu antivirusiniu serumu.

Virusų ir serumų mišinys gali užkrėsti jauniklių embrionus arba jautrius gyvūnus. Tokiais atvejais antikūnų neutralizuojantį aktyvumą dažniausiai lemia virusinių hemagliutininų neutralizavimas embriono skysčiuose ir mirtino viruso poveikio embrionams bei gyvūnams pašalinimas. Tuo pačiu metu apskaičiuojamas neutralizacijos indeksas, kuris išreiškia didžiausią mirtinų viruso dozių skaičių, kurį neutralizuoja šis serumas, lyginant su kontrolinio eksperimento rezultatais, paimtais vienu.

Panašiai, naudojant PH, virusai, išskirti iš pacientų medžiagos, nustatomi, kai jie užkrečia vištų embrionus ir gyvūnus. Norėdami tai padaryti, į virusą neutralizuojančius serumus pridedami virusų turintys embrionų skysčiai ir pažeistų gyvūnų organų suspensijos. Po tam tikro inkubavimo laiko ląstelių kultūros, viščiukų embrionai ir gyvūnai užkrečiami mišiniais.

Serodiagnozuojant virusines infekcijas, nustatoma žinomo viruso virusą neutralizuojančių antikūnų titro didėjimo dinamika. Tuo pačiu metu PH nustatomas su poriniais serumais, paimtais iš pacientų ligos pradžioje ir pabaigoje. Diagnostika bus 4 kartus padidėjęs imunoglobulinų titras antroje iš jų.

PH pagrįstas specifinių antikūnų gebėjimu pakankamai stipriai prisijungti prie viruso dalelės. Dėl viruso ir antikūno sąveikos viruso infekcinis aktyvumas neutralizuojamas dėl antigeninių determinantų, atsakingų už viruso dalelės sujungimą su jautriomis ląstelėmis, blokados. Dėl to virusas praranda gebėjimą daugintis jautrioje biologinėje sistemoje in vitro arba in vivo.

PH rezultatai išryškėja po to, kai viruso ir jo homologinių antikūnų mišinys po tam tikro laiko poveikio patenka į jautrią biologinę sistemą (audinių ląstelių kultūrą, viščiuko embrioną, jautrų gyvūno kūną), kur virusas gali daugintis ir sukelti išmatuojamą. pokyčiai, kurie iš dalies arba visiškai nuslopinami esant antikūnams.

Yra trys PH komponentai:

1) virusas;
2) serumas, kuriame yra antikūnų;
3) biologinis objektas (laboratoriniai gyvūnai, besivystantys vištų embrionai, audinių kultūros), kurio pasirinkimas priklauso nuo viruso, su kuriuo ketinama atlikti tyrimus, tipo.

PH naudojamas izoliuotam patogenui identifikuoti arba antikūnams serume aptikti ir titruoti. Pirmuoju atveju naudojami specialiai imunizuotų laboratorinių gyvūnų arba pasveikusių žmonių serumai. Antruoju atveju naudojami serumai, paimti pradinėje ligos stadijoje ir sveikimo laikotarpiu.

Virusą neutralizuojantys antikūnai pasveikusių žmonių serume, skirtingai nei antihemagliutininai ar komplementą fiksuojantys antikūnai, išlieka daugelį metų, o sergant kai kuriomis virusinėmis infekcijomis (pavyzdžiui, tymais) – net visą gyvenimą. Tai leidžia kai kuriais atvejais kaip etaloninį vaistą naudoti daugelio sveikstančių pacientų serumų telkinį, kuris supilstytas į ampules ir liofilizuotas ilgą laiką tinkamas diagnostiniam darbui.

Identifikuojant izoliuotus patogenus, naudojami iš anksto paruošti įvairių gyvūnų hiperimuniniai serumai: triušių, baltųjų žiurkių ir pelių, jūrų kiaulyčių, beždžionių, avių, arklių ir kt. Hiperimuninių serumų aktyvumas PH priklauso nuo gyvūnų imunizacijos metodo.

Prieš pradedant kiekvieną neutralizacijos eksperimentą, virusas iš anksto titruojamas, nustatant galutinį praskiedimą, sukeliantį audinių kultūros pažeidimą arba laboratorinių gyvūnų (arba viščiukų embrionų) infekciją. Viruso titras išreiškiamas kaip 50 % dozė (TCID50 – 50 % infekcinė dozė audinių kultūrai).

Molekulinės genetinės diagnostikos metodai virusologinėje praktikoje. Molekulinės biologijos metodai buvo sukurti šeštajame dešimtmetyje. XX amžiuje. Jie tapo įmanomi dėl to, kad kiekvieno viruso genome yra unikalios rūšiai būdingos nukleotidų sekos, kurias aptikus galima identifikuoti bet kurį infekcijos sukėlėją. Šie metodai yra svarbiausi identifikuojant mikroorganizmus, kurie yra ilgalaikiai arba sunkiai kultivuojami įprastiniais metodais. Aštuntajame dešimtmetyje DNR zondo aptikimas buvo naudojamas infekciniam sukėlėjui ar mutacijai aptikti, remiantis specifinių oligonukleotidų zondų, paženklintų radioaktyviuoju izotopu (arba fluorochromu), hibridizacija su izoliuotu DNR mėginiu. Hibridizacijos analizė naudoja nukleino rūgščių gebėjimą tam tikromis sąlygomis sudaryti specifinius kompleksus su nukleino rūgštimis, turinčiomis joms komplementarias sekas. Infekcinių patogenų aptikimo DNR hibridizacijos būdu metodas pasirodė esąs itin daug darbo reikalaujantis, daug laiko ir brangus. Be to, jo jautrumas yra nepakankamas, kad būtų galima identifikuoti mikroorganizmus klinikinėse medžiagose, tokiose kaip išmatos ir šlapimas.

DNR hibridizacija buvo pakeista metodu, kuris imituoja natūralų DNR replikaciją ir leidžia aptikti ir pakartotinai kopijuoti tam tikrą DNR fragmentą naudojant termofilinę DNR polimerazę. Polimerazės grandininė reakcija (PGR) yra elegantiškas metodas, imituojantis natūralią DNR replikaciją ir leidžiantis aptikti ir pakartotinai nukopijuoti tam tikrą DNR dalį naudojant termofilinę DNR polimerazę.

Dėl savo aukštų diagnostinių savybių PGR yra visuotinai pripažintas priedas prie tradicinių virusologijos metodų: viruso dauginimo ląstelių kultūroje, imunologinio viruso antigenų nustatymo ir elektroninės mikroskopijos. Reikšmingas šio metodo privalumas – galimybė aptikti virusus esant latentinėms infekcijoms (citomegalovirusas, herpes virusas) ir sunkiai arba dar neįmanomus kultivuoti virusus (žmogaus imunodeficito virusas, Epstein-Barr virusas, žmogaus papilomos virusas, Vidr hepatito virusas). Su PGR metodu siejamos perspektyvos tirti tokias ligas kaip Creutzfeldt-Jakob liga, Alzheimerio liga ir išsėtinė sklerozė.