Микробиология - обширная современная наука, изучающая биохимические и физические свойства, морфологию и систематику бактерий. Мир прокариот богат огромным количеством различных видов. Чтобы исследовать все параметры этих микроорганизмов, ведется работа с их культурами на специальных питательных средах в стерильных условиях. Культуральные свойства бактерий - это один из важнейших способов определения и изучения прокариот.
бактерий?
Не секрет, что прокариоты - это одноклеточные организмы. Они легко и быстро размножаются, удваивая свое количество, по некоторым данным, каждые 20-30 минут. Несложно догадаться, что перед нами роста культуры.
Колония - это потомство одной клетки, видимое скопление огромного количества микроорганизмов на питательной среде. По размеру колонии, ее цвету и другим морфологическим признакам в лаборатории определяют культуральные свойства бактерий.
Для изучения параметров отдельного скопления клеток прокариот используется специальная питательная среда. На ней микроорганизмы способны быстро размножаться, т. к. в состав входят важные для метаболизма бактерий вещества. В итоге через 4-5 суток (промежуток времени может варьировать) на чашке Петри появляются приметные видимые точки, с которыми и проводится работа.
Проба бактерий, полученная из какой-либо среды, предварительно разбавляется для уменьшения количества бактерий на единицу объема. Проводится эта процедура для комфортной работы в дальнейшем, т. к. при чрезмерном посеве микроорганизмов питательная среда может покрыться сплошным слоем колоний (так называемый «газон»). Тогда отдельные точки едва различимы, а многие процедуры становятся невозможными для проведения.
Понятие культуральные свойства бактерий
Каким образом проводится анализ колоний микроорганизмов? Какие параметры следует учесть при исследовании?
Характеристика колонии бактерий на питательной среде составляется по нескольким критериям. К ним относятся морфологические, биохимические, физиологические свойства микроорганизмов, и все эти параметры определяются в лаборатории поэтапно. Например, визуальные отличия колоний данной бактерии можно зарегистрировать сразу после их выращивания. Остальные признаки изучаются уже при помощи специального оборудования (микроскоп) или определенных методик работы с веществами-анализаторами метаболитов, пигментов, ферментов и других продуктов жизнедеятельности прокариот.
Некоторые культуральные свойства бактерий приведены ниже.
1. Размеры колонии. Она может быть очень мелкой, мелкой, средней и большой. Диаметр измеряется в миллиметрах и может находиться в диапазоне от 0,1 до 5 и более. Колонии, не превышающие 1 мм в диаметре, называются точечными.
2. Цвет, а также способность к выделению красящего пигмента в окружающую среду.
3.Поверхность. Здесь определяют, является ли она гладкой, шероховатой, бугристой или же вовсе складчатой.
4. Профиль колонии: кратерообразная, выпуклая, конусовидный или просто плоский.
5. Структура колонии. Она может быть однородной, струйчатой, крупнозернистой или мелкозернистой.
6. Оптические свойства: прозрачная, полупрозрачная, непрозрачная, флуоресцирующая, матовая или блестящая;
7. Консистенция. Колония может быть вязкой или жидкой, тестообразной или пленчатой, маслянистой или хрупкой.
8.Край колонии: ровный, лопастной, ризоидный, волнистый, зубчатый и т. д.
Если работа ведется с мелкими группами клеток, используется микроскоп. При небольшом увеличении можно разглядеть и край колонии, и ее профиль, и поверхность. Некоторые признаки исследуются с помощью химических веществ. Консистенцию можно узнать, дотронувшись стерилизованной петлей или пипеткой до колонии. Таким образом определяются культуральные и биохимические свойства бактерий.
Питательная среда
Для того чтобы бактерии активно размножались в лабораторных условиях, используются Они могут быть растительного или животного происхождения, а по консистенции - твердые или жидкие. Важными параметрами при изготовлении таких смесей является постоянная кислотность, осмотическое давление и, конечно же, наличие ферментов, витаминов, микро- и макроэлементов. Не стоит забывать и об источниках углерода, азота и водорода.
Питательная среда обязательно должна быть прозрачной или полупрозрачной, чтобы была возможность без ошибок определить культуральные свойства бактерий. Агар чаще всего используется как исходный материал для изготовления таких сред. Он может быть в жидком (расплавленном) состоянии, но преимущественно уже сразу заливается в чашке Петри и застывает.
Жидкие питательные среды тоже используются в лабораторных условиях, но, в связи с агрегатным состоянием физиология микроорганизмов, культуральные свойства бактерий изучаются немного по-другому. Здесь важны такие параметры, как степень мутности воды, поверхностный, пристеночный или же придонный рост. Зернистый осадок, однородный или же в виде хлопьев, и другие признаки, которые возможно наблюдать только в жидкостной среде.
Инструменты для работы
Манипуляции с требуют использования стерилизованных лабораторных инструментов. Посев и изучение культуральных свойств микроорганизмов требует наличия бактериальной петли или пастеровской пипетки. Оба инструмента должны быть стерилизованы в пламени спиртовки, а наконечник пипетки предварительно отколот.
Эти нехитрые приспособления помогут при работе с посевами в лаборатории как на твердой питательной среде, так и в жидкой.
3 этапа выделения изолированных колоний
Исходный материал, как правило, содержит смесь разнообразных бактерий. Выделение изолированных колоний необходимой группы клеток - это скрупулезный и требующий внимания процесс. Он условно делится на три этапа:
1. Выделение накопительной культуры бактерий, среди которых присутствует необходимая нам для исследования.
2. Выделение изолированных чистых колоний с помощью специальных селективных методов.
3. Выращивание и размножение клеток бактерий, проведение работы с ними.
Конечно, для «добычи» нужных бактерий следует искать места их наибольшей концентрации во внешней среде, а в случае патогенных или условно-патогенных прокариот можно вовсе использовать биологический метод исследования. Суть последнего заключается в том, что подбирается организм, который чувствителен к данной бактерии. Та размножается в подопытном животном, и в результате в пробе крови можно найти множество необходимых для работы клеток прокариот.
Выделение изолированных колоний
Культуральные свойства бактерий можно исследовать только у изолированных и чистых колоний. Чтобы получить таковые из нескольких десятков посторонних видов бактерий на чашке Петри, используют метод Коха. Его суть заключается в том, что на 3 разные и свободные от микроорганизмов чашки с питательной средой помещают нужных бактерий. Причем это делают одной и той же петлей или пипеткой по остаточному принципу, т. е. не соскребают дополнительно клетки бактерий после проведения по питательной среде первой и второй чашки. Так, уже на третьей количество бактерий уменьшится и можно будет спокойно найти нужную колонию для исследования.
Культуральные свойства - основы микробиологии
Изучение клеток бактерий всегда начинается с анализа их колонии. По определенному списку параметров описывается группа микроорганизмов на чашке Петри, а затем уже делается фиксированный мазок и готовится таким образом препарат. Его рассматривают с помощью микроскопа и уже описывают отдельные клетки колонии. Оба действия нужны для идентификации бактерий: патогенные они или нет, к какой систематической группе относятся и т. д.
Где можно обнаружить бактерий?
Практически везде. Они обитают и в воздухе, и в земной коре, и в воде, и в таких экстремальных условиях, как гейзеры, вулканы или, наоборот, арктические ледники. Миллиарды бактерий находятся и в нашем человеческом организме, и среди них присутствуют как полезные, так и патогенные виды.
Мазок с любой поверхности, если она не была предварительно стерилизована, на чашке Петри даст несколько различных видов колоний. Прорастет клетка бактерий или нет, зависит от состава питательного субстрата, что часто используется при выращивании необходимых микроорганизмов. Так, заранее готовится избирательная среда, на которой могут проживать только определенные виды бактерий.
Для систематизации или идентификации активно используются культуральные свойства бактерий. Микробиология часто встречается с такими проблемами, как высев и рост колоний, их выборка, стерилизация оборудования и скрупулезная работа над пламенем спиртовки.
Заключение
Во многих биологических лабораториях проводится исследование бактериальных клеток различного происхождения. Это и диагностические центры, и научные объединения. Культуральные свойства бактерий - это один из способов определения микроорганизмов, что помогает при работе с «коктейлями» из различных видов прокариот. Также знание о том, к какой систематической группе относится та или иная клетка, позволяет лишний раз проверить правильность хода исследования используемого материала.
Бактериальная колонизация – заселение ареала и образование микробного сообщества.
В лабораторных условиях колонизация - рост бактерий в виде колоний (отдельных округлых образований на плотных питательных средах (ППС).
В естественных условиях рост бактерий происходит в виде биопленок (рост на поверхности ППС).
По скорости своего размножения бактерии превосходят все другие организмы. В благоприятных условиях бактерии могут делится каждые 20 мин, образуя огромные по численности колонии.
При недостатке питательных веществ рост колонии бактерий останавливается. Многие бактерии при этом начинают образовывать споры, которые служат для сохранения особей, а не для размножения. Образуя спору, бактерия вырабатывает очень плотную оболочку. Споры предотвращают высыхание бактерии, способны переносить низкую или высокую температуры. Споры могут сохранять жизнеспособность сотни лет.
49. Особенности строение и функции бактериальной биопленки
В настоящее время признано, что большинство микроорганизмов в естественных и искусственно созданных окружающих средах существует в виде структурированных, прикрепленных к поверхности сообществ – биопленок.
Биопленка - микробное сообщество, характеризующееся клетками, которые прикреплены к поверхности или друг к другу, заключены в матрикс синтезированных ими внеклеточных полимерных веществ
Этапы образования биопленки:
Обратимая адгезия
Необратимая (рецепторно - опосредованная) адгезия (экзополисахариды)
Созревание биопленки
экспрессия генов, отвечающих за синтез сигнальных молекул:
Гр(+) - ацил-гомосериновые лактоны,
Гр(-)- короткоцепочечные пептиды
Состав матрикса: полисахариды микроорганизма и кислые полисахариды (муцин – продуцирует макроорганизм),
Феномен взаимодействия между бактериями получил название «quorum sensing или «чувство кворума
QS - бактериальный язык общения
(образование биопленок, патогенность, синтез антибиотиков)
Продукция экзогенных факторов патогенности бактериями в составе биопленок происходит только по достижению ими определенной критической массы бактериальных клеток, достаточных для преодоления защитных механизмов организма и успешного развития инфекционного процесса.
Доказана роль микробных биопленок в возникновении и развитии таких распространенных заболеваний, как:
инфекции, связанных с катетеризацией сосудов, вызванные Staphylococcus aureus и др. грамположительными микроорганизмами
инфекции сердечных клапанов и суставных протезов, вызываемые стафилококками
пародонтит, вызываемый рядом микроорганизмов полости рта
инфекции мочевыводящих путей, вызываемые Е. col i и др. патогенами,
инфекции среднего уха, вызываемые, например Haemophilus influenzae
Экологические преимущества биопленок
Облегчение доступа питательных веществ и метаболическая кооперация
Защита от негативных воздействий окружающей среды
Резистентность к антибактериальным агентам
Резистентность к антибактериальным агентам:
инактивация антибиотиков внеклеточными полимерами или ферментами,
замедлением метаболизма и, соответственно, уменьшение скорости роста микроорганизмов в условиях лимитирования питательных веществ в биопленке, из-за чего антибактериальный препарат диффундирует из биопленки быстрее, чем успеет на них подействовать,
экспрессия возможных генов резистентности
возникновение в биопленке под воздействием антибиотиков микроорганизмов-персистентов
Стратегии преодоления резистентности и борьбы с биопленками:
предотвращение первичного инфицирования имплантата,
минимизация начальной адгезии микробных клеток,
разработка методов проникновения через матрикс биопленки различных биоцидов с целью подавления активности связанных биопленкой клеток
разрушение матрикса
Колония микробов – это ограниченное скопление бактериальных клеток чаще всего одного вида, формы, которые формируются на поверхности (или же внутри) питательных составов. имеют свои критерии для определения и чаще всего могут быть лишь приблизительным ориентиром для их оценки.
Общие критерии для определения колоний
Современная микробиология использует такие общие критерии для определения той или иной бактериальной совокупности, оценки ее структуры:
- Величина. Крупные культуры могут иметь величину 6 мм и более, а мелкие – меньше, чем 1 мм.
- Форма. Как правило, различают правильную, то есть круглую, форму, эллипсоидную, розеточную, ризоидную.
- Окраска. Разные их виды могут быть белыми либо иметь всевозможную окраску.
- Прозрачность.
- Рельефность. Различают плоские, плосковыпуклые, куполообразные с возвышенной серединкой, с вдавлением формы.
- Поверхность. Она может быть гладкой, с морщинками, сухой, слизистой, хрупкой, мучнистой.
По всем этим признакам все совокупности микроорганизмов подлежат всестороннему исследованию. Такие признаки хорошо видны на фото, которые сделаны с использованием электронного микроскопа и других приборов.
Для чего используют колонии
Обычно они используются для получения чистых культур. Чистая культура – это популяция микроорганизмов одного вида, выращенная с использованием благоприятной среды. Много видов микроорганизмов различают по какому-то специфическому признаку. Их объединяют по разным критериям на биовары (то есть биологические варианты). На фото, сделанном с применением электронного микроскопа, возможно определение многих видов микробов:
- Хемовары – это варианты, которые различаются по биохимическим особенностям.
- Серовары – их отличают по генетическому признаку.
- Фаговары отличаются по .
В чашке Петри можно также производить посев на плотную среду. В таком случае биологический материал размещают возле ее краев.
Как происходит посев в чашке Петри
В чашку Петри материал, необходимый для получения культуры, наносится петлей, пипеткой или тампоном возле ее края. Шпатель быстро (на счет «раз») проносится через пламя. Очень осторожно биоматериал распределяется по всей поверхности чашки.
В чашке Петри возможен также посев при помощи укола в толщу питательного состава. При этом получается чистая совокупность микробов, и это хорошо видно на фото, сделанном с использованием микроскопа.
В прибор для получения колоний от бактерий можно также производить посев в толщу питательного раствора.
Другие способы получения бактериальных колоний
Возможно разведение колоний микробов по Коху. При этом материал, необходимый для определения, последовательно разводят (как правило, счет разведений доходит до четырех). На последнем этапе размножения в приборе, используемом для инкубации бактерий, появляются изолированные группы микробов, хорошо заметные на фото. Все такие колонии происходят из материнской клетки.
Подобная форма получения штаммов используется тогда, когда материал, подготовленный для определения, разводится в пробирке при помощи стерильного питательного бульона. Одна капля материала вносится в первую по счету чашку. Ее распределяют по всему сосуду. Далее по нему проводят стерильным шпателем, и в такой же форме делается посев во второй чашке. Эта форма существования колоний микроорганизмов позволяет получить самые чистые их штаммы, хорошо заметные на фото.
Выделение колоний в специальных приборах
Иногда для получения чистых совокупностей бактерий применяют специальные приборы. Они облегчают . В таких приборах можно создать все необходимые условия для их развития.
Чаще всего используют микроманипулятор. Это прибор, который позволяет извлекать всего лишь одну клетку из суспензии при помощи микропетли. На предметном столике микроскопа устанавливается влажная камера, в которой помещен прибор «висячая капля». В таком приборе , их размеров, форм производится с точностью до микрона. Исследователь же может легко определить клетки, переместить их в пробирку, где имеется уже стерильная питательная жидкость. В ней получается чистый .
· Колонии гладкие, блестящие, правильной выпуклой формы;
· При росте в бульоне -- равномерная муть;
· У подвижных бактерий имеются жгутики;
· У капсульных бактерий имеется капсула;
· Биохимически активны;
· Болезнетворны;
· Выделяются чаще в остром периоде заболевания.
· Колонии неправильной формы, мутные, шероховатые;
· Растут в бульоне в виде осадка;
· У подвижных бактерий жгутики могут отсутствовать;
· Капсулы отсутствуют;
· Биохимические свойства выражены слабо;
· Большинство бактерий менее болезнетворны;
· Выделяются обычно при хронической форме заболевания.
Болезнетворные бактерии чаще бывают в S-форме. Исключением являются возбудители туберкулеза, чумы, сибирской язвы, у которых болезнетворной является R-форма.
Изменения, возникающие в бактериальных клетках, могут быть ненаследуемые -- фенотипическая изменчивость и наследуемые -- генотипическая изменчивость.
> Фенотипическая изменчивость (модификация)
Модификация микроорганизмов возникает как ответ клетки на неблагоприятные условия ее существования. Это адаптивная реакция на внешние раздражители. Модификация не сопровождается изменением генотипа, в связи с чем возникшие в клетке изменения по наследству не передаются. При восстановлении оптимальных условий возникшие изменения утрачиваются. Модификация может касаться разных свойств микроорганизмов -- морфологических, культуральных, биохимических и др.
Морфологическая модификация выражается в изменениях формы и величины бактерий. Например, при добавлении пенициллина к питательной среде клетки некоторых бактерий удлиняются. Недостаток в среде солей кальция вызывает у палочки сибирской язвы повышенное спорообразование. При повышенной концентрации солей кальция способность образовывать споры утрачивается и т. д. При длительном росте бактерий в одной и той же среде возникает полиморфизм, обусловленный влиянием накопившихся в ней продуктов их жизнедеятельности.
Культуральная модификация состоит в изменении культуральных свойств бактерий при изменении состава питательной среды. Например, при недостатке кислорода у стафилококка утрачивается способность образовывать пигмент. Чудесная палочка при комнатной температуре образует ярко-красный пигмент, но при 37 °С способность образовывать этот пигмент утрачивается и т.д.
Биохимическая (ферментативная) модификация. Каждый вид бактерий имеет определенный набор ферментов, благодаря которым они усваивают питательные вещества. Эти ферменты вырабатываются на определенных питательных субстратах и предопределены генотипом.
В процессе жизнедеятельности бактерий обычно функционируют не все гены, ответственные за синтез соответствующих ферментов. В геноме бактерий всегда имеются запасные возможности, т.е. гены, определяющие выработку адаптивных ферментов. Например, кишечная палочка, растущая на среде, не содержащей углевод лактозу, не вырабатывает фермент лактазу, но если пересеять ее на среду с лактозой, то она начинает вырабатывать этот фермент. Адаптивные ферменты позволяют приспособляться к определенным условиям существования.
Таким образом, модификация -- это способ приспособления микроорганизма к условиям внешней среды, обеспечивающий им возможность расти и размножаться в измененных условиях. Приобретенные свойства не передаются по наследству, поэтому они не играют роли в эволюции, а способствуют в основном выживанию микробных популяций.