Skladnost z aseptičnimi ukrepi je uporaba sterilnih pripomočkov in raztopin ter preprečevanje njihove kontaminacije med delom. Bakterije in spore gliv so zelo razširjene v okolju, tudi v laboratorijih. Mikrobiologi morajo nenehno skrbeti za sterilnost gojišča in opreme. Te »nevšečnosti« so sestavni del dela vsakega mikrobiologa. Šolski in univerzitetni laboratoriji učijo le osnovnih previdnostnih ukrepov. Rutinsko mikrobiološko delo zahteva posebej opremljene laboratorije. Imeti morajo površine, ki jih je enostavno čistiti, in posebej ograjene delovne prostore (bokse), kjer se dovaja filtriran sterilni zrak.
Polnjenje skodelic
Polnjenje skodelic ena najosnovnejših mikrobioloških metod. Posoda je petrijevka, ki vsebuje hranilni agar. Petrijevke so posebej izdelane plitve okrogle posode, ki so lahko steklene ali plastične. Uporabljajo se za rast bakterij, gliv ali tkivne kulture na trdnih gojiščih. Petrijevke so običajno premera približno 9 cm. Steklene skodelice lahko po avtoklaviranju ponovno uporabite. Plastične kozarce po uporabi zavržemo; običajno jih avtoklavirajo, da uničijo kulturo. Hkrati se topijo. Skodelice so kupljene v zaprti embalaži, ki je sterilizirana z gama obsevanjem. Pokrovi preprečujejo kontaminacijo skodelice, vendar lahko molekule plina difundirajo med notranjo prostornino skodelice in okoljem skozi mikroskopske nepravilnosti na stičnih točkah med dnom in pokrovom. Zato ima kisik dostop do kulture, ogljikov dioksid pa se odstrani navzven.
Postopek zalivanja staljeni hranilni agar ("polnjenje posode") je prikazan na sliki. Razume se, da je bil agar pripravljen v majhnih vialah (McCartney viale).
Metode cepljenja
Pri vnosu majhnega števila mikroorganizmov v gojišče - inokulacija (ali setev) - je treba uporabiti aseptične metode, da se izognemo kontaminaciji.
Postopki inokulacije se razlikujejo glede na vrsto gojišča (tekoče ali trdno).
Setev na trdnem mediju
Setev s potegom ali setev z redčenjem
Metoda je prikazana na sliki. Uporablja se za izolacijo čistih bakterijskih kolonij iz mešanice bakterij. Za setev se uporablja žična zanka, ki jo je treba najprej prižgati, kot je prikazano na sl. 12,4 L za sterilizacijo. Nato se iz vnaprej gojene kulture ali drugega vira mikroorganizma z zanko odvzame tanek film tekoče suspenzije ali majhna količina trdnega materiala, ki vsebuje preiskovani mikroorganizem. Zanko nežno popeljemo po površini medija in tako naredimo vrsto potez. Po vsaki seriji potegov skodelico nekoliko zavrtimo, da se bakterije iz prejšnje serije potegov porazdelijo v vsako novo serijo in tako izčrpajo potege na posamezne bakterije. (Ne pričakujte, da boste videli kaj na zadnjih potezah, preden se izteče čas inkubacije!) Ko metodo vadite, lahko poteze izvedete zelo hitro.
S to metodo lahko bakterije izoliramo iz naravnih habitatov, kot so zemlja, mleko, voda. Vzorce trdnih snovi, kot je prst, je najbolje suspendirati v majhni količini vode ali predhodno inkubirati v tekočem mediju. Varen vir za rutinsko delo je pasterizirano mleko. Pred poskusom z bakterijami ali glivami preberite navodila in varnostna pravila, da zmanjšate tveganje gojenja škodljivcev.
Sejanje na površino agarja
Ta metoda je prikazana na sliki. Primeren je za inokulacijo mikroorganizmov iz tekoče suspenzije na trdno gojišče. Metoda se uporablja za določanje števila živih celic v vzorcu po serijskih razredčitvah. Lahko se uporablja tudi za pridobivanje neprekinjenega "travnika" mikroorganizmov na površini agarja po debeli inokulaciji. To je uporabno pri analizi aktivnosti inhibitorjev, kot so antibiotiki ali razkužila, ki se dodajo v vdolbinice v agarju ali nanesejo na kolute filtrirnega papirja, nameščene na površini agarja. Inhibitor difundira skozi agar in tvori cono zaviranja rasti okoli lukenj ali kolutov filtrirnega papirja, ki je vidna po inkubaciji. Premer cone lahko služi kot merilo stopnje inhibicije.
Setev s polivanjem
Setev s polivanjem za inokulacijo celic iz tekoče kulture in za štetje celic, sposobnih za življenje, se uporablja alternativna metoda namesto metode nanosa na površino agarja. Ker so celice porazdeljene po celotnem mediju in ne le na površini agarja, jih je mogoče prešteti veliko več – do 1000 kolonij na ploščo. Vendar pa je velikost zraslih kolonij veliko manjša.
Določen volumen(do 0,5 cm 3) celične suspenzije vnesemo v primeren volumen (približno 15-20 cm 3) steriliziranega hranilnega agarja, stopljenega v majhni viali, ki smo jo predhodno ohladili na 45-50 ° C v vodni kopeli. Odstranite pokrovček in zažgite vrat viale, preden dodate celično suspenzijo, kot je prikazano na sliki. Suspenzijo celic temeljito premešamo s hranilnim agarjem tako, da vialo, ki jo držimo v dlaneh, obračamo (ne stresamo) naprej in nazaj. Nato zmes vlijemo v sterilno petrijevko, kot je prikazano na sliki. Podpišite dno posode in ga inkubirate. Po inkubaciji je posoda videti kot na sliki.
Setev z injekcijo
Metoda uporabljajo za gojenje anaerobnih organizmov ali organizmov, ki rastejo pri nizkih koncentracijah kisika (mikroaerofili). Običajno se uporablja epruveta s hranilnim agarnim medijem. Zaradi majhne površine in precej velike globine agarja v epruveti v primerjavi s posodo je dostop kisika v notranjost agarja omejen. Sejanje poteka z ravno žico (brez zanke) ali z bakteriološko iglo. Majhno količino kulture (trdne ali tekoče) vzamemo s konico igle in nato z njo navpično preluknjamo agar. Kultura raste v agarju v vse smeri od vbodne linije.