Immunoblotting (immunoblot) to wysoce specyficzna i bardzo czuła metoda referencyjna, która potwierdza diagnozę u pacjentów z dodatnimi lub niejednoznacznymi wynikami badań uzyskanymi m.in. przy użyciu testu RIGA lub ELISA. Immunoblotting jest rodzajem heterogenicznego testu immunologicznego.

Ta metoda wykrywania przeciwciał na poszczególne antygeny patogenów opiera się na teście ELISA na membranach nitrocelulozowych, na które nanoszone są specyficzne białka w postaci oddzielnych prążków, rozdzielonych metodą elektroforezy żelowej. Jeśli występują przeciwciała przeciwko określonym antygenom, w odpowiednim miejscu paska pojawia się ciemna linia. Wyjątkowość immunoblotu polega na jego wysokiej zawartości informacyjnej i wiarygodności uzyskanych wyników.

Materiałem do badań jest ludzka surowica lub osocze. Do badania na jednym pasku potrzebne jest 1,5-2 ml krwi lub 15-25 µl surowicy.

LLC „Diagnostyka laboratoryjna” wykorzystuje zestawy do immunoblottingu do wykrywania przeciwciał przeciwko patogenom różnych chorób firmy „EUROIMMUN” (Niemcy), „MIKROGEN” (Niemcy):

HSV 1 i HSV 2 IgM/IgG(zakażenie herpeswirusem)

CMV IgM/IgG(infekcja wirusem cytomegalii)

Różyczka IgG

Profil TORCH IgM(toksoplazmoza, różyczka, wirus cytomegalii, HSV 1 i HSV 2)

EBV IgMTIgG(zakażenie wirusem Epsteina-Barra)

HCV IgG(wirusowe zapalenie wątroby typu C)

Istnieją dwa rodzaje zestawów - Western blot i line blot.

Western blot: Zestawy zawierają testowe paski membranowe z elektroforetycznie rozdzielonymi natywnymi antygenami odpowiednich czynników zakaźnych, tj. antygeny są uporządkowane według masy cząsteczkowej. Na membrany można również nanieść 1-2 dodatkowe linie z klinicznie istotnymi antygenami (western line blot). Jest to niezawodna metoda potwierdzająca, eliminująca fałszywe alarmy i reakcje krzyżowe.

plama liniowa: W takim przypadku na paski testowe nakłada się w określonej kolejności tylko klinicznie istotne antygeny (natywne, syntetyczne lub rekombinowane). To podejście jest stosowane w diagnostyce różnicowej kilku infekcji na jednym pasku.

Jej istota polega na przeniesieniu cząsteczek badanej substancji z jednego stałego nośnika stosowanego do frakcjonowania biopolimerów na inny, gdzie są one specyficznie wykrywane za pomocą reakcji immunochemicznej. Nowoczesną, wysoce czułą metodą jest identyfikacja białek, w tym antygenów wirusowych. Metoda opiera się na połączeniu elektroforezy żelowej i reakcji antygen-przeciwciało. Wysoki stopień rozdzielczości uzyskuje się dzięki elektroforetycznemu rozdziałowi białek, gliko- i lipoprotein oraz maksymalnej specyficzności wykrywania surowic odpornościowych lub przeciwciał monoklonalnych. W optymalnych warunkach immunoblotting może wykryć antygen w ilościach mniejszych niż 1 ng w objętości testowej. Technicznie rzecz biorąc, immunoblotting przeprowadza się w trzech etapach:

1) analizowane białka poddaje się rozdziałowi w żelu poliakryloamidowym w obecności substancji denaturujących: dodecylosiarczanu sodu lub mocznika, proces ten często określa się mianem SDS-PAGE; rozdzielone białka można uwidocznić po barwieniu i porównać z próbkami referencyjnymi;

2) oddzielone białka są przenoszone z żelu przez nakładanie (blotting).
filtr nitrocelulozowy i zamocowany na nim; w wielu przypadkach, ale
nie zawsze podczas przenoszenia zachowane są proporcje ilościowe białek;

3) filtry są pokryte warstwą wykrywającą poli- lub monoklonalną
przeciwciała zawierające znacznik radioizotopowy lub enzymatyczny; Dla
wykrywanie związanych przeciwciał, stosowana jest również analiza antygatunkowa
znakowana surowica, innymi słowy, na końcowym etapie, blotting
podobne do testów immunologicznych w fazie stałej.

Należy pamiętać, że w tym ustawieniu immunoblottingu białka są w stanie zdenaturowanym i dlatego mogą nie być rozpoznawane przez przeciwciała specyficzne dla białka natywnego, ale w obecności surowic dla wszystkich składowych peptydów cała antygenowa jednocześnie wykrywane jest widmo badanego białka. Immunoblotting jest szeroko stosowany w badaniach struktury wirusów zapalenia wątroby, w szczególności w celu ustalenia związku antygenowego między poszczególnymi szczepami. Wysoka rozdzielczość immunoblottingu pozwala na uzyskanie dobrych wyników w praktyce diagnostycznej, gdy wymagana jest identyfikacja wirusa w tkankach lub wydalinach pacjenta.

W zależności od badanej substancji wyróżnia się DNA, RNA i białko - blotting.

Immunochemiczne wykrywanie antygenów można przeprowadzić przy użyciu przeciwciał skoniugowanych ze znacznikiem. Ostatnio jako znaczniki szeroko stosowano izotopy promieniotwórcze lub enzymy (peroksydaza, fosfataza alkaliczna, laktamaza itp.).

Czas blottingu dyfuzyjnego wynosi 36-48 godzin, ale najszybszym i najskuteczniejszym sposobem przenoszenia białek z żeli jest elektroblotting, który zwykle trwa 1-3 godziny, w przypadku niektórych białek o dużej masie cząsteczkowej ponad 12 godzin.

Konkretny dobór sorbentów do różnych modyfikacji blotów (nitroceluloza lub odpowiednio potraktowany papier), dobór warunków blokowania i immunochemicznej detekcji antygenów całkowicie zależy od antygenu, jego ilości, metody oznaczenia immunologicznego oraz celów badania.

Możliwość wykrycia przeciwciał przeciwko specyficznym antygenom patogenów pozwala na ocenę istotności tych przeciwciał (swoistości dla danego czynnika etiologicznego), w celu wykluczenia reakcji na antygeny krzyżowe. Tym różni się immunoblotting od testu ELISA, w którym jako antygen można zastosować różne kombinacje determinant antygenowych – zarówno swoiste, jak i nie, dające reakcje krzyżowe z innymi patogenami. W innym przypadku, gdy uzyska się pozytywny wynik testu ELISA, można jedynie założyć, że jest to wynik reakcji krzyżowej, aw przypadku immunoblottingu jest to rozstrzygające.

Metoda IB z wielu powodów stała się najpowszechniej stosowaną metodą nadającą się do stosowania jako test potwierdzający.

Niewątpliwą zaletą metody jest możliwość badania przeciwciał słabo lub całkowicie nierozpuszczalnych antygenów oraz wykluczenie etapu wprowadzania radioaktywnego znacznika do antygenów.

Czułość w przypadku IB ocenia się na podstawie granicznej ilości antygenu zdeponowanego na żelu, który podczas frakcjonowania białek można wykryć immunochemicznie po przeniesieniu z żelu do fazy stałej (nitroceluloza). Ogólna czułość testu zależy od wielu czynników: warunków frakcjonowania i immobilizacji antygenu na stałym nośniku, poziomu tła, specyficzności i powinowactwa przeciwciał. Ważny jest rodzaj użytej etykiety i sposób jej wykrycia.

Zatem metoda immunoblottingu umożliwia identyfikację stref antygenu na fazie stałej bez wiązania całego białka ze specyficznymi przeciwciałami surowicy. Immunoblotting i jego modyfikacje stosuje się głównie do typowania antygenów i przeciwciał bakteryjnych i wirusowych, zwłaszcza w przypadku niewystarczającej rozdzielczości konwencjonalnych układów, a także w analizie immunoglobulin, kwasów nukleinowych lub jako test potwierdzający w połączeniu z innymi metodami.

Duże trudności w interpretacji wyników reakcji krzyżowych oraz w przypadku początkowych stadiów serokonwersji. W pierwszej sytuacji, przy ponownym badaniu po pewnym czasie, przeciwciała nie są wykrywane, aw drugim immunoblocie pojawiają się nowe prążki, wskazujące na pojawienie się przeciwciał przeciwko białkom lub glikoproteinom HIV, charakteryzujące dynamikę odpowiedzi odpowiedzi immunologicznej na antygeny wirusa.

Jest to właściwie ostateczna metoda weryfikacji w łańcuchu testów serologicznych, pozwalająca na wyciągnięcie ostatecznego wniosku o HIV pozytywności pacjenta lub jego odrzucenie. Do ustawienia IB stosuje się paski nitrocelulozowe, na które wcześniej przenosi się białka HIV metodą immunoforezy poziomej, a następnie pionowej w kolejności zwiększania ich mas cząsteczkowych. Przeciwciała badanych surowic oddziałują z białkami w określonych obszarach paska. Dalszy przebieg reakcji nie różni się od ELISA, to jest polega na potraktowaniu paska (paska) koniugatem i chromogenem-substratem, wypłukaniu niezwiązanych składników i zatrzymaniu reakcji wodą destylowaną. Wstępne elektroforetyczne rozdzielenie białek i ich utrwalenie na nitrocelulozie umożliwia identyfikację przeciwciał przeciwko określonym białkom na podstawie obecności (lub braku) wybarwienia (szaro-niebieskiego) odpowiednich stref paska. Immunoblotting nie może być stosowany do masowego badania przesiewowego ze względu na jego wysoki koszt i jest metodą indywidualnego arbitrażu na końcowym etapie badania serologicznego.

Istnieje dość wyraźna korelacja między wynikami badań surowic w IB i ELISA. Dwukrotnie pozytywne w teście ELISA (w różnych systemach testowych) surowice są następnie interpretowane w IB jako HIV-dodatnie w 97-98% przypadków. Surowice dodatnie w teście ELISA tylko w jednym z dwóch zastosowanych systemów testowych okazują się HIV-dodatnie w IB nie częściej niż w 4% przypadków. Podczas przeprowadzania badań potwierdzających około 5% IB może dawać tak zwane „nieokreślone” wyniki, które z reguły odpowiadają pozytywnemu testowi ELISA, ale nie RIP. W około 20% przypadków „nieokreślone” IB są spowodowane przez przeciwciała przeciwko białkom gag HIV-1 (p55, p25, p18). W przypadku uzyskania wątpliwych wyników immunoblottingu konieczne jest powtórzenie badania po 3 miesiącach, aw przypadku utrzymywania się niepewności wyniku po 6 miesiącach.

Metoda radioimmunologiczna (RIM) (analiza radioimmunologiczna, RIA) Test radioimmunologiczny jest metodą ilościowego oznaczania substancji biologicznie czynnych (hormonów, enzymów, leków itp.) w płynach biologicznych, polegającą na konkurencyjnym wiązaniu pożądanych trwałych i podobnych substancji znakowanych radionuklidem o specyficznym układzie wiążącym. Te ostatnie to najczęściej specyficzne przeciwciała. Dzięki temu, że znakowany antygen jest dodawany w określonej ilości, możliwe jest określenie części substancji, która związała się z przeciwciałami, a część, która pozostaje niezwiązana w wyniku współzawodnictwa z wykrywanym antygenem nieznakowanym. Badanie przeprowadza się in vitro. dla R. i. produkować standardowe zestawy odczynników, z których każdy jest przeznaczony do oznaczania stężenia dowolnej jednej substancji. Badanie przeprowadza się w kilku etapach: materiał biologiczny miesza się z odczynnikami, mieszaninę inkubuje się przez kilka godzin, oddziela się wolną i związaną substancję radioaktywną, przeprowadza się radiometrię próbek i oblicza wyniki. Metoda jest wysoce czuła, może być stosowana w diagnostyce chorób układu sercowo-naczyniowego, hormonalnego i innych, do ustalania przyczyn niepłodności, zaburzeń rozwoju płodu, w onkologii do oznaczania markerów nowotworowych i monitorowania skuteczności leczenia, do określania stężenie immunoglobulin, enzymów i substancji leczniczych. W niektórych przypadkach badania przeprowadza się na tle funkcjonalnych testów obciążenia (na przykład oznaczanie zawartości insuliny w surowicy krwi na tle testu tolerancji glukozy) lub dynamiki (na przykład oznaczanie hormonów płciowych we krwi podczas cykl menstruacyjny).

Za pomocą zestawu handlowego firmy ABBOTT - Austria II-I 125 możliwe jest wykrycie HBsAg w stężeniach do 0,1 ng/ml. Do zalet metody należy zaliczyć możliwość standaryzacji i automatyzacji metody z uzyskiwaniem odpowiedzi w ujęciu liczbowym. Wadą metody są ograniczenia wynikające ze sposobu pracy z materiałem promieniotwórczym oraz stosunkowo krótki okres trwałości zestawu diagnostycznego, co wiąże się z rozpadem znacznika radioaktywnego.

Zestawy diagnostyczne do wykrywania różnych antygenów wirusów zapalenia wątroby typu A, B i D oraz przeciwciał przeciwko nim są produkowane przez Isotope (Tashkent) i niektóre firmy zagraniczne (na przykład ABBOTT). Jako fazę stałą stosuje się kulki polistyrenowe (ABBOTT) lub probówki (Isotope). Najczęściej stosowanym izotopem do znakowania przeciwciał lub antygenów jest I 125, którego okres półtrwania wynosi 60 dni i wysoka specyficzna radioaktywność. Pomiar znacznika radioaktywnego, czyli promieniowania, odbywa się na specjalnych licznikach – spektrometrach radiowych. Zliczanie impulsów radioaktywnych zarówno w próbce kontrolnej, jak iw próbce testowej odbywa się w jednym ustalonym czasie, zwykle w ciągu 1 minuty. Analizując wyniki reakcji należy wziąć pod uwagę obecność tła promieniotwórczego, które może mieć wpływ na końcowy wynik reakcji. Przyczynami zwiększonego tła mogą być: zanieczyszczenie pojemnika na próbki lub gniazda; nieprawidłowe ustawienie urządzenia; obecność źródła silnego promieniowania w pobliżu urządzenia.

W celu potwierdzenia pozytywnego wyniku wstępnego badania przesiewowego próbek zaleca się powtórzenie RIA lub alternatywnego testu. W przypadku wykrycia HBsAg należy wykonać test potwierdzający.

Tabela 1. Klasyfikacja szczepionek

Bibliografia:

Obowiązkowy:

1. Khaitov R.M., Ignatieva GA, Sidorovich I.G. Immunology: Textbook.-M.: Medicine, 2000.- 432 s.: Ill. (Literatura dla studentów medycyny).

2. Kowalczuk L.V. i inni Immunologia: warsztaty: podręcznik. zasiłek - M.: GEOTAR-Media, 2012. - 176 s.

3. Pozdeev O.K. Mikrobiologia medyczna / wyd. akademik RAMY VI Pokrovsky - M.: GEOTAR-Media, 2001. - 768 s.

4. Borysow L.B. Przewodnik po praktycznych ćwiczeniach z mikrobiologii. M. 1997

Dodatkowy:

1. Genkel P.A., Mikrobiologia z podstawami wirusologii. M., 1974

2. Korotyaev A.I., Babichev SA. Mikrobiologia medyczna, immunologia i wirusologia: podręcznik do miodu. uniwersytety - 3. wydanie, poprawione. i dodatkowe - Sankt Petersburg, SpetsLit. 2002. - 591 s.

3. Borisov L.B., Smirnova A.M., Mikrobiologia medyczna, wirusologia, immunologia, M., Medycyna. 1994

4. Timakov VD, Levashov VS, Borisov L.B. Mikrobiologia. M.1983

Immunoblotting (immunoblot, Western Blot, Western blot)- łączy test immunoenzymatyczny (ELISA) ze wstępnym elektroforetycznym przeniesieniem antygenów wirusa na pasek (pasek) nitrocelulozowy.

W tej pięknej naukowej nazwie „plamka” najprawdopodobniej tłumaczy się jako „plamka”, a „zachodnia” jako „zachodnia” odzwierciedla kierunek rozmieszczenia tej „plamki” na papierze od lewej do prawej, czyli na mapie geograficznej, odpowiada to kierunkowi z zachodu na wschód”. Istotą metody „immune blot” jest to, że reakcję immunoenzymatyczną przeprowadza się nie z mieszaniną antygenów, ale z antygenami HIV, uprzednio rozdzielonymi przez immunoforezę na frakcje zlokalizowane zgodnie z masą cząsteczkową na powierzchni błony nitrocelulozowej. W rezultacie główne białka wirusa HIV, nośniki determinant antygenowych, rozkładają się na powierzchni w postaci oddzielnych prążków, które pojawiają się podczas testu immunoenzymatycznego.

Immunoblot obejmuje kilka etapów:

Przygotowanie paska. Wirus niedoboru odporności (HIV), który został wcześniej oczyszczony i zniszczony do składników składowych, jest poddawany elektroforezie, podczas gdy antygeny tworzące HIV są rozdzielane według masy cząsteczkowej. Następnie, poprzez bibułę (analogicznie do wyciskania nadmiaru tuszu na „blotterze”), antygeny są przenoszone na pasek nitrocelulozy, który zawiera teraz widmo niewidocznych dla oka prążków antygenowych charakterystycznych dla wirusa HIV.

Przykładowe badanie. Materiał testowy (surowica, osocze krwi pacjenta itp.) jest nakładany na pasek nitrocelulozowy i jeśli w próbce znajdują się specyficzne przeciwciała, wiążą się one z ściśle odpowiadającymi im (komplementarnymi) prążkami antygenowymi. W wyniku kolejnych manipulacji wynik tej interakcji zostaje zwizualizowany – uwidoczniony.

Interpretacja wyniku. Obecność prążków w niektórych obszarach płytki nitrocelulozowej potwierdza obecność w badanej surowicy przeciwciał przeciwko ściśle określonym antygenom HIV.

Ścieżka A — kontrola pozytywna

Ścieżka B — Słaba kontrola pozytywna

Ścieżka C — kontrola ujemna

Pasek D - Próbka pozytywna (wykryto przeciwciała przeciwko HIV-1)

Obecnie główną metodą potwierdzania obecności przeciwciał swoistych dla wirusa w badanej surowicy jest immunoblot (immunoblot). W niektórych przypadkach zakażenia wirusem HIV, przed serokonwersją, specyficzne przeciwciała są skuteczniej wykrywane metodą immunoblottingu niż metodą ELISA. Badanie blottingu immunologicznego wykazało, że przeciwciała przeciwko gp 41 są najczęściej wykrywane w surowicach pacjentów z AIDS, a wykrycie p24 u osób badanych w celach profilaktycznych wymaga dodatkowych badań na obecność zakażenia wirusem HIV. Systemy testowe Immunoblot oparte na rekombinowanych białkach uzyskanych metodą inżynierii genetycznej okazały się bardziej specyficzne niż konwencjonalne systemy oparte na oczyszczonym lizacie wirusa. Podczas stosowania rekombinowanego antygenu powstaje nie rozproszony, ale wyraźnie określony wąski prążek antygenu, który jest łatwo dostępny do rozliczenia i oceny.

W surowicy osób zakażonych wirusem HIV-1 wykrywa się przeciwciała przeciwko następującym głównym białkom i glikoproteinom - strukturalnym białkom otoczki (env) - gp160, gp120, gp41; jądra (gag) - p17, p24, p55, a także enzymy wirusa (pol) - p31, p51, p66. W przypadku HIV-2 typowe są przeciwciała przeciwko env - gp140, gp105, gp36; knebel - s. 16, s. 25, s. 56; pol-p68.

Wśród metod laboratoryjnych niezbędnych do ustalenia swoistości reakcji największe uznanie cieszy się wykrywanie przeciwciał przeciwko białkom otoczki HIV-1 - gp41, gp120, gp160 i HIV-2 - gp36, gp105, gp140.

WHO uważa surowice za dodatnie, jeśli przeciwciała przeciwko dwóm glikoproteinom HIV zostaną wykryte metodą immunoblottingu. Zgodnie z tymi zaleceniami, w przypadku wystąpienia reakcji tylko z jednym z białek otoczki (rp 160, rp 120, rp 41) w połączeniu lub bez reakcji z innymi białkami, wynik uważa się za wątpliwy i zaleca się wykonanie drugiego testu z użyciem zestawu z innej serii lub innej firmy. Jeśli po tym czasie wynik pozostaje wątpliwy, zalecana jest obserwacja przez 6 miesięcy (badania po 3 miesiącach).

Obecność pozytywnej reakcji z antygenem p24 może świadczyć o okresie serokonwersji, ponieważ przeciwciała przeciwko temu białku pojawiają się czasami jako pierwsze. W takim przypadku zaleca się, w zależności od danych klinicznych i epidemiologicznych, powtórzenie badania z próbką surowicy pobraną co najmniej 2 tygodnie później, a dokładnie tak jest w przypadku, gdy w zakażeniu HIV wymagane są pary surowic.

Dodatnie reakcje z białkami gag i pol bez obecności reakcji z białkami env mogą odzwierciedlać stadium wczesnej serokonwersji, a także mogą wskazywać na zakażenie HIV-2 lub reakcję niespecyficzną. Osoby z takimi wynikami po badaniu w kierunku HIV-2 są ponownie badane po 3 miesiącach (w ciągu 6 miesięcy).

Opis

Metoda wyznaczania immunoblot.

Materiał w trakcie studiowania Serum

Możliwość wizyty domowej

Przeciwciała przeciwjądrowe to rodzina autoprzeciwciał, które wiążą się z kwasami rybonukleinowymi i związanymi z nimi białkami. Występują u ponad 90% pacjentów z rozlanymi chorobami tkanki łącznej, często obserwuje się je również w autoimmunologicznych chorobach wątroby i wielu innych stanach. Do tej pory scharakteryzowano około 200 odmian tej rodziny autoprzeciwciał, jednak nie wszystkie z nich mogą być stosowane w praktyce klinicznej.

Immunoblot przeciwciał przeciwjądrowych umożliwia jednoczesne badanie 15 głównych typów przeciwciał przeciwjądrowych w jednym teście, co zapewnia diagnostykę różnicową głównych ogólnoustrojowych chorób reumatycznych. Każdy typ autoprzeciwciał wykryty metodą immunoblot jest zwykle obserwowany u pacjentów z charakterystycznym obrazem klinicznym, dlatego spektrum autoprzeciwciał pozwala nie tylko zdiagnozować chorobę, ale także ustalić ryzyko wystąpienia określonych objawów klinicznych.

Immunoblot przeciwciał przeciwjądrowych jest wskazany do stosowania w drugim etapie badania serologicznego z pozytywnym wynikiem innych testów wskazujących na obecność przeciwciał przeciwjądrowych w surowicy badanego. Testy te obejmują oznaczanie przeciwciał przeciwjądrowych (badanie przesiewowe ELISA), wykrywanie czynnika przeciwjądrowego (ANF) na komórkach Hep2 (), przeciwciał przeciwjądrowych i przeciwciał przeciwko ekstrakcyjnemu antygenowi jądrowemu (ENA,).

Metoda immunoblot przeciwciał przeciwjądrowych w diagnostyce ogólnoustrojowych chorób reumatycznych charakteryzuje się wysoką specyficznością kliniczną. Ale specyficzność przeciwciał przeciwjądrowych, nawet przy wysokich mianach ANF (), nie zawsze jest możliwa do ustalenia, ponieważ wiele antygenów przeciwciał przeciwjądrowych nadal pozostaje niescharakteryzowanych. Ujemny wynik testu immunoblot w tym przypadku nie wyklucza rozpoznania ogólnoustrojowych chorób reumatycznych. Wiele przeciwciał przeciwjądrowych można wykryć za pomocą immunoblotu - panelu autoprzeciwciał specyficznych dla zapalenia mięśni () i immunoblotu - panelu autoprzeciwciał w twardzinie skóry ().

Literatura

1. Łapin SV Totolyan AA Immunologiczna diagnostyka laboratoryjna chorób autoimmunologicznych / Wydawnictwo „Chelovek”, St. Petersburg – 2010. 272 ​​​​s.
2. Nasonov E.L., Aleksandrova E.N. Nowoczesne standardy diagnostyki laboratoryjnej chorób reumatycznych. Wytyczne kliniczne / BHM, M - 2006.
3. Conrad K, Schlosler W., Hiepe F., Fitzler M.J. Autoprzeciwciała w chorobach autoimmunologicznych specyficznych dla narządów: odniesienie diagnostyczne/ PABST, Drezno - 2011. 300 s.
4. Conrad K, Schlosler W., Hiepe F., Fitzler M.J. Autoprzeciwciała w ogólnoustrojowych chorobach autoimmunologicznych: odniesienie diagnostyczne/ PABST, Drezno - 2007. 300 str.
5. Gershvin ME, Meroni PL, Shoenfeld Y. Autoprzeciwciała 2nd ed./ Elsevier Science - 2006. 862 s.
6. Shoenfeld Y., Cervera R, Gershvin ME Kryteria diagnostyczne w chorobach autoimmunologicznych / Humana Press - 2008. 598 s.
7. Instrukcja zestawu odczynników.

Przygotowanie

Lepiej wytrzymać 4 godziny po ostatnim posiłku, nie ma obowiązkowych wymagań.

Wskazania do wizyty

Badanie jest wskazane w diagnostyce i diagnostyce różnicowej następujących schorzeń:

• toczeń rumieniowaty układowy;
• podostry skórny toczeń i inne typy skórnego tocznia;
• mieszana choroba tkanki łącznej;
• zespół Sjögrena i choroby towarzyszące;
• twardzina rozlana i zlokalizowana, zespół CREST;
• miopatie zapalne (zapalenie wielomięśniowe i zapalenie skórno-mięśniowe);
• młodzieńcze przewlekłe zapalenie stawów;
• autoimmunologiczne zapalenie wątroby;
• pierwotna marskość żółciowa wątroby i stwardniające zapalenie dróg żółciowych;
• stosowanie tego testu jest wskazane do wykrywania wysokiego miana czynnika przeciwjądrowego, przeciwciał przeciwjądrowych, przeciwciał do ekstrahowalnego antygenu jądrowego, przeciwciał do DNA, przeciwciał do nukleosomów i przeciwciał antyfosfolipidowych.

Interpretacja wyników

Interpretacja wyników badań zawiera informacje dla lekarza prowadzącego i nie stanowi diagnozy. Informacje zawarte w tej części nie powinny być wykorzystywane do autodiagnozy lub samoleczenia. Dokładną diagnozę stawia lekarz, korzystając zarówno z wyników tego badania, jak i niezbędnych informacji z innych źródeł: wywiadu, wyników innych badań itp.

Jednostki miary: test jakościowy, wynik prezentowany jest w formie „wykryto” lub „nie znaleziono”.

W przypadku wykrycia prążka charakteryzującego obecność dowolnego typu przeciwciał, intensywność barwy prążka jest dodatkowo opisana liczbą plusów („krzyżyków”) dla każdego ze zidentyfikowanych typów przeciwciał. Wzrost stopnia pozytywności pośrednio odzwierciedla zawartość i powinowactwo autoprzeciwciał.

Wartości referencyjne: przeciwciała przeciwko Sm, RNP/Sm, SS-A (60 kDa), SS-A (52 kDa), SS-B, Scl-70, PM-Scl, PCNA, CENP-B, dsDNA, Histon, Nukleosom , Żebra P, AMA-M2, Jo-1 nie znaleziono.

Wynik oznaczania autoprzeciwciał przedstawiono w postaci „krzyżyków” dla każdego odpowiedniego antygenu. Wzrost stopnia seropozytywności pośrednio odzwierciedla zawartość i powinowactwo autoprzeciwciał. Opcje oceny seropozytywności są wymienione poniżej:

1. Nie znaleziono przeciwciał.
2. +/- - wynik graniczny;
3. + - niska zawartość autoprzeciwciał na określony antygen;
4. ++ to średnia zawartość autoprzeciwciał przeciwko określonemu antygenowi;
5. +++ - wysoka zawartość autoprzeciwciał na określony antygen.

Główne choroby związane z wykrywaniem przeciwciał przeciwjądrowych:

Antygen	Oznaczający
Sm (Smith)	Specyficzny marker tocznia rumieniowatego układowego (zawarty w 10. kryterium SLE American College of Rheumatology, ACR)
SS-A (Ro52)	Odnotowuje się ją w różnych chorobach autoimmunologicznych, częściej w toczniu rumieniowatym układowym i jego postaciach skórnych, układowych chorobach reumatycznych, reumatoidalnym zapaleniu stawów, autoimmunologicznych chorobach wątroby itp.
SS-A (Ro60)	Toczeń rumieniowaty układowy, skórne formy tocznia rumieniowatego, nadwrażliwość na światło w toczniu rumieniowatym układowym, wysokie ryzyko tocznia rumieniowatego wrodzonego i choroby serca płodu. Główny wskaźnik serologiczny w zespole Sjögrena. Często występuje razem z przeciwciałami przeciwko antygenowi SS-A (Ro52).
SS-B	Zespół Sjögrena, toczeń rumieniowaty układowy.
PCNA	Toczeń rumieniowaty układowy, ryzyko toczniowego zapalenia nerek.
Rybosomy (Ribo P)	Toczeń rumieniowaty układowy, ryzyko uszkodzenia ośrodkowego układu nerwowego.
Nukleosomy	Toczeń rumieniowaty układowy, wysokie ryzyko toczniowego kłębuszkowego zapalenia nerek.
dwuniciowy DNA	Specyficzny marker tocznia rumieniowatego układowego (zaliczany do 10. kryterium SLE ACR), wysokie ryzyko toczniowego zapalenia nerek.
snRNP/Sm	Mieszana choroba tkanki łącznej, toczeń rumieniowaty układowy z niskim ryzykiem uszkodzenia nerek, twardzina skóry.
Histony	Toczeń rumieniowaty układowy, toczeń polekowy, twardzina skóry.
Scl-70	Twardzina układowa z rozlanymi zmianami skórnymi i narządami wewnętrznymi.
PM-Scl	Twardzina z zapaleniem wielomięśniowym.
CENP-B	Zespół CREST ze sklerodaktylią, teleangiektazjami, zwapnieniami podskórnymi, zespołem Raynauda, ​​zapaleniem przełyku.
Jo-1	Zapalenie wielomięśniowe w postaci zespołu antysyntetazy.
AMA-M2	Pierwotna marskość żółciowa wątroby, zespół Sjögrena.

W Rosji obecnie standardową procedurą laboratoryjnej diagnostyki zakażenia wirusem HIV jest wykrywanie przeciwciał przeciwko HIVza pomocą testu immunoenzymatycznego następnie potwierdzenie ich specyficzności w reakcji blotting immunologiczny.

Przeciwciała przeciwko HIV pojawiają się u 90-95% zakażonych w ciągu 3 miesięcy od zakażenia, u 5-9% - po 6 miesiącach od momentu zakażenia, au 0,5-1% - w późniejszym terminie. Najwcześniejszy czas na wykrycie przeciwciał to 2 tygodnie od momentu zakażenia.

Wykrywanie przeciwciał przeciwko HIV obejmuje 2 etapy. Na pierwszym etapie wykrywanie pełnego spektrum przeciwciał przeciwko antygenom HIV przeprowadza się za pomocą różnych testów: immunoenzymatycznego, aglutynacyjnego, kombinowanego, grzebieniowego, membranowo-filtrowego lub membranowo-dyfuzyjnego. Na drugim etapie immunoblotting służy do oznaczania przeciwciał przeciwko poszczególnym białkom wirusa. W pracy dozwolone jest stosowanie wyłącznie systemów testowych, które mają pozwolenie na użytkowanie wydane przez Ministerstwo Zdrowia Federacji Rosyjskiej. Procedury diagnostyczne należy przeprowadzać wyłącznie zgodnie z zatwierdzonymi instrukcjami stosowania odpowiednich testów.

Pobieranie próbek krwi pobiera się z żyły łokciowej do czystej, suchej probówki w ilości 3-5 ml. Krew pępowinową można pobrać od noworodków. Nie zaleca się przechowywania otrzymanego materiału (krew pełna) dłużej niż 12 godzin w temperaturze pokojowej i dłużej niż 1 dzień w lodówce w temperaturze 4-8°C. Nadchodząca hemoliza może wpłynąć na wyniki analizy. Surowicę oddziela się przez odwirowanie lub prześledzenie krwi wzdłuż ścianki probówki za pomocą pipety Pasteura lub szklanego pręta. Odseparowaną surowicę przenosi się do czystej (najlepiej sterylnej) probówki, fiolki lub plastikowego pojemnika iw tej postaci można ją przechowywać do 7 dni w temperaturze 4-8°C. Podczas pracy należy przestrzegać zasad bezpieczeństwa podanych w „Instrukcji dotyczącej reżimu przeciwepidemicznego w laboratoriach diagnostycznych AIDS” nr 42-28/38-90 z dnia 5 lipca 1990 r.

Oznaczanie całkowitych przeciwciał przeciwko HIV.

Po otrzymaniu pierwszego pozytywnego wyniku analizę przeprowadza się jeszcze 2 razy (z tą samą surowicą iw tym samym systemie testowym). W przypadku uzyskania co najmniej jednego wyniku pozytywnego (dwa pozytywne wyniki z trzech testów ELISA) surowica jest wysyłana do laboratorium referencyjnego.

W laboratorium referencyjnym surowice pierwotne dodatnie (tj. te, które dały dwa pozytywne wyniki w pierwszym systemie testowym) są ponownie badane w teście ELISA w drugim (innym) systemie testowym wybranym do potwierdzenia.

Po otrzymaniu pozytywnego wyniku analizy w drugim systemie testowym surowica musi zostać zbadana w IS.

W przypadku uzyskania wyniku ujemnego w drugim systemie testowym, surowica jest ponownie badana w trzecim systemie testowym.

W przypadku uzyskania negatywnego wyniku testu zarówno w drugim, jak i trzecim systemie testowym, wydawany jest wniosek o braku przeciwciał przeciwko HIV.

Po uzyskaniu pozytywnego wyniku w trzecim systemie testowym surowica jest również wysyłana do analizy w immunoblottingu.

blotting immunologiczny.

Zasada metody polega na wykrywaniu przeciwciał przeciwko niektórym białkom wirusa unieruchomionym na membranie nitrocelulozowej. Białka otoczki (env) HIV-1 są powszechnie określane jako glikoproteiny ("gp" lub "gp"), o masie cząsteczkowej wyrażonej w kilodaltonach (cd): 160 kd, 120 kd, 41 kd. W HIV-2 glikoproteiny mają masę 140 kd, 105 kd, 36 kd. Białka rdzeniowe (gag) (powszechnie określane jako białka - „p” lub „r”) w HIV-1 mają masę cząsteczkową odpowiednio 55 kd, 24 kd, 17 kd, a HIV-2 -56 kd, 26 kd , 18 tys. Enzymy HIV-1 (pol) mają masę cząsteczkową 66 kd, 51 kd, 31 kd, HIV-2-68 kd.

Wyniki immunoblottingu są interpretowane jako dodatnie, nieokreślone i ujemne.

pozytywny(pozytywne) uważa się za próbki, w których wykryto przeciwciała przeciwko 2 lub 3 glikoproteinom HIV.

negatywny(ujemne) to surowice, które nie wykrywają przeciwciał przeciwko żadnemu z antygenów (białek) wirusa HIV.

Uwzględnia się próbki, które wykrywają przeciwciała przeciwko jednej glikoproteinie HIV i/lub dowolnemu z białek HIV wątpliwy(nieokreślony lub niemożliwy do zinterpretowania).

Gdy uzyska się nieokreślony wynik z przeciwciałami przeciwko białkom rdzeniowym (gag) w immunoblot z antygenami HIV-1, przeprowadza się test z antygenami HIV-2.

Po otrzymaniu pozytywnych wyników immunoblottingu wyciąga się wniosek o obecności przeciwciał przeciwko HIV w badanym materiale.

Po otrzymaniu negatywnego wyniku testu IB wydaje wniosek, że nie ma przeciwciał przeciwko HIV.

Po otrzymaniu niejednoznacznego wyniku (jeśli nie wykryto antygenu p24) po 3 miesiącach przeprowadza się powtórne badania na obecność przeciwciał przeciwko HIV,

i przy zachowaniu nieokreślonych wyników po kolejnych 3 miesiącach. Jeśli wykryto antygen p24, drugie badanie przeprowadza się 2 tygodnie po otrzymaniu pierwszego nieokreślonego wyniku.

Jeśli po 6 miesiącach od pierwszego badania ponownie uzyska się wynik niejednoznaczny, a pacjent nie ma czynników ryzyka zakażenia i objawów klinicznych zakażenia wirusem HIV, wynik uważa się za fałszywie dodatni. (Jeśli istnieją wskazania epidemiologiczne i kliniczne, badania serologiczne powtarza się zgodnie z zaleceniami).

Blot immunologiczny przy użyciu rekombinowanych polipeptydów specyficznych dla wirusa „HIV blot” różni się tym, że nie wykorzystuje samych białek wirusowych, ale rekombinowane polipeptydy - analogi antygenów HIV („Env1”, „Gag1”, „Poll”, „Env2”). Rekombinowany polipeptyd Env1 wykrywa przeciwciała bezpośrednio przeciwko gp120 i gp41 HIV-1, polipeptyd Gag1 przeciw antygenom p17 i p24, polipeptyd Po11 przeciw antygenowi p51, polipeptyd Env2 przeciw antygenom gp110 i gp38 HIV-2. Surowica jest uważana za dodatnią, jeśli reaguje z Env1 lub Env2 lub obydwoma Env (podwójna infekcja HIV typu 1 i 2). Reakcja z użyciem tylko Poll and Gag jest uważana za wynik nieokreślony, w takim przypadku obserwacja jest prowadzona podobnie jak w przypadkach nieokreślonych wyników klasycznego immunoblotu z użyciem lizatu HIV.

Osobliwością diagnostyki serologicznej zakażenia wirusem HIV u dzieci urodzonych z matek zakażonych wirusem HIV jest to, że zarówno dzieci zakażone, jak i niezakażone w pierwszych 6-12 miesiącach życia mają przeciwciała przeciwko HIV pochodzenia matczynego, które następnie mogą zanikać. Kryterium wskazującym na obecność zakażenia HIV u dziecka jest wykrycie przeciwciał przeciwko HIV w wieku 18 miesięcy lub więcej. Brak przeciwciał przeciwko HIV u 18-miesięcznego dziecka urodzonego przez matkę zakażoną wirusem HIV jest kryterium zakażenia wirusem HIV.

Zgodnie z zaleceniami WHO immunoblotting (western blot) jest stosowany w diagnostyce zakażenia wirusem HIV jako dodatkowa metoda ekspercka, która powinna potwierdzać wyniki testu ELISA. Ta metoda jest zwykle używana do podwójnego sprawdzenia pozytywnego wyniku testu ELISA, ponieważ jest uważana za bardziej czułą i specyficzną, chociaż bardziej złożoną i kosztowną.

Immunoblotting łączy test immunoenzymatyczny (ELISA) ze wstępną elektroforetyczną separacją białek wirusowych w żelu i przeniesieniem ich na membranę nitrocelulozową. Procedura immunoblot składa się z kilku etapów (ryc. 27). Po pierwsze, wstępnie oczyszczony i rozbity na składniki, HIV jest poddawany elektroforezie, podczas gdy wszystkie antygeny tworzące wirusa są rozdzielane według masy cząsteczkowej. Następnie, metodą blottingu, antygeny są przenoszone z żelu na pasek nitrocelulozy lub filtr nylonowy, który zawiera teraz niewidoczne dla oka spektrum białek charakterystycznych dla wirusa HIV. Następnie na pasek nakłada się materiał testowy (surowicę, osocze krwi pacjenta itp.), a jeśli w próbce znajdują się specyficzne przeciwciała, wiążą się one z paskami ściśle odpowiadających im białek antygenu. W wyniku kolejnych manipulacji (np. ELISA) wynik tej interakcji zostaje zwizualizowany – uwidoczniony. Obecność pasków w niektórych obszarach paska potwierdza obecność w badanej surowicy przeciwciał przeciwko ściśle określonym antygenom HIV.

Immunoblotting jest najczęściej stosowany w celu potwierdzenia rozpoznania zakażenia wirusem HIV. WHO uznaje surowice za dodatnie, jeśli metodą immunoblottingu zostaną wykryte przeciwciała przeciwko dowolnym dwóm białkom otoczki wirusa HIV. Zgodnie z tymi zaleceniami, jeśli zachodzi reakcja tylko z jednym z białek otoczki (