Neposredne in posredne virološke raziskovalne metode. Virološke raziskovalne metode v mikrobiologiji

Virološke raziskovalne metode- metode za proučevanje biologije virusov in njihovo identifikacijo. V virologiji se široko uporabljajo metode molekularne biologije, s pomočjo katerih je bilo mogoče ugotoviti molekularno strukturo virusnih delcev, kako prodrejo v celico in značilnosti razmnoževanja virusov, primarno strukturo virusnih nukleinskih kislin. in beljakovine. Razvijajo se metode za določanje zaporedja sestavnih elementov virusnih nukleinskih kislin in beljakovinskih aminokislin. Funkcije nukleinskih kislin in proteinov, ki jih kodirajo, postane mogoče povezati z nukleotidnim zaporedjem in ugotoviti vzroke znotrajceličnih procesov, ki igrajo pomembno vlogo pri okužbi z e-virusi.

Virološke raziskovalne metode temeljijo tudi na imunoloških procesih (interakcija antigena s protitelesi), bioloških lastnostih virusa (sposobnost hemaglutinacije, hemolize, encimske aktivnosti), značilnostih interakcije virusa z gostiteljsko celico (narava citopatije). učinek, tvorba intracelularnih vključkov itd.).

Pri diagnostiki virusnih okužb, pri gojenju, izolaciji in identifikaciji virusov ter pri pripravi pripravkov cepiv se široko uporablja metoda tkivnih in celičnih kultur. Uporabljajo se primarne, sekundarne, stabilne kontinuirane in diploidne celične kulture. Primarne kulture dobimo z dispergiranjem tkiva s proteolitičnimi encimi (tripsin, kolagenaza). Vir celic so lahko tkiva in organi (pogosteje ledvice) človeških in živalskih zarodkov. Suspenzijo celic v hranilnem mediju namestimo v tako imenovane vzmetnice, stekleničke ali petrijevke, kjer se celice po pritrditvi na površino posode začnejo razmnoževati. Za virusno okužbo se običajno uporablja celični monosloj. Hranilno tekočino odlijemo, virusno suspenzijo vnesemo v določenih razredčitvah in po stiku s celicami dodamo svež hranilni medij, običajno brez seruma.

Celice iz večine primarnih kultur je mogoče subkultivirati in jih imenujemo sekundarne kulture. Z nadaljnjim prehodom celic nastane populacija fibroblastom podobnih celic, ki so sposobne hitrega razmnoževanja, večina pa ohrani prvotni nabor kromosomov. To so tako imenovane diploidne celice. Pri serijski kultivaciji celic dobimo stabilne kontinuirane celične kulture. Med prehodi se pojavijo hitro deleče se homogene celice s heteroploidnim nizom kromosomov. Stabilne celične linije so lahko enoslojne in suspenzijske. Enoslojne kulture rastejo v obliki neprekinjenega sloja na stekleni površini, suspenzijske kulture rastejo v obliki suspenzij v različnih posodah z mešali. Obstaja več kot 400 celičnih linij, pridobljenih iz 40 različnih živalskih vrst (vključno s primati, pticami, plazilci, dvoživkami, ribami, žuželkami) in ljudi.

Delčke posameznih organov in tkiv (organske kulture) lahko gojimo v umetnih hranilnih gojiščih. Tovrstne kulture ohranjajo tkivno strukturo, kar je še posebej pomembno za izolacijo in prehod virusov, ki se v nediferenciranih tkivnih kulturah ne razmnožujejo (na primer koronavirusi).

V okuženih celičnih kulturah lahko viruse odkrijemo s spremembo celične morfologije, citopatskim delovanjem, ki je lahko specifično, pojavom vključkov, z določanjem virusnih antigenov v celici in v tekočini kulture; določanje bioloških lastnosti virusnih potomcev v kulturni tekočini in titracija virusov v tkivni kulturi, piščančjih zarodkih ali občutljivih živalih; z dokazovanjem posameznih virusnih nukleinskih kislin v celicah z molekularno hibridizacijo ali grozdov nukleinskih kislin s citokemično metodo s fluorescenčno mikroskopijo.

Izolacija virusov je naporen in dolgotrajen proces. Izvaja se za določitev vrste ali različice virusa, ki kroži med prebivalstvom (na primer za identifikacijo serovaniant virusa a, divjega ali cepnega seva virusa a itd.); v primerih, ko je treba izvesti nujne epidemiološke ukrepe; ko se pojavijo nove vrste ali različice virusov; če je potrebno, potrdite predhodno diagnozo; za indikacijo virusov v okoljskih predmetih. Pri izolaciji virusov se upošteva možnost njihove obstojnosti v človeškem telesu, pa tudi pojav mešane okužbe, ki jo povzročata dva ali več virusov. Genetsko homogeno populacijo virusa, pridobljeno iz posameznega viriona, imenujemo virusni klon, postopek pridobivanja pa kloniranje.

Za izolacijo virusov, okužbe dovzetnih laboratorijskih živali, se uporabljajo piščančji zarodki, vendar se najpogosteje uporablja tkivna kultura. Prisotnost virusa običajno določa specifična degeneracija celic (citopatski učinek),

tvorba simplastov in sincicij, odkrivanje intracelularnih vključkov, pa tudi specifičnega antigena, odkritega z imunofluorescenco, hemadsorpcijo, hemaglutinacijo (pri hemaglutinirajočih virusih) itd. Te znake je mogoče odkriti šele po 2-3 prehodih virusa.

Za izolacijo številnih virusov, na primer virusov a, se uporabljajo piščančji zarodki, za izolacijo nekaterih virusov Coxsackie in številnih arbovirusov - novorojene miši. Identifikacija izoliranih virusov se izvaja s serološkimi testi in drugimi metodami.

Pri delu z virusi se določi njihov titer. Titracija virusov se običajno izvaja v tkivni kulturi, pri čemer se določi največja razredčitev tekočine, ki vsebuje virus, pri kateri pride do degeneracije tkiva, nastanejo vključki in virusno specifični antigeni. Metodo s plaki lahko uporabimo za titriranje številnih virusov. Plaki ali negativne kolonije virusov so žarišča z virusom uničenih celic enoslojne tkivne kulture pod agarsko prevleko. Štetje kolonij omogoča kvantitativno analizo infekcijske aktivnosti virusov na podlagi tega, da en delec kužnega virusa tvori en plak. Plake prepoznamo z barvanjem kulture z vitalnimi barvili, običajno nevtralno rdečimi; plaki ne absorbirajo barvila in so zato vidni kot svetle lise na ozadju obarvanih živih celic. Titer virusa je izražen kot število enot, ki tvorijo plak, v 1 ml.

Čiščenje in koncentracija virusov se običajno izvaja z diferencialnim ultracentrifugiranjem, ki mu sledi centrifugiranje v koncentracijskih ali gostotnih gradientih. Za čiščenje virusov se uporabljajo imunološke metode, ionsko izmenjevalna kromatografija, imunosorbenti itd.

Laboratorijska diagnostika virusnih okužb vključuje odkrivanje patogena ali njegovih sestavin v kliničnem materialu; izolacija virusa iz tega materiala; serodiagnoza. Izbira laboratorijske diagnostične metode je v vsakem posameznem primeru odvisna od narave bolezni, obdobja bolezni in zmožnosti laboratorija. Sodobna diagnoza virusnih okužb temelji na ekspresnih metodah, ki vam omogočajo, da dobite odgovor nekaj ur po odvzemu kliničnega materiala v zgodnjih fazah po bolezni.Ti vključujejo elektronsko in imunsko elektronsko mikroskopijo,

kot tudi imunofluorescenca, metoda molekularne hibridizacije, detekcija protiteles razreda lgM itd.

Elektronska mikroskopija negativno obarvanih virusov omogoča diferenciacijo virusov in določanje njihove koncentracije. Uporaba elektronske mikroskopije pri diagnostiki virusnih okužb je omejena na tiste primere, kjer je koncentracija virusnih delcev v kliničnem materialu dovolj visoka (10 5 v 1). ml in višje). Pomanjkljivost metode je nezmožnost razlikovanja med virusi, ki pripadajo isti taksonomski skupini. To pomanjkljivost odpravimo z uporabo imunske elektronske mikroskopije. Metoda temelji na tvorbi imunskih kompleksov, ko virusnim delcem dodamo specifičen serum, hkrati pa pride do koncentracije virusnih delcev, kar omogoča njihovo identifikacijo. Metoda se uporablja tudi za odkrivanje protiteles. Za ekspresno diagnostiko se izvaja elektronsko mikroskopski pregled tkivnih izvlečkov, iztrebkov, tekočine iz veziklov in izločkov iz nazofarinksa. Elektronska mikroskopija se pogosto uporablja za preučevanje morfogeneze virusa, njene zmogljivosti se razširijo z uporabo označenih protiteles.

Metoda molekularne hibridizacije, ki temelji na detekciji virusno specifičnih nukleinskih kislin, omogoča detekcijo posameznih kopij genov in ji ni para glede občutljivosti. Reakcija temelji na hibridizaciji komplementarnih verig DNA ali RNA (sonde) in nastanku dvoverižnih struktur. Najcenejša sonda je klonirana rekombinantna DNK. Sonda je označena z radioaktivnimi prekurzorji (običajno radioaktivnim fosforjem). Obetavna je uporaba kolorimetričnih reakcij. Obstaja več variant molekularne hibridizacije: točkasta hibridizacija, blot hibridizacija, sendvič hibridizacija, in situ hibridizacija itd.

Protitelesa razreda lgM se pojavijo prej kot protitelesa razreda G (3-5. dan bolezni) in izginejo po nekaj tednih, zato njihovo odkritje kaže na nedavno okužbo. Protitelesa razreda IgM odkrijemo z imunofluorescenco ali encimskim imunskim testom z uporabo anti-m antiserumov (anti-IgM težkih verig serumov).

Serološke metode v virologiji temeljijo na klasičnih imunoloških reakcijah (glej. Imunološke raziskovalne metode ): reakcije vezave komplementa

inhibicija hemaglutinacije, biološka nevtralizacija, imunodifuzija, indirektna hemaglutinacija, radialna hemoliza, imunofluorescenca, encimski imunski test, radioimunski test. Razvite so bile mikrometode za številne reakcije, njihove tehnike pa se nenehno izboljšujejo. Te metode se uporabljajo za identifikacijo virusov z uporabo niza znanih serumov in za serodiagnostiko, da se določi povečanje protiteles v drugem serumu v primerjavi s prvim (prvi serum se vzame v prvih dneh po bolezni, drugi - po 2-3 tedne). Diagnostična vrednost ni manjša od štirikratnega povečanja protiteles v drugem serumu. Če odkrivanje protiteles razreda lgM kaže na nedavno okužbo, potem protitelesa razreda lgC vztrajajo več let, včasih pa celo življenje.

Za identifikacijo posameznih antigenov virusov in protiteles proti njim v kompleksnih mešanicah brez predhodnega čiščenja beljakovin se uporablja imunobloting. Metoda združuje frakcioniranje proteinov z uporabo elektroforeze v poliakrilamidnem gelu in kasnejši imunski test proteinov z encimskim imunskim testom. Ločevanje proteinov zmanjša zahteve po kemijski čistosti antigena in omogoča identifikacijo posameznih parov antigen-protitelo. Ta naloga je pomembna na primer pri serodiagnostiki okužbe s HIV, kjer so lažno pozitivne reakcije encimskega imunskega testa posledica prisotnosti protiteles proti celičnim antigenom, ki so prisotna kot posledica nezadostnega čiščenja virusnih proteinov. Identifikacija protiteles v serumu bolnikov proti notranjim in zunanjim virusnim antigenom omogoča določitev stopnje bolezni in pri populacijski analizi - variabilnost virusnih proteinov. Imunobloting pri okužbi s HIV se uporablja kot potrditveni test za odkrivanje posameznih virusnih antigenov in protiteles proti njim. Pri analizi populacij se metoda uporablja za ugotavljanje variabilnosti virusnih proteinov. Velika vrednost metode je v možnosti analize antigenov, sintetiziranih s tehnologijo rekombinantne DNK, ugotavljanju njihove velikosti in prisotnosti antigenskih determinant.

Bibliografija: Bukrinskaja A.G. Virologija, M., 1986; Virologija, metode, ur. B. Meikhi, prev. iz angleščine, M., 1988; Priročnik mikrobioloških in viroloških raziskovalnih metod, ed. M.O. Birger, M., 1982.

Raziskave za diagnozo bolezni z virusno naravo. To je potrebno za identifikacijo virusa, preučevanje njegove biologije in sposobnosti vpliva na živalske in človeške celice. Tako postane mogoče razumeti patogenezo virusnih bolezni in v skladu s tem izbrati pravo metodo zdravljenja.

Kakšna je diagnoza?

v živih celicah. Da bi ga raziskali, ga je treba gojiti na ravni eksperimentalnega organizma ali Za to se v medicinski praksi in mikrobiologiji na splošno izvajajo virološke raziskovalne metode, ki imajo naslednje glavne pristope:

naravnost;
posredno;
serološke.

Material je mogoče neposredno pregledati na prisotnost nukleinskih kislin, virusnega antigena ali na primer izolirati in identificirati virus iz kliničnega materiala.

Poleg možnosti ugotavljanja etiologije bolezni, spremljanja terapevtskega učinka, virološke raziskovalne metode igrajo pomembno vlogo pri protiepidemičnih ukrepih. Za izolacijo in uporabo piščančjih zarodkov, laboratorijskih živali ali celičnih kultur.

Kako se raziskujejo?

Najhitrejša je direktna metoda. Omogoča odkrivanje virusa, antigena ali NA (nukleinske kisline) v samem kliničnem materialu. Traja od dveh ur do enega dneva.

EM - elektronska mikroskopija. Neposredno zazna virus.
IEM - imunska elektronska mikroskopija. Uporablja specifična protitelesa proti virusom.
RIF - imunofluorescenčna reakcija. Uporablja protitelesa, vezana na barvilo. Takšne virološke raziskovalne metode se pogosto uporabljajo kot hitro dekodiranje etiologije SARS (akutne respiratorne virusne okužbe), ko se vzamejo brisi iz sluznice zgornjih dihalnih poti.
ELISA - encimski imunski test - določanje virusnih antigenov, podoben RIF, vendar temelji na encimskem označevanju protiteles.
RIA - radioimunski test. Uporablja radioizotopsko označevanje protiteles za zagotavljanje visoke občutljivosti pri odkrivanju virusnega antigena.
Molekularna - NK hibridizacija ali izolacija virusnih genomov s pomočjo PCR (verižna reakcija s polimerazo).
Citologija - redko se uporablja, vendar so za nekatere okužbe te virološke raziskovalne metode zelo učinkovite. Pregledajo se biopsijski materiali, obdukcije in brisi, obdelani za barvanje in analizo pod mikroskopom.

Kaj je smisel raziskovanja?

Za uspešno izolacijo virusov jemljemo klinični material v skladu s patogenezo in čim prej. Ta postopek pogosto zahteva več prehodov, preden se uporabijo določeni virološki testi.

Mikrobiologija je preučevanje mikroskopskih bitij. In njeno področje ni le medicina. Je temeljna veda za kmetijstvo, veterino, vesoljsko in tehnično industrijo ter geologijo.

Seveda pa je vse ustvarjeno za človeka in njegov razvoj na tem čudovitem planetu. Zato je zelo pomembno, da nevarnost pravočasno odkrijemo in jo nevtraliziramo. Virusi se razlikujejo od bakterij. To so strukture, ki vstopijo v telo in povzročijo nastanek nove generacije. Izgledajo kot kristali in so namenjeni nadzoru procesa njihovega razmnoževanja, čeprav se sami ne hranijo, ne rastejo in ne izločajo presnovnih produktov.

Virus lahko povzroči resno bolezen v katerem koli živem organizmu, v katerega je vstopil. Poleg tega se lahko razvija. Zato je treba virološke raziskovalne metode v mikrobiologiji razvijati in izboljševati, saj je lahko ogrožena človeška civilizacija kot celota.

materialov

Za odkrivanje in prepoznavanje virusov v medicini praviloma vzamejo:

izpiranje nazofarinksa (okužbe dihal);
zardevanje in blato (enterovirusne okužbe);
ostružki, vsebina veziklov (kožne lezije, sluznice, kot so herpes, norice);
navali (eksantemične okužbe, kot so ošpice, rdečke);
kri, cerebrospinalna tekočina (arbovirusne okužbe).

Faze

Vse faze virološke raziskovalne metode vključujejo:

zbiranje gradiva;
izbira, pridobitev testnega sistema, ugotavljanje njegove sposobnosti preživetja;
okužba testnega sistema;
indikacija virusa;
določitev vrste virusa.

V bistvu se patogeni virusi razlikujejo po prisotnosti tkivne in tipske specifičnosti. Vzemimo za primer poliovirus, ki se razmnožuje samo v primatih (v njihovih celicah). V skladu s tem se za izolacijo določenega virusa uporablja posebna tkivna kultura. Če govorimo o neznanem patogenu, potem je priporočljivo hkrati okužiti tri, po možnosti štiri celične kulture.

Tako bo morda eden od njih občutljiv. Za določitev prisotnosti virusa v okuženih kulturah si oglejte razvoj specifične celične degeneracije, intracelularne vključke, detekcijo specifičnega antigena, pozitivne hemaglutinacijske in hemadsorpcijske teste.

Vse virološke metode preiskave (neposredne in posredne, serološke) je treba izbrati kot najprimernejše za posamezen primer suma okužbe.

Posredne metode temeljijo na izolaciji in identifikaciji virusa. So naporni, dolgotrajni, a natančni.

Serodiagnostika

Ta diagnoza se nanaša na metodo, ki temelji na reakciji antigen-protitelo. Najpogosteje se uporabljajo seznanjeni krvni serumi, odvzeti v nekajtedenskih intervalih. Če se titer protiteles poveča 4-krat ali večkrat, se reakcija šteje za pozitivno. Za določitev tipske specifičnosti virusa se uporablja test nevtralizacije virusa. Za določitev skupinske specifičnosti morate dobiti reakcijo fiksacije komplementa.

Široko se uporabljajo različne različice encimskega imunskega testa, reakcija inhibicije hemaglutinacije, pasivna hemaglutinacija, reverzna pasivna hemaglutinacija, RIF. Tudi v genskem inženiringu so razvili metodo za pridobivanje monoklonskih protiteles. Ozko specifičnost monoklonov je mogoče preseči z uporabo več monoklonskih protiteles proti različnim virusnim determinantam. Tako se je povečala specifičnost in občutljivost testa z določanjem antigenov.

Nekatere funkcije

Danes je bilo ustvarjenih veliko različnih testnih sistemov za imunološko diagnostiko okužb, ki so posledica vstopa virusa v živ organizem.

Tako so virološke raziskovalne metode metode za izolacijo virusov, preučevanje njihovih lastnosti in ugotavljanje njihove etiološke povezave z določenimi boleznimi.

Virološke raziskovalne metode— metode za preučevanje biologije virusov in njihovo identifikacijo. V virologiji se široko uporabljajo metode molekularne biologije, s pomočjo katerih je bilo mogoče ugotoviti molekularno strukturo virusnih delcev, kako prodrejo v celico in značilnosti razmnoževanja virusov, primarno strukturo virusnih nukleinskih kislin. in beljakovine. Razvijajo se metode za določanje zaporedja sestavnih elementov virusnih nukleinskih kislin in beljakovinskih aminokislin. Funkcije nukleinskih kislin in proteinov, ki jih kodirajo, postane mogoče povezati z nukleotidnim zaporedjem in ugotoviti vzroke znotrajceličnih procesov, ki igrajo pomembno vlogo pri patogenezi virusne okužbe.

Izolacija virusov je naporen in dolgotrajen proces. Izvaja se za določitev vrste ali različice virusa, ki kroži med prebivalstvom (na primer za identifikacijo serovaniant virusa gripe, divjega ali cepnega seva virusa otroške paralize itd.); v primerih, ko je treba izvesti nujne epidemiološke ukrepe; ko se pojavijo nove vrste ali različice virusov; če je potrebno, potrdite predhodno diagnozo; za indikacijo virusov v okoljskih predmetih. Pri izolaciji virusov se upošteva možnost njihove obstojnosti v človeškem telesu, pa tudi pojav mešane okužbe, ki jo povzročata dva ali več virusov. Genetsko homogeno populacijo virusa, pridobljeno iz posameznega viriona, imenujemo virusni klon, postopek pridobivanja pa kloniranje.

Za izolacijo virusov, okužbe dovzetnih laboratorijskih živali, se uporabljajo piščančji zarodki, vendar se najpogosteje uporablja tkivna kultura. Prisotnost virusa se običajno določi s specifično celično degeneracijo (citopatski učinek), tvorbo simplastov in sincitijev, detekcijo intracelularnih vključkov, pa tudi specifični antigen, odkrit z imunofluorescenco, hemadsorpcijo, hemaglutinacijo (pri hemaglutinirajočih virusih) itd. . Te znake je mogoče odkriti šele po 2-3 prehodih virusa.

Za izolacijo številnih virusov, kot so virusi influence, se uporabljajo piščančji zarodki, za izolacijo nekaterih virusov Coxsackie in številnih arbovirusov pa novorojene miši. Identifikacija izoliranih virusov se izvaja s serološkimi testi in drugimi metodami.

Laboratorijska diagnostika virusnih okužb vključuje odkrivanje patogena ali njegovih sestavin v kliničnem materialu; izolacija virusa iz tega materiala; serodiagnoza. Izbira laboratorijske diagnostične metode je v vsakem posameznem primeru odvisna od narave bolezni, obdobja bolezni in zmožnosti laboratorija. Sodobna diagnostika virusnih okužb temelji na ekspresnih metodah, ki omogočajo pridobitev odziva nekaj ur po odvzemu kliničnega materiala v zgodnjih fazah po bolezni, vključno z elektronsko in imunsko elektronsko mikroskopijo, pa tudi z imunofluorescenco, metodo molekularne hibridizacije, odkrivanje protiteles razreda lgM itd.

Serološke metode v virologiji temeljijo na klasičnih imunoloških reakcijah (glej. Imunološke raziskovalne metode ): reakcije vezave komplementa, inhibicija hemaglutinacije, biološka nevtralizacija, imunodifuzija, indirektna hemaglutinacija, radialna hemoliza, imunofluorescenca, encimski imunski test, radioimunski test. Razvite so bile mikrometode za številne reakcije, njihove tehnike pa se nenehno izboljšujejo. Te metode se uporabljajo za identifikacijo virusov z uporabo niza znanih serumov in za serodiagnostiko, da se določi povečanje protiteles v drugem serumu v primerjavi s prvim (prvi serum se vzame v prvih dneh po bolezni, drugi - po 2-3 tedne). Diagnostična vrednost ni manjša od štirikratnega povečanja protiteles v drugem serumu. Če odkrivanje protiteles razreda lgM kaže na nedavno okužbo, potem protitelesa razreda lgC vztrajajo več let, včasih pa celo življenje.

Za identifikacijo posameznih antigenov virusov in protiteles proti njim v kompleksnih mešanicah brez predhodnega čiščenja beljakovin se uporablja imunobloting. Metoda združuje frakcioniranje proteinov z uporabo elektroforeze v poliakrilamidnem gelu in kasnejši imunski test proteinov z encimskim imunskim testom. Ločevanje proteinov zmanjša zahteve po kemijski čistosti antigena in omogoča identifikacijo posameznih parov antigen-protitelo. Ta naloga je pomembna na primer pri serodiagnostiki okužbe s HIV, kjer so lažno pozitivne reakcije encimskega imunskega testa posledica prisotnosti protiteles proti celičnim antigenom, ki so prisotna kot posledica nezadostnega čiščenja virusnih proteinov. Identifikacija protiteles v serumih bolnikov proti notranjim in zunanjim virusnim antigenom omogoča določitev stadija bolezni, pri populacijski analizi pa variabilnost virusnih proteinov. Imunobloting pri okužbi s HIV se uporablja kot potrditveni test za odkrivanje posameznih virusnih antigenov in protiteles proti njim. Pri analizi populacij se metoda uporablja za ugotavljanje variabilnosti virusnih proteinov. Velika vrednost metode je v možnosti analize antigenov, sintetiziranih s tehnologijo rekombinantne DNK, ugotavljanju njihove velikosti in prisotnosti antigenskih determinant.

metode za proučevanje biologije virusov in njihovo identifikacijo. V virologiji se široko uporabljajo metode molekularne biologije, s pomočjo katerih je bilo mogoče ugotoviti molekularno strukturo virusnih delcev, kako prodrejo v celico in značilnosti razmnoževanja virusov, primarno strukturo virusnih nukleinskih kislin. in beljakovine. Razvijajo se metode za določanje zaporedja sestavnih elementov virusnih nukleinskih kislin in beljakovinskih aminokislin. Funkcije nukleinskih kislin in proteinov, ki jih kodirajo, postane mogoče povezati z nukleotidnim zaporedjem in ugotoviti vzroke znotrajceličnih procesov, ki igrajo pomembno vlogo pri patogenezi virusne okužbe.

Izolacija virusov je naporen in dolgotrajen proces. Izvaja se za določitev vrste ali različice virusa, ki kroži med prebivalstvom (na primer za identifikacijo serovaniant virusa gripe, divjega ali cepnega seva virusa otroške paralize itd.); v primerih, ko je treba izvesti nujne epidemiološke ukrepe; ko se pojavijo nove vrste ali različice virusov; če je potrebno, potrdite predhodno diagnozo; za indikacijo virusov v okoljskih predmetih. Pri izolaciji virusov se upošteva možnost njihove obstojnosti v človeškem telesu, pa tudi pojav mešane okužbe, ki jo povzročata dva ali več virusov. Genetsko homogeno populacijo virusa, pridobljeno iz posameznega viriona, imenujemo virusni klon, postopek pridobivanja pa kloniranje.

Laboratorijska diagnostika virusnih okužb vključuje odkrivanje patogena ali njegovih sestavin v kliničnem materialu; izolacija virusa iz tega materiala; serodiagnoza. Izbira laboratorijske diagnostične metode je v vsakem posameznem primeru odvisna od narave bolezni, obdobja bolezni in zmožnosti laboratorija. Sodobna diagnostika virusnih okužb temelji na ekspresnih metodah, ki omogočajo pridobitev odziva nekaj ur po odvzemu kliničnega materiala v zgodnjih fazah po bolezni, vključno z elektronsko in imunsko elektronsko mikroskopijo, pa tudi z imunofluorescenco, metodo molekularne hibridizacije, odkrivanje protiteles razreda lgM itd.

Serološke metode v virologiji temeljijo na klasičnih imunoloških reakcijah (glej Imunološke metode raziskovanja). : reakcije vezave komplementa, inhibicija hemaglutinacije, biološka nevtralizacija, imunodifuzija, indirektna hemaglutinacija, radialna hemoliza, imunofluorescenca, encimski imunski test, radioimunski test. Razvite so bile mikrometode za številne reakcije, njihove tehnike pa se nenehno izboljšujejo. Te metode se uporabljajo za identifikacijo virusov z uporabo niza znanih serumov in za serodiagnostiko, da se določi povečanje protiteles v drugem serumu v primerjavi s prvim (prvi serum se vzame v prvih dneh po bolezni, drugi - po 2-3 tedne). Diagnostična vrednost ni manjša od štirikratnega povečanja protiteles v drugem serumu. Če odkrivanje protiteles razreda lgM kaže na nedavno okužbo, potem protitelesa razreda lgC vztrajajo več let, včasih pa celo življenje.

- metode nevtralizacije odpadkov, ki vsebujejo organske snovi, ki temeljijo na njihovem segrevanju zaradi vitalne aktivnosti termofilnih aerobnih mikroorganizmov ...
Medicinska enciklopedija
- histokemične metode za odkrivanje encimov, ki temeljijo na reakciji tvorbe oborin kalcijevega ali magnezijevega fosfata pri lokalizaciji encimske aktivnosti med inkubacijo tkivnih odsekov z organskimi ...
Medicinska enciklopedija
- metode za odkrivanje histiocitov v preparatih živčnega tkiva in različnih organov z uporabo raztopin amonijevega srebra ali piridin-soda srebra ...
Medicinska enciklopedija
- metode za ocenjevanje domnev o naravi dedovanja, ki temeljijo na primerjavi opaženih in pričakovanih razmerij med bolnimi in zdravimi v družinah, obremenjenih z dednimi boleznimi, ob upoštevanju metode ...
Medicinska enciklopedija
- uporabljajo se za preučevanje strukture in delovanja celic in tkiv ljudi, živali in rastlin v normalnih, patoloških in eksperimentalnih pogojih...
Medicinska enciklopedija
- metode za identifikacijo kemikalij v histoloških rezih. Sestavni del G. m. so citokemične metode, ki zaznavajo kemikalije v celicah pripravljenih brisov in odtisov ...
Medicinska enciklopedija
- metode za kvantitativno in kvalitativno določanje glukoze v krvi in urinu, ki temeljijo na oksidaciji glukoze z atmosferskim kisikom v prisotnosti encima glukoza oksidaza ...
Medicinska enciklopedija
- diagnostične raziskovalne metode, ki temeljijo na specifični interakciji antigenov in protiteles ...
Medicinska enciklopedija
- metode za odkrivanje fibroznih struktur vezivnega tkiva in nevroglije v histoloških preparatih na podlagi njihovega večbarvnega barvanja...
Medicinska enciklopedija
- 1) metoda barvanja histoloških pripravkov dermisa z uporabo Mayerjevega hemaluna, raztopine kalijevega galuna in rodamina; celična jedra obarvajo modro, eleidin obarva rdeče...
Medicinska enciklopedija
- v medicini - niz metod za kvantitativno preučevanje in analizo stanja in obnašanja objektov in sistemov, povezanih z medicino in zdravstvom ...
Medicinska enciklopedija
- načini preučevanja različnih predmetov z uporabo mikroskopa ...
Medicinska enciklopedija
- temelji na uporabi zakonov optike, ki se nanašajo na naravo, širjenje in interakcijo s snovjo elektromagnetnega sevanja v optičnem območju ...
Medicinska enciklopedija
- metode raziskovanja in ocenjevanja kakovosti predmetov okolja s pomočjo čutnih organov ...
Medicinska enciklopedija
- splošno ime številnih metod za impregnacijo histoloških pripravkov s srebrom za odkrivanje glialnih in drugih argirofilnih vlaken ...
Medicinska enciklopedija
- imenujeta jih preiskovalec in sodišče za reševanje posebnih vprašanj, ki nastanejo pri preiskovanju kaznivih dejanj in obravnavi civilnih zadev. Pridržane so tudi na predlog sodnomedicinske...
Medicinska enciklopedija

"Virusološke raziskovalne metode" v knjigah

Rage Against The Machine Killing In The Name (1992) podnapisi - zvlecite podnapise

avtor Tsaler Igor

Rage Against The Machine Killing In The Name (1992) Prvi album Rage Against The Machine iz Los Angelesa je združil hip-hop in hard rock ter ju posul z aktualnimi političnimi manifesti in, kar je prijetno, precejšnjo dozo gostega funk ritma. V pesmi "Killing in the name", vključeni v prvi singel,

James Brown Get Up (I Feel Like Being A) Sex Machine (1970)

Iz knjige Popularna glasba 20. stoletja: jazz, blues, rock, pop, country, folk, elektronika, soul avtor Tsaler Igor

James Brown Get Up (I Feel Like Being A) Sex Machine (1970) Proti koncu šestdesetih let je James Brown začel eksperimentirati. Srce parajoči soul iz skupine The Famous Flames se je umaknil hrupnemu funku iz skupine The J.B. Eden najpomembnejših mejnikov bližajoče se dobe funka je bila »Sex Machine«, ki je v desetminutni različici

Rage Against The Machine

Iz knjige Proti nemogočemu (zbirka člankov o kulturi) avtor Koltašov Vasilij Georgijevič

Rage Against The Machine Tom Morello: »Naš cilj je pomagati ljudem, da se osvobodijo verig laži in nasilja, ki so jih zapletle v vlade, mednarodne korporacije, medije in politične stranke, da ljudem po vsem svetu damo občutek zaupanja v jutri in

Dobrodošli v stroju

Iz knjige Čas zvonjenja avtor Smirnov Ilya

Dobrodošli v stroju. Začetek perestrojke v naši zgodovini lahko datiramo v januar 1987. Nato je potekal liberalni plenum Centralnega komiteja in v Yunosti smo dobili priložnost objaviti nelektoriran seznam sodobnih "zvezd" sovjetskega rocka, vključno z DDT, CLOUD EDGE in

Toyoda Machine Works

Iz knjige Gemba kaizen. Pot do zmanjšanja stroškov in izboljšanja kakovosti avtorja Imai Masaaki

Toyoda Machine Works Kot pravi Yoshio Shima, direktor podjetja Toyoda Machine Works, so se koristi vzpostavitve sistema kakovosti in standardov za zagotavljanje kakovosti pokazale v osemdesetih letih prejšnjega stoletja, ko je podjetje uvedlo koncept "popolnega upravljanja, ki temelji na kakovosti"

Stroj

Iz knjige Filozofski slovar avtor Grof Sponville André

Stroj (stroj) »Če bi se čolniki tkali sami,« je nekoč pripomnil Aristotel, »obrtniki ne bi potrebovali delavcev in gospodarji ne bi potrebovali sužnjev« (»Politika«, I, 4). To je približno tisto, kar imenujemo stroj - predmet, ki se lahko premika, brez duše (avtomat) in

Iz knjige Internet Intelligence [Action Guide] avtor Juščuk Evgenij Leonidovič

Arhiv spletnih mest Internet Archive Wayback Machine E-poštni naslov - http://web.archive.org Vsakdo, ki je dovolj dolgo zbiral informacije o problemu, ki ga zanima, ve, kako pomembno je včasih najti informacije, objavljene na spletno mesto pred nekaj leti. Včasih je samo

Internet Archive Wayback Machine

Iz knjige Boj proti črnemu PR na internetu avtor Kuzin Aleksander Vladimirovič

Arhiv spletnih mest Internetni arhiv Wayback Machine Zelo pogosto napad črnih piarovcev pride za vas nepričakovano. V tem primeru se prvič soočite s potrebo po natančnem preučevanju sovražnika. Če bi sploh domnevali takšen razvoj dogodkov (na primer v

4.9. Varnostno kopiranje s Time Machine

avtorica Skrylina Sofya

4.9. Varnostno kopiranje s Time Machine Mac OS X Leopard vam omogoča redno varnostno kopiranje vašega računalnika z aplikacijo Time Machine. Po ustreznih nastavitvah bo aplikacija samodejno

4.9.2. Ustvarite svojo prvo varnostno kopijo s Time Machine

Iz knjige Macintosh Tutorial avtorica Skrylina Sofya

4.9.2. Ustvarjanje vaše prve varnostne kopije s programom Time Machine Preden začnete ustvarjati svojo prvo varnostno kopijo, morate bodisi vstaviti zunanji pogon ali imeti prosto particijo trdega diska, ki je namenjena samo za varnostno kopiranje.

4.9.4. Uporaba Time Machine

Iz knjige Macintosh Tutorial avtorica Skrylina Sofya

4.9.4. Uporaba Time Machine Ko opravite potrebne nastavitve Time Machine in ustvarite številne varnostne kopije, lahko začnete iskati in obnavljati prejšnje različice svojih datotek. Za to: 1. Odprite okno Finderja in izberite datoteko, ki jo želite obnoviti.2. če

Virusi se za razliko od bakterij razmnožujejo le v živih celicah. V zvezi s tem se lahko gojenje virusov izvaja na ravni telesa poskusne živali (piščančji zarodek kot organizem v razvoju imenujemo poskusne živali) ali žive celice, vzgojene zunaj telesa, tj. na ravni celične kulture.

Uporaba laboratorijskih živali. Eden od načinov izolacije in gojenja virusov je okužba laboratorijskih živali. Uporabljajo se za izolacijo virusov, ki ne povzročajo razvoja citopatskih sprememb v celičnih kulturah in se ne razmnožujejo v piščančjih zarodkih. Uporaba laboratorijskih živali omogoča tudi prepoznavanje narave virusne okužbe s kompleksom kliničnih simptomov. Kot laboratorijske živali se najpogosteje uporabljajo bele miši, hrčki, morski prašički in zajci, odvisno od namena dela in vrste virusov, ki jih proučujemo. Od večjih živali se uporabljajo opice različnih vrst in nekatere druge živali. Od ptic uporabite piščance, gosi, race. V zadnjih letih so bile novorojene živali (bolj dovzetne za viruse), "sterilne živali" (izvlečene iz maternice in hranjene v sterilnih pogojih z uporabo sterilnega zraka in sterilizirane hrane) in živali čistih linij z znano dednostjo (inbred ali linearne živali). pogosteje uporabljena.

V poskus se vzamejo samo zdrave živali, po možnosti iz ene drevesnice in ene serije. Sočasno se meri tudi telesna temperatura, saj prihaja do dnevnih nihanj. Testni material se daje ob upoštevanju tropizma virusov do določenih tkiv. Torej, za izolacijo nevtrotropnih virusov se material injicira v možgane, za izolacijo pnevmotropnih virusov - skozi nos (v lahki anesteziji z etrom).

Pri laboratorijskih živalih je po okužbi z materialom, ki vsebuje virus, pomembno pravočasno in pravilno ter aseptično odvzeti material za nadaljnje raziskave. Rezultati izolacije virusa se štejejo za pozitivne, če se pri živali po ustrezni inkubacijski dobi pojavijo simptomi okužbe.

Uporaba piščančjih zarodkov. V tkivih zarodka, njegovih membranah, rumenjakovi vrečki se lahko razmnožujejo številni patogeni človeški in živalski virusi. Pri tem je pomembna selektivnost virusov na posamezno tkivo: virusi črnih koz se dobro razmnožujejo in kopičijo v celicah horionsko-alantoične membrane, virus mumpsa v amnionu, virusi influence v amnionu in alantoisu, virus stekline pa v celicah amniona. v rumenjakovi vrečki.

Gojenje virusov v razvijajočih se zarodkih ima številne prednosti pred drugimi metodami: gosta lupina precej zanesljivo ščiti notranjo vsebino pred mikrobi; pri okužbi piščančjih zarodkov dobimo večji donos materiala, ki vsebuje virus, kot pri drugih metodah gojenja; metoda okužbe piščančjih zarodkov je preprosta in dostopna vsem virološkim laboratorijem; zarodki imajo zadostno sposobnost preživetja in odpornost na patogene zunanje dejavnike. Vendar pa piščančji zarodki niso vedno brez latentnih virusnih in bakterijskih okužb. Težko je opazovati dinamiko patoloških sprememb, ki se pojavijo v zarodku po okužbi z virusom. Obdukcija okuženih zarodkov pogosto ne pokaže vidnih sprememb, virus pa odkrije s hemaglutinacijskim testom in drugimi metodami. Pri okuženih zarodkih je nemogoče slediti naraščanju titra protiteles. Metoda ni primerna za vse viruse.

Za virološke študije se uporabljajo zarodki, stari 7-12 dni, pridobljeni iz perutninskih farm. Zarodke lahko gojite v običajnem termostatu, na dnu katerega so nameščeni pladnji z vodo za vlaženje zraka. Temperatura v termostatu mora biti 37 ° C, vlažnost pa 60-65%. Izberite velika, čista (vendar neoprana) oplojena jajca belih piščancev, shranjena največ 10 dni pri temperaturi 5-10 °C. Oplojena jajčeca prepoznamo po zarodni ploščici, ki je, ko jo presvetlimo z ovoskopom, videti kot temna lisa.

Pri delu z virusi se lahko uporabljajo različne metode okužbe zarodkov, najbolj praktična uporaba pa je aplikacija virusa na horionsko-alantoisno membrano, vnos v alantoično, amnijsko votlino in rumenjakovo vrečko.

(slika 10.5). Izbira metode je odvisna od bioloških lastnosti preučevanega virusa.

riž. 10.5.

Pred okužbo se na ovoskopu določi sposobnost preživetja zarodka. Živi zarodki so mobilni, pulziranje posod membran je jasno vidno. Pri svečenju s preprostim svinčnikom na lupini označite meje zračnega mešička oziroma lokacijo zarodka, ki jo določi njegova senca na lupini.

Piščančji zarodki se okužijo v škatli v strogo aseptičnih pogojih z uporabo instrumentov, steriliziranih s vrenjem.

Pri okužbi na horionsko-alantoični membrani so najbolj primerni 12-dnevni zarodki. Za okužbo v alantoični votlini se uporabljajo zarodki, stari 10-11 dni, v amnijski votlini - zarodki, stari 7-11 dni, v rumenjakovi vrečki - zarodki, stari 7 dni.

Jajca z okuženimi zarodki se postavijo na stojala s topim koncem navzgor. Temperaturni režim in inkubacijska doba sta odvisna od bioloških lastnosti inokuliranega virusa. Sposobnost preživetja zarodkov se dnevno spremlja pod ovoskopom. Zarodkov, ki so zaradi poškodbe odmrli prvi dan po okužbi, ne pregledamo.

Pred odvzemom materiala se zarodki 18-20 ur ohlajajo pri 4 °C, da se zožijo žile in prepreči krvavitev pri obdukciji. Zarodke v škatli odpremo v skladu s pravili asepse.

Alantoisno tekočino posesamo s pipeto, sterilnost kontroliramo z inokulacijo v sladkorno ali mesno-peptonsko juho, preverimo prisotnost virusa v reakciji hemaglutinacije in shranimo pri 4 °C v zamrznjenem stanju.

Za pridobitev plodovnice najprej aspiriramo alantoično tekočino, nato s pinceto zajamemo plodovnico, rahlo privzdignemo in s Pasteurjevo pipeto odsesamo plodovnico.

Pri proučevanju sprememb v horionsko-alantoični membrani jo prerežemo s škarjami in vso vsebino zlijemo skozi luknjo v petrijevko. Horionsko-alantoična membrana ostane znotraj lupine in se s pinceto odstrani v petrijevko s fiziološko raztopino. Tukaj se opere, zravna in preučuje naravo žariščnih lezij na temnem ozadju.

Za pridobitev amnijske membrane se amnijska vreča, v kateri je zarodek, prereže in osvobodi zarodka ter se pregleda glede poškodb.

Za pridobitev rumenjakove ovojnice prerežemo horion-alantois, odsesamo alantoično in amnijsko tekočino, s pinceto odstranimo plod, ki ga ločimo s popkovino, zajamemo rumenjakovo vrečko in jo damo v petrijevko. Kontrola sterilnosti, pregled prisotnosti lezij. Rumenjak, če je potrebno, lahko odstranite z brizgo, ne da bi odstranili rumenjakovo vrečko.

Prisotnost virusa v alantoični in amnijski tekočini okuženega zarodka ugotavljamo s hemaglutinacijskim testom. Tekočine iz hemaglutinacijsko pozitivnih zarodkov po testiranju sterilnosti se združijo in titrirajo v razširjenem hemaglutinacijskem testu.

V prisotnosti majhne količine virusa ali če ga ni mogoče odkriti v testnem materialu, se izvedejo zaporedne pasaže na piščančjih zarodkih. Če po treh zaporednih pasažah na zarodkih virus v testnem materialu ni odkrit, se rezultat šteje za negativnega.

Uporaba celičnih kultur. Gojenje celic zunaj telesa zahteva izpolnjevanje številnih pogojev. Eden od njih je strogo upoštevanje sterilnosti med delom, saj so uporabljeni hranilni mediji odličen hranilni substrat tudi za bakterije in glive. Tkivne celice so zelo občutljive na soli težkih kovin. Zato je treba dati izjemnega pomena kakovosti različnih sestavin, ki sestavljajo fiziološke raztopine in hranilne medije, ter načinom obdelave pripomočkov in gumijastih zamaškov, ki se uporabljajo v celični kulturi.

Eden od predpogojev za uspešno delo s celicami je visoka kakovost destilirane vode (preverjeno dvakrat tedensko). Za delo s celicami se uporablja bidestilirana ali deionizirana voda. Najboljši destilatorji so naprave iz stekla ali legiranega jekla: ioni težkih kovin, ki so strupeni za celice, se iz takšne opreme ne izperejo. Deionizirano vodo pridobivamo na posebnih napravah, kjer se voda čisti od soli med zaporednim prehodom skozi kolone z anionskim izmenjevalnikom in kationskim izmenjevalnikom.

Pri gojenju celic so še posebej visoke zahteve za pripravo in sterilizacijo posod in zamaškov. V mnogih primerih je njihovo nepravilno pranje in sterilizacija tisto, kar povzroči, da se celice ne pritrdijo na steklo ali hitro degenerirajo enosloj celic.

Za rast in razmnoževanje celic zunaj telesa je potreben kompleksen sklop fizikalno-kemijskih dejavnikov: določena temperatura, koncentracija vodikovih ionov, anorganskih spojin, ogljikovih hidratov, aminokislin, beljakovin, vitaminov, kisika in ogljikovega dioksida, torej za pri gojenju virusov v celičnih kulturah se uporabljajo hranilni mediji kompleksne sestave. Glede na naravo sestavin, ki sestavljajo njihovo sestavo, so ti mediji razdeljeni v dve skupini.

1. Mediji, ki so mešanice fizioloških raztopin (Hanks, Earl itd.) in naravnih sestavin (živalski in človeški krvni serum, hidrolizat albumina). Količina vsake od teh komponent v različnih formulacijah medijev je različna.
2. Sintetična in polsintetična gojišča, sestavljena iz fizioloških raztopin (Earl, Hanks itd.) z dodatkom aminokislin, vitaminov, koencimov in nukleotidov (Eagle media, 199 itd.). V sintetičnih medijih lahko celice kratek čas (do 7 dni) obstajajo v stanju, sposobnem preživetja. Da bi jih ohranili v stanju, sposobnem preživetja dlje časa, pa tudi za ustvarjanje boljših pogojev za rast in razmnoževanje celic, se sintetičnim gojiščem doda živalski krvni serum (krav, telet itd.).

Za izolacijo virusov se lahko uporabljajo različne metode gojenja celic zunaj telesa. Vendar pa so trenutno največjo praktično uporabo dobile enoslojne kulture primarnih tripsiniziranih in presajenih celičnih linij. Enoslojne celične kulture gojimo v steklenih posodah z ravnimi stenami-žimnicami prostornine 1 l, 250 in 100 ml ali v običajnih bakterioloških epruvetah, ustrezno obdelanih.

Pri uporabi primarnih tripsiniziranih celičnih kultur je bistvo metode v uničenju medceličnih vezi v tkivih s proteolitičnimi encimi in ločevanju celic za rast monosloja na površini stekla. Kot vir za pridobivanje celic lahko služijo tkiva in organi človeških in živalskih zarodkov, zaklanih živali in ptic, pa tudi tistih, ki so bili med operacijo odvzeti ljudem. Uporabite normalna in maligno degenerirana tkiva, epitelijska, fibroblastna in mešana. Sposobnost razmnoževanja celic, ekstrahiranih iz telesa, je tesno povezana s stopnjo diferenciacije tkiv. Manj ko je tkivo diferencirano, intenzivnejša je sposobnost njegovih celic za proliferacijo in vitro. Zato je celice embrionalnih in tumorskih tkiv veliko lažje gojiti zunaj telesa kot običajne celice odraslih živali.

Dnevne kulture se pregledajo pod mikroskopom z majhno povečavo, da se določi narava njihove rasti. Če se celice ne razmnožujejo, so videti okrogle, zrnate, temne in se luščijo s stekla, je steklovina slabo obdelana ali pa so sestavine v gojišču strupene.

Skupaj s primarnimi tripsiniziranimi tkivi se presajene celične kulture pogosto uporabljajo za gojenje virusov; celične kulture, ki se lahko neomejeno razmnožujejo izven telesa. Najpogosteje se uporabljajo celične kulture, pridobljene iz normalnih in rakavih človeških tkiv. Splošno znana je postala celična linija HeLa, pridobljena iz tumorja materničnega vratu, Hep-2 iz karcinoma grla, KV iz tkiva raka ustne votline. Takšne celične kulture so pripravljene tudi iz normalnih živalskih tkiv - ledvice opice, kunca in prašičjega zarodka (tabela 10.1).

Za ponovno setev presajenih celic hranilni medij odsesamo s pipeto in izlijemo. Nastalo tanko plast celic uničimo z raztopino tripsina, tako sproščene celice pa prenesemo v novo posodo s svežo hranilno raztopino, kjer ponovno nastane monosloj celic.

Indikator prisotnosti virusa v okuženih celičnih kulturah je lahko:

a) razvoj specifične celične degeneracije;
b) odkrivanje intracelularnih vključkov;
c) dokazovanje specifičnega antigena z imunofluorescenco;
d) pozitivna hemadsorpcijska reakcija;
e) pozitivna hemaglutinacijska reakcija;
e) tvorba plakov.

Tabela 10.1

Seznam najpogosteje uporabljenih celičnih kultur

Za odkrivanje specifične degeneracije v okuženih kulturah se celice dnevno pregledujejo pod mikroskopom z majhno povečavo. Številni virusi pri razmnoževanju v celicah povzročijo njihovo degeneracijo, t.j. imajo citopatogeni učinek (CPA) (slika 10.6).

riž. 10.6.

Čas razvoja in naravo citopatskih sprememb v okuženih celičnih kulturah določajo lastnosti in odmerek inokuliranega virusa ter lastnosti in pogoji gojenja celic. Nekateri virusi povzročijo CPP v prvem tednu po okužbi (koze, otroška paraliza, Coxsackie B itd.), Drugi - po 1-2 tednih. po okužbi (adenovirusi, virusi parainfluence, ECHO itd.).

Virusi povzročajo citopatske spremembe treh glavnih vrst: nastanek večjedrnih velikanskih celic in simplastov, ki so posledica zlitja citoplazme številnih celic; okrogla celična degeneracija, ki je posledica izgube medceličnih povezav in zaokroževanja celic; razvoj žarišč celične proliferacije, sestavljenih iz več plasti celic.

Med razmnoževanjem nekaterih virusov v celičnih kulturah se v citoplazmi ali jedru prizadetih celic oblikujejo intracelularni vključki. Celične kulture za odkrivanje vključkov gojimo na steklenih ploščah v epruvetah, okuženih z virusom, po določenih inkubacijskih obdobjih pa pripravimo preparate z barvanjem z običajnimi barvili.

Za detekcijo specifičnega antigena v okuženih celičnih kulturah pripravljamo pripravke na enak način kot za detekcijo vključkov z MFA.

Metoda plakov temelji na tvorbi razbarvanih območij iz degeneriranih (mrtvih) celic v enosloju z virusom okuženih celic pod agarsko prevleko. Ta območja, imenovana plaki, so virusne kolonije, ki so običajno sestavljene iz enega samega virusnega delca.

V odsotnosti citopatskih sprememb, znotrajceličnih vključkov, tvorbe plakov, negativnih reakcij hemadsorpcije in hemaglutinacije v celičnih kulturah, okuženih s preskusnim materialom, izvedemo dva zaporedna prehoda. Če teh sprememb v končnem prehodu ni, se šteje, da je rezultat izolacije virusa negativen.

Za odkrivanje virusov v kužnem materialu je mogoče uporabiti naslednje metode.

mikroskopsko:

a) viroskopija;
b) odkrivanje intracelularnih vključkov.

Imunološki:

a) imunska elektronska mikroskopija;
b) imunofluorescenca;
c) hemaglutinacija;
d) hemadsorpcija.

Identifikacija virusov se izvaja z imunološkimi metodami, vključno z naslednjimi reakcijami:

a) zaviranje hemaglutinacije;
b) zakasnitve hemadsorpcije;
c) vezava komplementa;
d) nevtralizacija;
e) obarjanje v agarskem gelu.

mikroskopske metode. S svetlobnim mikroskopom lahko zaznamo le velike viruse, večje od 150 nm. Prepoznavanje manjših virusov je možno le z elektronskim mikroskopom. Za odkrivanje velikih virusov je mogoče uporabiti svetlobno, fazno kontrastno in fluorescentno mikroskopijo.

Med virusnimi okužbami se v okuženih celicah razvijejo svojevrstni vključki. Nekatere okužbe spremlja tvorba vključkov v citoplazmi prizadetih celic (steklina, cepivo proti črnim kozam), druge - v citoplazmi in jedru (ošpice, naravne in norice, adenovirusne bolezni). Vključki imajo različno naravo, strukturo, obliko in velikost od 0,25 do 25 mikronov. Po sodobnih podatkih so vključki pri nekaterih okužbah mesto razmnoževanja virusa in predstavljajo njegove akumulacije, obdane s celičnimi substancami, pri drugih pa so produkt celične degeneracije.

Vključke je mogoče zaznati v obarvanih odtisih organov in tkiv, celičnih strganih, histoloških rezih prizadetega tkiva in pripravkih celične kulture, okuženih z virusom. Barvanje se pogosto izvaja po metodi Romanovsky-Giemsa. Za obarvanje s to metodo se pripravki fiksirajo v mešanici Dubosque - Brazil - Bouin, ki jo sestavljajo pikrinska kislina, formalin, alkohol, ocetna kislina. Znotrajcelični vključki pri večini virusnih okužb so oksifilni in se po metodi Romanovsky-Giemsa obarvajo rožnato ali lila.

Imunološke metode za diagnosticiranje virusnih okužb. V zadnjih letih so te metode postale vodilne v laboratorijski diagnostiki virusnih okužb. To je predvsem posledica ekonomskih razlogov, saj so klasične metode virološke analize precej drage. Poleg tega trajanje študij z virološkimi metodami (tedni), tudi če so precej učinkovite, jih naredi retrospektivne.

Imunološke metode se uporabljajo tako za odkrivanje virusnih antigenov v različnih biosubstratih in okoljskih predmetih kot za serodiagnostiko - odkrivanje protiteles proti virusnim antigenom v krvnih serumih bolnih ljudi in laboratorijskih živali. Poleg tega so imunološke raziskovalne metode nepogrešljive za identifikacijo virionov.

V interakciji s telesom virusi povzročijo nastanek protiteles, ki, ko se adsorbirajo na virione, preprečujejo prodiranje virionov v celice in razvoj citopatskega delovanja (CPE); nevtralizirati smrtonosni učinek virusov med njihovo reprodukcijo v piščančjih zarodkih in živalih; inaktivirajo virionske hemaglutinine in nevraminidazo, kar preprečuje reakcijo hemaglutinacije (RGA) in reakcijo hemadsorpcije (RGads) na celicah, prizadetih z virusom. Ta protitelesa, ki nevtralizirajo virus, povzročajo tudi aglutinacijo in precipitacijo virusnih delcev, nastali imunski kompleksi pa vežejo komplement. Zato se za identifikacijo virionov uporablja klasična nevtralizacijska reakcija (PH) na celičnih kulturah, piščančjih zarodkih in živalih ter njene modifikacije: reakcija inhibicije hemaglutinacije (HITA); reakcija inhibicije hemadsorpcije (RTGads). Enake reakcije se uporabljajo pri serodiagnostiki virusnih okužb za odkrivanje protiteles, ki nevtralizirajo virus, v serumu bolnikov glede na znani virusni antigen (diagnostikum).

Metoda imunoelektronske mikroskopije (IEM). Elektronska mikroskopija ima trenutno pomembno vlogo pri proučevanju virusov. Podatki elektronske mikroskopije so osnova za sodobno klasifikacijo virusov.

Nova faza v razvoju elektronske mikroskopske študije virusov je uporaba tehnik imunoelektronske mikroskopije. S to metodo ni bilo možno le neposredno odkrivanje virusov, temveč tudi njihovo identifikacijo ter hitro serotipizacijo virusnih sevov in titracijo protiteles proti njim. IEM je pridobil velik pomen za določanje lokalizacije virusnih antigenov v celicah makroorganizma.

Nedvomna prednost IEM je njegova visoka občutljivost v primerjavi s konvencionalnimi metodami elektronske mikroskopije.

Ko virusni antigen ali virusna komponenta pride v stik s homolognim antiserumom, nastane kompleks protitelo-antigen. Ta pojav je osnova tehnike, ki se uporablja za odkrivanje in identifikacijo virusnih antigenov ali protiteles proti njim. Prav te komplekse antigenov s protitelesi po negativnem barvanju lahko opazujemo v elektronskem mikroskopu. V klinični diagnostiki antigenski material ne zahteva temeljitega čiščenja. Torej, če se odkrije virus gripe, se lahko pregleda neprečiščena alantoična tekočina. Trenutno velja, da je za IEM primeren skoraj vsak klinični material. Za diagnostične namene se lahko uporabljajo navadni nefrakcionirani serumi, pa tudi serumi rekonvalescentov. Vedeti je treba, da ima razmerje med količinami antigena in protiteles velik vpliv na končne rezultate. S presežkom antigena opazimo obilo delcev; aglomeratov v tem primeru bo malo. S presežkom protiteles so virusni delci obdani z debelo plastjo, zato je skoraj nemogoče razkriti majhne strukturne podrobnosti viriona; agregatov je tudi malo. Z optimalnim razmerjem antigena in protiteles se agregati povečajo z dobro sliko detajlov virionov. Iz zgoraj navedenega je zaželeno, da se imunski serum uporablja v več razredčitvah.

Na nosilno mrežo se nanese podporna folija iz paladija. Pri uporabi nizkih koncentracij paladija in za izboljšanje adsorpcijskih lastnosti substrata se ta ojača z ogljikom. Da bi to naredili, premog razpršimo na končni suhi film-substrat na elektronsko mikroskopsko mrežo v vakuumu. Debelina filmske podlage in ojačitvene ogljikove plasti pomembno vpliva na kontrast in sliko finih detajlov predmeta. Vsak raziskovalec posebej določi specifično debelino substratnih filmov in ogljikovega sloja na podlagi dejstva, da je ogljik elektronsko bolj transparenten kot paladij.

Virusi in protitelesa proti njim imajo nizko elektronsko gostoto. Zato bioloških predmetov ni mogoče zaznati z elektronskim mikroskopom brez predhodne obdelave. Virusi se vizualizirajo s tehniko negativnega kontrasta (ali negativnega madeža). Za negativno barvanje virusov in kompleksov virus-protitelo se uporabljajo različne soli težkih kovin. Kontrastna sredstva (atomi težkih kovin) prodrejo v hidrofilna področja predmetov in v njih nadomestijo vodo. Posledično se poveča elektronska gostota predmeta in ga je mogoče opazovati v elektronskem mikroskopu.

Neposredna metoda IEM je našla največjo uporabo v praksi. Virusna suspenzija se zmeša z nerazredčenim antiserumom. Po močnem mešanju zmes inkubiramo 1 uro pri

37°C, nato čez noč pri 4°C. Naslednji dan zmes centrifugiramo, da se oborijo imunski kompleksi. Oborino resuspendiramo v kapljici destilirane vode in izpostavimo negativnemu kontrastu.

Pri vrednotenju rezultatov IEM imajo lahko produkti interakcije med antigenom in protitelesom v elektronskem mikroskopu drugačen videz (posamezen virusni delec v celoti ali delno prekrit s protitelesi; aglomerati virusnih delcev). Aglomerati lahko zasedajo različno površino, imajo drugačen videz in vsebujejo različno število delcev. Zato je treba poleg eksperimentalnih preučiti tudi kontrolne pripravke (s pufersko raztopino ali heterolognim antiserumom).

Merilo za vrednotenje rezultatov, dobljenih z uporabo IEM, je prisotnost ali odsotnost grozdov virusnih delcev, agregiranih z imunskim serumom v pripravkih. Prisotnost aglomeratov antigena in specifičnih antiserumskih protiteles je znak pozitivne reakcije. Kljub temu je treba upoštevati možnost nespecifične agregacije antigenskih delcev pod vplivom hitrega centrifugiranja. Zaradi tega mnogi avtorji priporočajo upoštevanje rezultatov na pogojni lestvici od 0 do 4+. Temelji na oceni stopnje pokritosti agregiranih delcev s serumskimi protitelesi.

Metode hemaglutinacije in hemadsorpcije. Mnogi virusi imajo sposobnost aglutinacije eritrocitov strogo določenih vrst sesalcev in ptic. Tako virusi gripe in mumpsa aglutinirajo eritrocite kokoši, morskih prašičkov in ljudi; virus klopnega encefalitisa - ovčji eritrociti; Virusi japonskega encefalitisa - eritrociti enodnevnih piščancev in gosi; adenovirusi - eritrociti podgan, miši, opic. Kot testni material v reakciji hemaglutinacije (HA) se uporabljajo alantoične, amnijske tekočine, suspenzija horionsko-alantoičnih membran piščančjih zarodkov, suspenzije in izvlečki iz kultur celic ali organov živali, okuženih z virusi. Reakcijo hemaglutinacije lahko nastavimo s kapalno metodo na steklu in v razširjeni vrsti v epruvetah ali vdolbinicah polistirenskih plošč. Prva metoda je okvirna.

Ker je specifična za skupino, RGA ne omogoča določitve vrste virusov. Identificiramo jih s testom inhibicije hemaglutinacije (HITA). Za njegovo pripravo se uporabljajo znani imunski protivirusni serumi. Vsaki razredčitvi se doda enaka količina tekočine, ki vsebuje virus. Nadzor je suspenzija virusa.

Zmes hranimo v termostatu, nato dodamo suspenzijo eritrocitov. Nekaj minut kasneje se določi titer nevtralizirajočega seruma, tj. njegovo največjo razredčitev, kar je povzročilo zakasnitev aglutinacije eritrocitov.

Pri serološki diagnostiki virusnih bolezni je priporočljivo uporabljati RTHA s parnimi serumi, od katerih enega dobimo na začetku bolezni, drugega pa po 1-2 tednih ali več. Štirikratno povečanje titra protiteles v drugem serumu potrjuje predlagano diagnozo.

Hemadsorpcijska reakcija (RGads) se uporablja za označevanje virusa s hemaglutinacijsko aktivnostjo v okuženih celičnih kulturah. Bistvo reakcije je v tem, da se eritrociti, občutljivi na hemaglutinacijsko delovanje virusov, adsorbirajo na površini celic, okuženih z virusi. Na primer, piščančji eritrociti se adsorbirajo na celicah, okuženih z virusom noric; virus ošpic - eritrociti opic; adenovirusi - opice in podgane itd.

Reakcija nevtralizacije (PH). Pri razmnoževanju v celičnih kulturah virusi povzročajo različne vrste CPD, izražene v zaokroževanju, gubanju, zmanjšanju ali, nasprotno, povečanju velikosti celic, njihovem zlitju in nastanku simplastov, uničenju citoplazme in jedra. Nazadnje, v monosloju celic, okuženih z virusi, se lahko zaradi njihovega uničenja določenih delov celične plasti pojavijo "sterilne lise" ali plaki, ki so klon virusnega delca, kar omogoča ne le izolirati virus, temveč tudi določiti njegov titer.

Zelo težko je identificirati virus glede na naravo plakov, zato se zatečejo k nastavitvi PH izoliranega virusa z znanimi serumi, ki nevtralizirajo virus. V ta namen virus, pridobljen od bolnika, akumuliramo v celični kulturi in njegove različne razredčine mešamo z nerazredčenim protivirusnim serumom.

Mešanica virusov in serumov lahko okuži piščančje zarodke ali občutljive živali. V takih primerih je nevtralizirajoča aktivnost protiteles najpogosteje določena z nevtralizacijo virusnih hemaglutininov v tekočinah zarodka in odpravo smrtonosnega učinka virusa na zarodke in živali. Hkrati se izračuna nevtralizacijski indeks, ki izraža največje število smrtnih odmerkov virusa, ki jih ta serum nevtralizira, v primerjavi z rezultati kontrolnega poskusa, vzetega kot ena.

Podobno se z uporabo PH identificirajo virusi, izolirani iz materiala bolnikov, ko okužijo piščančje zarodke in živali. Da bi to naredili, se serumom, ki nevtralizirajo virus, dodajo tekočine zarodkov, ki vsebujejo virus, in suspenzije prizadetih organov živali. Po določenem času inkubacije z mešanicami okužimo celične kulture, piščančje zarodke in živali.

Pri serodiagnostiki virusnih okužb se določi dinamika povečanja titra protiteles, ki nevtralizirajo virus za znani virus. Hkrati se PH določi s parnimi serumi, odvzetimi bolnikom na začetku in na koncu bolezni. Diagnostika bo 4-kratno povečanje titra imunoglobulinov v drugem od njih.

PH temelji na sposobnosti specifičnih protiteles, da se dovolj močno vežejo na virusni delec. Zaradi interakcije med virusom in protitelesom se infekcijska aktivnost virusa nevtralizira zaradi blokade antigenskih determinant, odgovornih za povezavo virusnega delca z občutljivimi celicami. Zaradi tega virus izgubi sposobnost razmnoževanja v občutljivem biološkem sistemu in vitro ali in vivo.

Rezultati PH postanejo očitni, ko se mešanica virusa in njegovih homolognih protiteles po časovni izpostavljenosti vnese v občutljiv biološki sistem (kultura tkivnih celic, piščančji zarodek, dovzetno živalsko telo), kjer se virus lahko razmnožuje in povzroča merljive spremembe, ki bodo ob prisotnosti protiteles delno ali popolnoma potlačene.

V PH so vključene tri komponente:

1) virus;
2) serum, ki vsebuje protitelesa;
3) biološki predmet (laboratorijske živali, razvijajoči se piščančji zarodki, tkivne kulture), katerih izbira je odvisna od vrste virusa, s katerim naj bi se izvajale raziskave.

PH se uporablja za identifikacijo izoliranega patogena ali za odkrivanje in titriranje protiteles v serumih. V prvem primeru se uporabljajo serumi posebej imuniziranih laboratorijskih živali ali ozdravljenih ljudi. V drugem primeru se uporabljajo serumi, odvzeti v začetni fazi bolezni in v obdobju okrevanja.

Protitelesa, ki nevtralizirajo virus, v serumih prebolelih ljudi, za razliko od antihemaglutininov ali protiteles, ki vežejo komplement, obstajajo več let, pri nekaterih virusnih okužbah (na primer ošpice) celo življenje. To omogoča, da v nekaterih primerih kot referenčno zdravilo uporabimo zbir serumov mnogih rekonvalescentov, ki je po polnjenju v ampule in liofilizaciji dolgo časa primeren za diagnostično delo.

Pri identifikaciji izoliranih povzročiteljev se uporabljajo vnaprej pripravljeni hiperimunski serumi različnih živali: zajci, bele podgane in miši, morski prašički, opice, ovce, konji itd. Aktivnost hiperimunskih serumov za PH je odvisna od načina imunizacije živali.

Pred začetkom vsakega nevtralizacijskega poskusa se virus predhodno titrira, pri čemer se določi končna razredčitev, ki povzroči poškodbo tkivne kulture ali okužbo laboratorijskih živali (ali piščančjih zarodkov). Titer virusa je izražen kot 50-odstotni odmerek (TCID50 - 50-odstotni infektivni odmerek za tkivno kulturo).

Molekularno genetske diagnostične metode v virološki praksi. Metode molekularne biologije so bile razvite v 50. letih. XX stoletje. Postali so mogoči zaradi dejstva, da so v genomu vsakega virusa edinstvene vrstno specifične nukleotidne sekvence, z odkrivanjem katerih je mogoče identificirati katerega koli povzročitelja okužbe. Te metode so najpomembnejše pri prepoznavanju mikroorganizmov, ki jih je dolgotrajno ali težko gojiti s konvencionalnimi metodami. V sedemdesetih letih 20. stoletja je bila detekcija s sondo DNA uporabljena za odkrivanje povzročitelja okužbe ali mutacije, ki je temeljila na hibridizaciji specifičnih oligonukleotidnih sond, označenih z radioaktivnim izotopom (ali fluorokromom), z izoliranim vzorcem DNA. Hibridizacijska analiza uporablja sposobnost nukleinskih kislin, da pod določenimi pogoji tvorijo specifične komplekse z nukleinskimi kislinami, ki imajo zaporedja, ki so jim komplementarna. Metoda odkrivanja povzročiteljev okužb s hibridizacijo DNK se je izkazala za izjemno zahtevno, dolgotrajno in drago. Poleg tega je njegova občutljivost nezadostna za identifikacijo mikroorganizmov v kliničnih materialih, kot sta blato in urin.

Hibridizacijo DNK je nadomestila metoda, ki posnema naravno replikacijo DNK in vam omogoča zaznavanje in večkratno kopiranje določenega fragmenta DNK s pomočjo termofilne DNK polimeraze. Verižna reakcija s polimerazo (PCR) je elegantna metoda, ki posnema naravno replikacijo DNK in omogoča zaznavanje in večkratno kopiranje določenega dela DNK s termofilno DNK polimerazo.

Zaradi svojih visokih diagnostičnih lastnosti je PCR splošno priznan dodatek tradicionalnim metodam, ki se uporabljajo v virologiji: razmnoževanje virusa v celični kulturi, imunološko odkrivanje virusnih antigenov in elektronska mikroskopija. Bistvena prednost te metode je možnost odkrivanja virusov pri latentnih okužbah (citomegalovirus, virus herpesa) in virusov, ki jih je težko ali še ni mogoče gojiti (virus humane imunske pomanjkljivosti, Epstein-Barr virus, humani papiloma virus, virus hepatitisa Vidr). Obeti za preučevanje bolezni, kot so Creutzfeldt-Jakobova bolezen, Alzheimerjeva bolezen in multipla skleroza, so povezane z metodo PCR.