التلطخ المناعي (Immunoblot) هو طريقة مرجعية عالية التحديد وحساسة للغاية تؤكد التشخيص للمرضى الذين لديهم نتائج اختبار إيجابية أو غير محددة تم الحصول عليها بما في ذلك. باستخدام RIGA أو ELISA. التجلط المناعي هو نوع من المقايسة المناعية غير المتجانسة.
تعتمد طريقة الكشف عن الأجسام المضادة لمولدات المضادات الممرضة الفردية على ELISA على أغشية النيتروسليلوز ، حيث يتم تطبيق بروتينات معينة في شكل نطاقات منفصلة ، مفصولة بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام. إذا كانت هناك أجسام مضادة ضد مستضدات معينة ، فسيظهر خط غامق في موضع الشريط المقابل. يكمن تفرد اللطخة المناعية في محتواها العالي من المعلومات وموثوقية النتائج التي تم الحصول عليها.
مادة الدراسة هي مصل بشري أو بلازما. للبحث على شريط واحد ، مطلوب 1.5-2 مل من الدم أو 15-25 ميكرولتر من المصل.
تستخدم شركة "التشخيص المختبري" LLC "أدوات التنقيب المناعي" للكشف عن الأجسام المضادة لمسببات الأمراض لمختلف الأمراض من شركة "EUROIMMUN" (ألمانيا) ، "MIKROGEN" (ألمانيا):
HSV 1 و HSV 2 IgM / IgG(عدوى فيروس الهربس)
CMV IgM / IgG(عدوى الفيروس المضخم للخلايا)
الحصبة الألمانية IgG
الملف الشخصي TORCH IgM(داء المقوسات والحصبة الألمانية والفيروس المضخم للخلايا و HSV 1 و HSV 2)
EBV IgMTIgG(عدوى فيروس ابشتاين بار)
HCV مفتش(التهاب الكبد الفيروسي سي)
هناك نوعان من الأطقم - لطخة غربية وخط لطخة.
لطخة غربية:تحتوي المجموعات على شرائط غشاء اختبار مع مستضدات أصلية منفصلة كهربائياً للعوامل المعدية المعنية ، أي المستضدات مرتبة حسب الوزن الجزيئي. يمكن أيضًا تطبيق 1-2 سطرين إضافيين مع مستضدات مهمة سريريًا (لطخة الخط الغربي) على الأغشية. إنها طريقة تأكيدية موثوقة ، تقضي على الإيجابيات الزائفة وردود الفعل المتصالبة.
لطخة الخط:في هذه الحالة ، يتم تطبيق المستضدات المهمة سريريًا فقط (الأصلية أو الاصطناعية أو المؤتلفة) على شرائط الاختبار بترتيب معين. يستخدم هذا الأسلوب في التشخيص التفريقي لعدة عدوى في شريط واحد.
يكمن جوهرها في نقل جزيئات مادة الاختبار من مادة حاملة صلبة تستخدم لتجزئة البوليمرات الحيوية إلى أخرى ، حيث يتم اكتشافها على وجه التحديد باستخدام تفاعل كيميائي مناعي. طريقة حديثة عالية الحساسية هي تحديد البروتينات ، بما في ذلك المستضدات الفيروسية. تعتمد الطريقة على مزيج من الرحلان الكهربائي للهلام وتفاعل الجسم المضاد للمستضد. يتم تحقيق درجة عالية من الدقة بسبب الفصل الكهربي للبروتينات والبروتينات السكرية والبروتينات الدهنية والحد الأقصى لخصوصية الكشف عن الأجسام المضادة المناعية أو الأجسام المضادة وحيدة النسيلة. في ظل الظروف المثلى ، يمكن للتخثر المناعي اكتشاف المستضد بكميات أقل من 1 نانوغرام في حجم الاختبار. من الناحية الفنية ، يتم إجراء التخثر المناعي في ثلاث خطوات:
1) تخضع البروتينات المراد تحليلها للفصل في هلام بولي أكريلاميد في وجود مواد تغيير طبيعة: كبريتات دوديسيل الصوديوم أو اليوريا ، وغالبًا ما يشار إلى هذه العملية باسم SDS-PAGE ؛ يمكن تصور البروتينات المنفصلة بعد التلوين ومقارنتها مع العينات المرجعية ؛
2) يتم نقل البروتينات المنفصلة من الجل عن طريق التراكب (النشاف)
مرشح النيتروسليلوز ومثبت عليه ؛ في كثير من الحالات ، ولكن
ليس دائمًا ، أثناء النقل ، يتم الحفاظ على النسب الكمية للبروتينات ؛
3) المرشحات مطلية بالكشف عن البولي أو وحيدة النسيلة
الأجسام المضادة التي تحتوي على نظائر مشعة أو ملصق إنزيم ؛ ل
الكشف عن الأجسام المضادة المرتبطة ، كما يستخدم تحليل الأنواع المضادة
المصل المسمى ، وبعبارة أخرى ، في المرحلة النهائية ، النشاف
على غرار المقايسات المناعية الصلبة.
يجب أن يؤخذ في الاعتبار أنه في هذا الوضع من التجلط المناعي ، تكون البروتينات في حالة تغيير طبيعة ، وبالتالي قد لا يتم التعرف عليها بواسطة الأجسام المضادة الخاصة بالبروتين الأصلي ، ولكن في وجود الأمصال لجميع الببتيدات المكونة ، المستضد بأكمله تم الكشف عن طيف البروتين المختبَر في وقت واحد. يستخدم التجلط المناعي على نطاق واسع في دراسات بنية فيروسات التهاب الكبد ، على وجه الخصوص ، لإثبات العلاقة المستضدية بين السلالات الفردية. تجعل الدقة العالية للتخثر المناعي من الممكن الحصول على نتائج جيدة في الممارسة التشخيصية ، عندما يكون ذلك مطلوبًا لتحديد الفيروس في أنسجة أو إفرازات المريض.
اعتمادًا على مادة الاختبار ، يتم تمييز الحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتين - النشاف.
يمكن إجراء الكشف الكيميائي المناعي للمستضدات باستخدام أجسام مضادة مقترنة بملصق. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام إما النظائر المشعة أو الإنزيمات (البيروكسيداز ، الفوسفاتيز القلوي ، اللاكتاماز ، إلخ) على نطاق واسع كملصق.
وقت النشاف بالانتشار هو 36-48 ساعة ، ولكن الطريقة الأسرع والأكثر فاعلية لنقل البروتينات من المواد الهلامية هي التجلط الكهربائي ، والذي يكون عادة من 1-3 ساعات لبعض البروتينات عالية الوزن الجزيئي لأكثر من 12 ساعة.
يعتمد الاختيار المحدد للمواد الماصة من أجل التعديلات المختلفة للبقع (النيتروسليلوز أو الورق المعالج وفقًا لذلك) ، واختيار شروط الحجب والكشف الكيميائي المناعي للمستضدات تمامًا على المستضد ، وكميته ، وطريقة المقايسة المناعية ، وأهداف الدراسة.
تتيح القدرة على اكتشاف الأجسام المضادة لمستضدات مسببات الأمراض المحددة تقييم أهمية هذه الأجسام المضادة (خصوصية عامل مسبب للمرض) ، لاستبعاد تفاعل لمولدات المضادات المتقاطعة. هذا هو ما يميز التجلط المناعي عن ELISA ، حيث يمكن استخدام مجموعات مختلفة من محددات المستضدات كمستضد - سواء كان محددًا أم لا ، مما يعطي تفاعلات متصالبة مع مسببات الأمراض الأخرى. خلاف ذلك ، عندما يتم الحصول على نتيجة ELISA إيجابية ، يمكن للمرء أن يفترض فقط أنها نتيجة تفاعل متقاطع ، وفي حالة التجلط المناعي ، يكون هذا أمرًا حاسمًا.
أصبحت طريقة IB ، لعدد من الأسباب ، هي الأكثر استخدامًا كوسيلة مناسبة للاستخدام كاختبار تأكيد.
الميزة غير المشكوك فيها لهذه الطريقة هي إمكانية اختبار الأجسام المضادة لمولدات المضادات الضعيفة أو غير القابلة للذوبان تمامًا واستبعاد مرحلة إدخال ملصق إشعاعي في المستضدات.
يتم الحكم على الحساسية في حالة الـ IB من خلال الحد من كمية المستضد المترسبة على الهلام ، والتي ، عند تجزئة البروتينات ، يمكن اكتشافها مناعيًا بعد الانتقال من الهلام إلى الطور الصلب (النيتروسليلوز). تعتمد الحساسية الكلية للمقايسة على عدد من العوامل: شروط تجزئة وتثبيت مولد الضد على مادة حاملة صلبة ، ومستوى الخلفية ، ونوعية الأجسام المضادة وانجذابها. يعد نوع الملصق المستخدم وكيفية اكتشافه أمرًا مهمًا.
وهكذا ، فإن طريقة التكتل المناعي تجعل من الممكن تحديد مناطق مولد الضد على الطور الصلب دون ربط البروتين بأكمله بأجسام مضادة مصلية معينة. يتم استخدام التخثر المناعي وتعديلاته بشكل أساسي في كتابة المستضدات والأجسام المضادة البكتيرية والفيروسية ، خاصة في حالة عدم كفاية الدقة للأنظمة التقليدية ، وكذلك في تحليل الغلوبولين المناعي ، والأحماض النووية ، أو كاختبار تأكيد بالاشتراك مع طرق أخرى.
صعوبة كبيرة في تفسير نتائج التفاعلات المتصالبة وفي حالات المراحل الأولية من الانقلاب المصلي. في الحالة الأولى ، عند إعادة فحصها بعد فترة زمنية معينة ، لا يتم الكشف عن الأجسام المضادة ، وفي اللطخة المناعية الثانية ، تظهر نطاقات جديدة ، تشير إلى ظهور أجسام مضادة لبروتينات فيروس نقص المناعة البشرية أو البروتينات السكرية ، والتي تميز ديناميكيات الاستجابة للاستجابة المناعية لفيروسات المستضدات.
إنها في الواقع طريقة التحقق النهائية في سلسلة الاختبارات المصلية ، مما يسمح بالتوصل إلى استنتاج نهائي حول إيجابية المريض لفيروس نقص المناعة البشرية أو رفضه. لضبط IB ، يتم استخدام شرائط النيتروسليلوز ، والتي يتم نقل بروتينات فيروس نقص المناعة البشرية إليها مسبقًا بطريقة الرحلان المناعي الأفقي ثم الرأسي بترتيب زيادة أوزانها الجزيئية. تتفاعل الأجسام المضادة في الأمصال المختبرة مع البروتينات في مناطق معينة من الشريط. لا يختلف المسار الإضافي للتفاعل عن ذلك الخاص بـ ELISA ، أي أنه يتضمن معالجة شريط (شريط) مع مادة مقترنة وركيزة كروموجين ، وغسل المكونات غير المرتبطة وإيقاف التفاعل بالماء المقطر. يتيح الفصل الكهربي الأولي للبروتينات وتثبيتها على النيتروسليلوز تحديد الأجسام المضادة لبروتينات معينة وفقًا لوجود (أو عدم وجود) تلطيخ (أزرق رمادي) للمناطق المقابلة للشريط. لا يمكن استخدام التكتل المناعي في دراسة فحص شامل بسبب تكلفته العالية وهو طريقة للمراجحة الفردية في المرحلة النهائية من الدراسة المصلية.
هناك علاقة واضحة إلى حد ما بين نتائج دراسة الأمصال في IB و ELISA. ثم يتم تفسير الأمصال الإيجابية مرتين في ELISA (في أنظمة اختبار مختلفة) في IB على أنها إيجابية لفيروس نقص المناعة البشرية في 97-98٪ من الحالات. الأمصال الإيجابية في ELISA في واحد فقط من نظامي الاختبار المستخدمين تبين أنها إيجابية لفيروس نقص المناعة البشرية في IB ليس في كثير من الأحيان أكثر من 4 ٪ من الحالات. عند إجراء دراسات تأكيدية ، يمكن لحوالي 5٪ من الـ IB إعطاء ما يسمى بنتائج "غير محددة" ، والتي ، كقاعدة عامة ، تتوافق مع ELISA الإيجابي ، ولكن ليس RIP. في حوالي 20٪ من الحالات ، تتسبب الأجسام المضادة لبروتينات هفوة HIV-1 (p55، p25، p18) في حدوث الـ IBs "غير المحددة". عند الحصول على نتائج مشكوك فيها للتخثر المناعي ، من الضروري تكرار الدراسة بعد 3 أشهر ، وإذا استمر عدم اليقين في النتيجة ، بعد 6 أشهر.
طريقة المناعة الراديوية (RIM) (التحليل المناعي الإشعاعي ، RIA)المقايسة المناعية المشعة هي طريقة للتحديد الكمي للمواد النشطة بيولوجيًا (الهرمونات ، والإنزيمات ، والأدوية ، وما إلى ذلك) في السوائل البيولوجية ، بناءً على الارتباط التنافسي للمواد الثابتة والمتشابهة المرغوبة الموصوفة بنويدة مشعة مع أنظمة ربط محددة. غالبًا ما تكون الأخيرة أجسامًا مضادة محددة. نظرًا لحقيقة أن المستضد المسمى يضاف بكمية معينة ، فمن الممكن تحديد جزء المادة المرتبط بالأجسام المضادة ، والجزء الذي يظل غير مرتبط نتيجة للتنافس مع المستضد غير المحدد الذي يتم اكتشافه. يتم إجراء الدراسة في المختبر. بالنسبة لـ R. و. إنتاج مجموعات قياسية من الكواشف ، كل منها مصمم لتحديد تركيز أي مادة واحدة. يتم إجراء الدراسة على عدة مراحل: يتم خلط المادة البيولوجية مع الكواشف ، ويتم تحضين الخليط لعدة ساعات ، ويتم فصل المادة المشعة الحرة والمربوطة ، ويتم إجراء القياس الإشعاعي للعينات ، ويتم احتساب النتائج. الطريقة حساسة للغاية ، يمكن استخدامها في تشخيص أمراض القلب والأوعية الدموية والغدد الصماء والأنظمة الأخرى ، لتحديد أسباب العقم واضطرابات النمو الجنيني ، في علم الأورام لتحديد دلالات الورم ومراقبة فعالية العلاج ، لتحديد تركيز الغلوبولين المناعي والإنزيمات والمواد الطبية. في بعض الحالات ، يتم إجراء الدراسات على خلفية اختبارات التحميل الوظيفي (على سبيل المثال ، تحديد محتوى الأنسولين في مصل الدم على خلفية اختبار تحمل الجلوكوز) أو في الديناميكيات (على سبيل المثال ، تحديد الهرمونات الجنسية في الدم أثناء دورة الطمث).
بمساعدة مجموعة أدوات تجارية من ABBOTT - Austria II-I 125 ، يمكن اكتشاف HBsAg بتركيزات تصل إلى 0.1 نانوغرام / مل. تشمل مزايا الطريقة إمكانية توحيد وأتمتة الطريقة مع الحصول على إجابات من الناحية العددية. عيب الطريقة هو القيود التي تحددها طريقة التشغيل مع المواد المشعة ، والعمر الافتراضي القصير نسبيًا لمجموعة التشخيص ، والذي يرتبط بتحلل الملصق المشع.
يتم إنتاج مجموعات التشخيص للكشف عن المستضدات المختلفة لفيروسات التهاب الكبد A و B و D والأجسام المضادة لها بواسطة Isotope (طشقند) وبعض الشركات الأجنبية (على سبيل المثال ، ABBOTT). تُستخدم خرزات البوليسترين (ABBOTT) أو أنابيب الاختبار (النظائر المشعة) كمرحلة صلبة. النظير الأكثر استخدامًا لوصف الأجسام المضادة أو المستضدات هو I 125 ، والذي يبلغ نصف عمر 60 يومًا ونشاط إشعاعي محدد عالي. يتم قياس العلامة المشعة ، أي الإشعاع ، على عدادات خاصة - أجهزة قياس الطيف الراديوي. يتم حساب النبضات المشعة في كل من عينات التحكم وعينات الاختبار في وقت ثابت واحد ، عادة في غضون دقيقة واحدة. عند تحليل نتائج التفاعل ، من الضروري مراعاة وجود خلفية النشاط الإشعاعي ، والتي يمكن أن تؤثر على النتيجة النهائية للتفاعل. قد تكون أسباب الخلفية المتزايدة: تلوث حاوية العينة أو العش ؛ الإعداد غير الصحيح للجهاز ؛ وجود مصدر إشعاع قوي بالقرب من الجهاز.
لتأكيد النتيجة الإيجابية التي تم الحصول عليها من الفحص الأولي للعينات ، يوصى بإجراء اختبار RIA أو اختبار بديل. إذا تم اكتشاف HBsAg ، فيجب إجراء اختبار تأكيد.
الجدول 1. تصنيف اللقاحات
فهرس:
إلزامي:
1. Khaitov R.M. ، Ignatieva GA ، Sidorovich I.G. علم المناعة: كتاب مدرسي. - م: الطب ، 2000. - 432 ص: إلينوي (دراسة الأدب لطلاب الطب).
2. Kovalchuk L.V. وآخرون علم المناعة: ورشة عمل: كتاب مدرسي. البدل - M: GEOTAR-Media ، 2012. - 176 ص.
3. Pozdeev O.K. علم الأحياء الدقيقة الطبية / إد. أكاد. RAMS V. بوكروفسكي - م: GEOTAR-Media ، 2001. - 768 ص.
4. بوريسوف إل. دليل للتمارين العملية في علم الأحياء الدقيقة. م 1997
إضافي:
1. جينكل بي إيه ، علم الأحياء الدقيقة مع أساسيات علم الفيروسات. م ، 1974
2. Korotyaev A.I.، Babichev S.A. علم الأحياء الدقيقة الطبية والمناعة وعلم الفيروسات: كتاب مدرسي للعسل. الجامعات - الطبعة الثالثة ، مصححة. وإضافية - سان بطرسبرج ، سبيتسليت. 2002. - 591 ص.
3. Borisov L.B. ، سميرنوفا A.M. ، علم الأحياء الدقيقة الطبية ، علم الفيروسات ، علم المناعة ، M. ، الطب. 1994
4. Timakov V.D. ، Levashov V.S. ، Borisov L.B. علم الاحياء المجهري. م 1983
النشاف المناعي (لطخة مناعية ، لطخة ويسترن ، لطخة غربية)- يجمع بين مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) مع النقل الكهربي الأولي لمولدات المضادات الفيروسية إلى شريط نيتروسليلوز (شريط).
في هذا الاسم العلمي الجميل ، يُترجم "لطخة" على الأرجح إلى "لطخة" ، ويعكس "غربي" على أنه "غربي" اتجاه توزيع هذه "البقعة" على الورق من اليسار إلى اليمين ، أي على خريطة جغرافية ، هذا يتوافق مع الاتجاه من الغرب إلى الشرق. ". يتمثل جوهر طريقة "لطخة المناعة" في أن تفاعل الإنزيم المناعي لا يتم بمزيج من المستضدات ، ولكن مع مستضدات فيروس العوز المناعي البشري ، التي تم توزيعها مسبقًا عن طريق الرحلان المناعي إلى كسور تقع وفقًا للوزن الجزيئي على سطح غشاء النيتروسليلوز. نتيجة لذلك ، يتم توزيع البروتينات الرئيسية لفيروس نقص المناعة البشرية ، وهي ناقلات لمحددات المستضدات ، على السطح في شكل نطاقات منفصلة تظهر أثناء المقايسة المناعية للإنزيم.
تشمل اللطخة المناعية عدة مراحل:
تحضير الشريط.يخضع فيروس نقص المناعة (HIV) ، الذي تم تنقيته وتدمير مكوناته سابقًا ، للرحلان الكهربي ، بينما يتم فصل المستضدات التي يتكون منها فيروس نقص المناعة البشرية عن طريق الوزن الجزيئي. ثم ، عن طريق النشاف (وهو مشابه لإخراج الحبر الزائد على "النشاف") ، يتم نقل المستضدات إلى شريط من النيتروسليلوز ، والذي يحتوي الآن على مجموعة من العصابات المستضدية المميزة لفيروس نقص المناعة البشرية ، غير المرئية للعين.
دراسة العينة.يتم تطبيق مادة الاختبار (مصل الدم ، بلازما دم المريض ، إلخ) على شريط النيتروسليلوز ، وإذا كانت هناك أجسام مضادة محددة في العينة ، فإنها ترتبط بنطاقات المستضدات المقابلة (التكميلية) بدقة. نتيجة للتلاعب اللاحق ، يتم تصور نتيجة هذا التفاعل - جعلها مرئية.
تفسير النتيجة.يؤكد وجود العصابات في مناطق معينة من صفيحة النيتروسليلوز وجود الأجسام المضادة في المصل المدروس لمستضدات فيروس نقص المناعة البشرية المحددة بدقة.
الممر أ - التحكم الإيجابي
الممر ب - ضعف التحكم الإيجابي
حارة ج - التحكم السلبي
الشريط D - العينة الإيجابية (تم اكتشاف الأجسام المضادة لـ HIV-1)
في الوقت الحالي ، يعتبر النشاف المناعي (الططمة المناعية) هو الطريقة الرئيسية لتأكيد وجود الأجسام المضادة الخاصة بالفيروس في مصل الاختبار. في بعض حالات عدوى فيروس العوز المناعي البشري ، قبل الانقلاب المصلي ، يتم الكشف عن أجسام مضادة محددة بشكل أكثر فعالية عن طريق التخمير المناعي مقارنةً بـ ELISA. كشفت دراسة النشاف المناعي أن الأجسام المضادة لـ gp 41 يتم اكتشافها غالبًا في مصل مرضى الإيدز ، ويتطلب اكتشاف p24 في الأشخاص الذين تم فحصهم لأغراض وقائية دراسات إضافية لوجود عدوى فيروس نقص المناعة البشرية. أثبتت أنظمة اختبار اللطخة المناعية القائمة على البروتينات المؤتلفة المعدلة وراثيًا أنها أكثر تحديدًا من الأنظمة التقليدية القائمة على محللة الفيروس المنقى. عند استخدام مستضد مؤتلف ، لا يتم تشكيل نطاق ضيق محدد بوضوح من المستضد ، وليس منتشرًا ، ويمكن الوصول إليه بسهولة من أجل المحاسبة والتقييم.
مصل الأشخاص المصابين بفيروس HIV-1 ، يكتشف الأجسام المضادة للبروتينات الرئيسية والبروتينات السكرية التالية - بروتينات الغلاف الهيكلي (env) - gp160 ، gp120 ، gp41 ؛ النواة (gag) - p17 ، p24 ، p55 ، وكذلك إنزيمات الفيروس (pol) - p31 ، p51 ، p66. بالنسبة لفيروس HIV-2 ، تكون الأجسام المضادة التي يجب أن تحل محلها نموذجية - gp140 ، gp105 ، gp36 ؛ هفوة - ص 16 ، ص 25 ، ص 56 ؛ بول ص 68.
من بين الطرق المختبرية اللازمة لتحديد خصوصية التفاعل ، فإن اكتشاف الأجسام المضادة لبروتينات غلاف HIV-1 - gp41 و gp120 و gp160 و HIV-2 - يتمتع gp36 و gp105 و gp140 بأكبر قدر من الاعتراف.
تعتبر منظمة الصحة العالمية أن الأمصال إيجابية إذا تم الكشف عن الأجسام المضادة لأي نوعين من البروتينات السكرية لفيروس نقص المناعة البشرية عن طريق التخمير المناعي. وفقًا لهذه التوصيات ، إذا كان هناك تفاعل مع بروتين واحد فقط من بروتينات الغلاف (rp 160 ، rp 120 ، rp 41) في تركيبة أو بدون تفاعل مع بروتينات أخرى ، فإن النتيجة تعتبر مشكوك فيها ويوصى بإجراء اختبار ثانٍ باستخدام مجموعة من سلسلة أخرى أو من شركة أخرى. إذا بقيت النتيجة مشكوك فيها بعد ذلك ، يوصى بالملاحظة لمدة 6 أشهر (البحث بعد 3 أشهر).
قد يشير وجود تفاعل إيجابي مع مستضد p24 إلى فترة من الانقلاب المصلي ، حيث تظهر الأجسام المضادة لهذا البروتين أولاً في بعض الأحيان. في هذه الحالة ، يوصى ، اعتمادًا على البيانات السريرية والوبائية ، بتكرار الدراسة بعينة مصل تؤخذ بعد أسبوعين على الأقل ، وهذا هو الحال تمامًا عندما تكون الأمصال المزدوجة ضرورية في الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية.
قد تعكس التفاعلات الإيجابية مع بروتينات gag و pol بدون وجود تفاعل مع بروتينات env مرحلة الانقلاب المصلي المبكر ، وقد تشير أيضًا إلى إصابة HIV-2 أو تفاعل غير محدد. يتم إعادة فحص الأفراد الذين لديهم مثل هذه النتائج بعد اختبار HIV-2 بعد 3 أشهر (في غضون 6 أشهر).
وصف
طريقة التحديدلطخة مناعية.
المواد قيد الدراسةمصل
زيارة منزلية متاحة
الأجسام المضادة للنواة هي عائلة من الأجسام المضادة الذاتية التي ترتبط بالأحماض النووية الريبية والبروتينات المرتبطة بها. تحدث في أكثر من 90 ٪ من المرضى الذين يعانون من أمراض النسيج الضام المنتشر ، وغالبًا ما يتم ملاحظتها أيضًا في أمراض الكبد المناعية الذاتية وعدد من الحالات الأخرى. حتى الآن ، تم تمييز حوالي 200 نوع من هذه العائلة من الأجسام المضادة ، ولكن لا يمكن استخدام جميعها في الممارسة السريرية.
تسمح اللطخة المناعية للأجسام المضادة للنواة بدراسة 15 نوعًا رئيسيًا من الأجسام المضادة للنواة في وقت واحد في اختبار واحد ، مما يضمن التشخيص التفريقي للأمراض الروماتيزمية الجهازية الرئيسية. عادة ما يتم ملاحظة كل نوع من أنواع الأجسام المضادة الذاتية التي يتم اكتشافها بواسطة طخة مناعية في المرضى الذين يعانون من صورة سريرية مميزة ، وبالتالي فإن طيف الأجسام المضادة الذاتية لا يسمح فقط بتشخيص المرض ، ولكن أيضًا لتحديد خطر الإصابة ببعض المظاهر السريرية.
يُنصح باستخدام لطخة مناعية من الأجسام المضادة للنواة في المرحلة الثانية من الفحص المصلي مع نتيجة إيجابية للاختبارات الأخرى التي تشير إلى وجود أجسام مضادة للنواة في مصل المريض. تتضمن هذه الاختبارات تحديد الأجسام المضادة للنواة (فحص ELISA) ، واكتشاف العامل المضاد للنواة (ANF) على خلايا Hep2 () ، والأجسام المضادة للنواة والأجسام المضادة للمستضد النووي القابل للاستخراج (ENA ،).
تتميز طريقة اللطخة المناعية للأجسام المضادة للنواة في تشخيص الأمراض الروماتيزمية الجهازية بخصوصية سريرية عالية. لكن خصوصية الأجسام المضادة للنواة ، حتى عند التتر العالي من ANF () ، ليس من الممكن دائمًا إثباتها ، نظرًا لأن عددًا من مستضدات الأجسام المضادة للنواة لا يزال غير معهود. النتيجة السلبية للطمة المناعية في هذه الحالة لا تستبعد تشخيص الأمراض الروماتيزمية الجهازية. يمكن الكشف عن عدد من الأجسام المضادة للنواة باستخدام لطخة مناعية - لوحة من الأجسام المضادة الخاصة بالتهاب العضلات () ولطخة مناعية - وهي لوحة من الأجسام المضادة الذاتية في تصلب الجلد ().
الأدب
- Lapin S.V. توتوليان أ. التشخيص المخبري المناعي لأمراض المناعة الذاتية / دار النشر "شيلوفيك" ، سان بطرسبرج - 2010. 272 ص.
- Nasonov E.L. ، ألكساندروفا E.N. المعايير الحديثة للتشخيص المخبري للأمراض الروماتيزمية. المبادئ التوجيهية السريرية / BHM ، M - 2006.
- كونراد ك ، شلوسلر دبليو ، هيبي ف ، فيتزلر إم جيه. الأجسام المضادة في أمراض المناعة الذاتية الخاصة بالأعضاء: مرجع تشخيصي / PABST ، دريسدن - 2011. 300 ص.
- كونراد ك ، شلوسلر دبليو ، هيبي ف ، فيتزلر إم جيه. الأجسام المضادة في أمراض المناعة الذاتية الجهازية: مرجع تشخيصي / PABST ، دريسدن - 2007. 300 ص.
- غيرشفين إم إي ، ميروني بل ، شوينفيلد ي.
- Shoenfeld Y.، Cervera R، Gershvin ME معايير التشخيص في أمراض المناعة الذاتية / هيومانا برس - 2008. 598 ص.
- تعليمات مجموعة الكاشف.
تحضير
يفضل الصمود 4 ساعات بعد الوجبة الأخيرة ، ولا توجد متطلبات إلزامية.
مؤشرات للتعيين
يشار إلى الاختبار للتشخيص والتشخيص التفريقي للحالات التالية:
- الذئبة الحمامية الجهازية؛
- الذئبة الجلدية تحت الحاد وأنواع أخرى من الذئبة الجلدية.
- مرض النسيج الضام المختلط
- متلازمة سجوجرن والأمراض المرتبطة بها ؛
- تصلب الجلد المنتشر والموضعي ، متلازمة كريست ؛
- اعتلال عضلي التهابي (التهاب العضلات والتهاب الجلد والعضلات) ؛
- التهاب المفاصل المزمن الشبابي.
- التهاب الكبد المناعي الذاتي.
- تليف الكبد الصفراوي الأولي والتهاب الأقنية الصفراوية المصلب ؛
- يشار إلى استخدام هذا الاختبار للكشف عن التتر العالي من العامل المضاد للنواة ، والأجسام المضادة للنواة ، والأجسام المضادة لمستضد نووي قابل للاستخراج ، والأجسام المضادة للحمض النووي ، والأجسام المضادة للنيوكليوزومات ، والأجسام المضادة للفوسفوليبيد.
تفسير النتائج
يحتوي تفسير نتائج الاختبار على معلومات للطبيب المعالج وليس تشخيصًا. لا ينبغي استخدام المعلومات الواردة في هذا القسم للتشخيص الذاتي أو العلاج الذاتي. يتم إجراء تشخيص دقيق من قبل الطبيب ، باستخدام كل من نتائج هذا الفحص والمعلومات الضرورية من مصادر أخرى: التاريخ ، ونتائج الفحوصات الأخرى ، وما إلى ذلك.
وحدات القياس: اختبار نوعي ، يتم عرض النتيجة على شكل "مكتشف" أو "غير موجود".
عندما يتم الكشف عن شريط يميز وجود أي نوع من الأجسام المضادة ، يتم وصف كثافة لون النطاق بالإضافة إلى ذلك من خلال عدد الإيجابيات ("التقاطعات") لكل نوع من أنواع الأجسام المضادة المحددة. تعكس الزيادة في درجة الإيجابية بشكل غير مباشر محتوى وتقارب الأجسام المضادة الذاتية.
القيم المرجعية: الأجسام المضادة لـ Sm و RNP / Sm و SS-A (60 كيلو دالتون) و SS-A (52 كيلو دالتون) و SS-B و Scl-70 و PM-Scl و PCNA و CENP-B و dsDNA و Histone و Nucleosome لم يتم العثور على Rib P و AMA-M2 و Jo-1.
يتم عرض نتيجة تحديد الأجسام المضادة الذاتية في "تقاطعات" لكل مستضد مطابق. تعكس الزيادة في درجة الإيجابية المصلية بشكل غير مباشر محتوى وتقارب الأجسام المضادة الذاتية. خيارات درجة الإيجابية المصلية مذكورة أدناه:
- لم يتم العثور على الأجسام المضادة.
- +/- - نتيجة حدية ؛
- + - محتوى منخفض من الأجسام المضادة لمستضد معين ؛
- ++ هو متوسط محتوى الأجسام المضادة لمستضد معين ؛
- +++ - نسبة عالية من الأجسام المضادة لمستضد معين.
الأمراض الرئيسية المرتبطة باكتشاف الأجسام المضادة للنواة:
| مولد المضاد | معنى |
| سم (سميث) | علامة محددة للذئبة الحمامية الجهازية (المدرجة في المعيار العاشر لمرض الذئبة الحمراء للكلية الأمريكية لأمراض الروماتيزم ، ACR) |
| SS-A (Ro52) | لوحظ في العديد من أمراض المناعة الذاتية ، في كثير من الأحيان في الذئبة الحمامية الجهازية وأشكالها الجلدية ، وأمراض الروماتيزم الجهازية ، والتهاب المفاصل الروماتويدي ، وأمراض الكبد المناعية الذاتية ، إلخ. |
| SS-A (Ro60) | الذئبة الحمامية الجهازية ، الذئبة الحمامية الجلدية ، حساسية للضوء في الذئبة الحمامية الجهازية ، مخاطر عالية من الذئبة الحمامية الخلقية وأمراض قلب الجنين. المؤشر المصلي الرئيسي في متلازمة سجوجرن. غالبًا ما يتم ملاحظته مع الأجسام المضادة لمستضد SS-A (Ro52). |
| SS-B | متلازمة سجوجرن ، الذئبة الحمامية الجهازية. |
| PCNA | الذئبة الحمامية الجهازية ، خطر الإصابة بالتهاب الكلية الذئبي. |
| الريبوسومات (Ribo P) | الذئبة الحمامية الجهازية ، خطر تلف الجهاز العصبي المركزي. |
| النيوكليوسومات | الذئبة الحمامية الجهازية ، خطورة عالية للإصابة بالتهاب كبيبات الكلى الذئبي. |
| مزدوج DNA تقطعت بهم السبل | علامة محددة من الذئبة الحمامية الجهازية (المدرجة في المعيار العاشر من SLE ACR) ، ارتفاع خطر الإصابة بالتهاب الكلية الذئبي. |
| snRNP / Sm | مرض النسيج الضام المختلط ، الذئبة الحمامية الجهازية مع انخفاض مخاطر تلف الكلى ، تصلب الجلد. |
| الهستونات | الذئبة الحمامية الجهازية ، الذئبة التي يسببها الدواء ، تصلب الجلد. |
| Scl-70 | التصلب الجهازي مع آفات منتشرة في الجلد والأعضاء الداخلية. |
| PM-Scl | تصلب الجلد مع التهاب العضلات. |
| CENP-B | متلازمة كرست مع تصلب الأصابع ، توسع الشعيرات ، تكلسات تحت الجلد ، متلازمة رينود ، التهاب المريء. |
| جو -1 | التهاب العضلات في شكل متلازمة أنتيزينثيتاز. |
| AMA-M2 | تليف الكبد الصفراوي الأولي ، متلازمة سجوجرن. |
في روسيا ، في الوقت الحاضر ، الإجراء القياسي للتشخيص المختبري لعدوى فيروس نقص المناعة البشرية هو الكشف عن الأجسام المضادة لفيروس نقص المناعة البشريةباستخدام المقايسة المناعية الإنزيميةمتبوعًا بتأكيد خصوصيتها في التفاعل النشاف المناعي.
تظهر الأجسام المضادة لفيروس نقص المناعة البشرية في 90-95٪ من المصابين في غضون 3 أشهر بعد الإصابة ، وفي 5-9٪ - بعد 6 أشهر من لحظة الإصابة ، وفي 0.5-1٪ - في وقت لاحق. أقرب وقت للكشف عن الأجسام المضادة هو أسبوعين من لحظة الإصابة.
يتضمن اكتشاف الأجسام المضادة لفيروس نقص المناعة البشرية خطوتين. في المرحلة الأولىيتم إجراء الكشف عن الطيف الكلي للأجسام المضادة ضد مستضدات فيروس نقص المناعة البشرية باستخدام اختبارات مختلفة: المقايسة المناعية الإنزيمية ، التراص ، المركب ، المشط ، مرشح الغشاء أو الغشاء المنتشر. في المرحلة الثانيةيستخدم التجلط المناعي لتحديد الأجسام المضادة للبروتينات الفردية للفيروس. في العمل ، يُسمح باستخدام أنظمة الاختبار التي لديها إذن للاستخدام من قبل وزارة الصحة في الاتحاد الروسي. يجب تنفيذ إجراءات التشخيص فقط وفقًا للتعليمات المعتمدة لاستخدام الاختبارات المناسبة.
أخذ عينات الدم من الوريد المرفقي إلى أنبوب اختبار نظيف وجاف بكمية 3-5 مل. يمكن أخذ دم الحبل السري من الأطفال حديثي الولادة. لا ينصح بتخزين المواد التي تم الحصول عليها (الدم الكامل) لأكثر من 12 ساعة في درجة حرارة الغرفة ولمدة تزيد عن يوم واحد في الثلاجة عند 4-8 درجات مئوية. قد يؤثر انحلال الدم القادم على نتائج التحليل. يتم فصل المصل عن طريق الطرد المركزي أو عن طريق تتبع الدم على طول جدار أنبوب الاختبار باستخدام ماصة باستور أو قضيب زجاجي. يُنقل المصل المنفصل إلى أنبوب اختبار نظيف (ويفضل أن يكون معقمًا) أو قارورة أو حاوية بلاستيكية ، ويمكن تخزينه في هذا الشكل لمدة تصل إلى 7 أيام عند درجة حرارة 4-8 درجات مئوية. أثناء العمل ، يجب اتباع قواعد السلامة الواردة في "تعليمات نظام مكافحة الأوبئة في مختبرات تشخيص الإيدز" رقم 42-28 / 38-90 بتاريخ 5 يوليو 1990.
تحديد مجموع الأجسام المضادة لفيروس نقص المناعة البشرية.
عند استلام أول نتيجة إيجابية ، يتم إجراء التحليل مرتين أخريين (باستخدام نفس المصل وفي نفس نظام الاختبار). إذا تم الحصول على نتيجة إيجابية واحدة على الأقل (نتيجتان إيجابيتان من ثلاثة اختبارات ELISA) ، يتم إرسال المصل إلى المختبر المرجعي.
في المختبر المرجعي ، يتم إعادة فحص الأمصال الإيجابية الأولية (أي تلك التي أعطت نتيجتين إيجابيتين في نظام الاختبار الأول) في ELISA في نظام الاختبار الثاني (الآخر) الذي تم اختياره للتأكيد.
عند الحصول على نتيجة إيجابية للتحليل في نظام الاختبار الثاني ، يجب فحص المصل في IS.
إذا تم الحصول على نتيجة سلبية في نظام الاختبار الثاني ، يعاد فحص المصل في نظام الاختبار الثالث.
إذا تم الحصول على نتيجة اختبار سلبية في نظامي الاختبار الثاني والثالث ، يتم إصدار استنتاج بشأن عدم وجود أجسام مضادة لفيروس نقص المناعة البشرية.
عندما يتم الحصول على نتيجة إيجابية في نظام الاختبار الثالث ، يتم إرسال المصل أيضًا للتحليل في النشاف المناعي.
النشاف المناعي.
مبدأ الطريقة هو الكشف عن الأجسام المضادة لبعض بروتينات الفيروس المعطلة على غشاء النيتروسليلوز. يشار عادةً إلى بروتينات الغلاف (env) لـ HIV-1 بالبروتينات السكرية ("gp" أو "gp") ، مع الأوزان الجزيئية المعبر عنها بالكيلو دالتون (cd): 160 كيلو دالتون ، 120 كيلو دالتون ، 41 كيلو دالتون. يبلغ وزن البروتينات السكرية HIV-2 140 كيلو دالتون ، 105 ك د ، 36 ك د. البروتينات الأساسية (gag) (يشار إليها عادةً بالبروتينات - "p" أو "r") في HIV-1 لها وزن جزيئي يبلغ 55 كيلو دالتون ، 24 كيلو دالتون ، 17 كيلو دالتون ، على التوالي ، و HIV-2-56 كيلو دالتون ، 26 كيلو د. 18 د. إنزيمات HIV-1 (pol) لها وزن جزيئي قدره 66 كيلو دالتون ، 51 ك د ، 31 ك د ، HIV-2-68 ك د.
يتم تفسير نتائج التجلط المناعي على أنها إيجابية وغير محددة وسلبية.
إيجابي(إيجابية) تعتبر عينات يتم فيها اكتشاف الأجسام المضادة لـ 2 أو 3 بروتينات سكرية لفيروس نقص المناعة البشرية.
سلبي(سلبي) هي الأمصال التي لا تكتشف الأجسام المضادة لأي من المستضدات (البروتينات) لفيروس نقص المناعة البشرية.
تعتبر العينات التي تكشف عن الأجسام المضادة لبروتين سكري واحد لفيروس نقص المناعة البشرية و / أو أي من بروتينات فيروس نقص المناعة البشرية متردد(غير محدد أو غير قابل للتفسير).
عندما يتم الحصول على نتيجة غير محددة مع الأجسام المضادة للبروتينات الأساسية (الكمامة) في لطخة المناعة مع مستضدات HIV-1 ، يتم إجراء اختبار مع مستضدات HIV-2.
عند تلقي نتائج إيجابية من النشاف المناعي ، يتم التوصل إلى استنتاج حول وجود الأجسام المضادة لفيروس نقص المناعة البشرية في مادة الاختبار.
عند تلقي نتيجة اختبار سلبية ، يصدر البكالوريا الدولية استنتاجًا مفاده أنه لا توجد أجسام مضادة لفيروس نقص المناعة البشرية.
عند تلقي نتيجة غير محددة (إذا لم يتم اكتشاف مستضد p24) ، يتم إجراء اختبارات متكررة للأجسام المضادة لفيروس نقص المناعة البشرية بعد 3 أشهر ،
مع الحفاظ على نتائج غير محددة بعد 3 أشهر أخرى. إذا تم اكتشاف مستضد p24 ، يتم إجراء فحص ثانٍ بعد أسبوعين من تلقي أول نتيجة غير محددة.
إذا تم الحصول على نتائج غير محددة مرة أخرى بعد 6 أشهر من الفحص الأول ، ولم يكن لدى المريض عوامل خطر للعدوى والأعراض السريرية لعدوى فيروس نقص المناعة البشرية ، فإن النتيجة تعتبر إيجابية كاذبة. (في حالة وجود مؤشرات وبائية وسريرية ، يتم تكرار الدراسات المصلية على النحو المنصوص عليه).
النشاف المناعي باستخدام عديد ببتيدات خاصة بالفيروسات "لطخة HIV" يختلف من حيث أنه لا يستخدم البروتينات الفيروسية نفسها ، ولكن عديد الببتيدات المؤتلفة - نظائر مستضدات فيروس نقص المناعة البشرية ("Env1" ، "Gag1" ، "Poll" ، "Env2"). يكتشف متعدد البيبتيد Env1 المؤتلف الأجسام المضادة مباشرة لـ HIV-1 gp120 و gp41 ، وبولي ببتيد Gag1 إلى مستضدات p17 و p24 ، وبولي ببتيد Po11 إلى مستضد p51 ، وبولي ببتيد Env2 لمستضدات HIV-2 gp110 و gp38. يعتبر المصل إيجابيًا إذا كان يتفاعل مع Env1 أو Env2 أو كليهما Env (فيروس نقص المناعة البشرية من النوع 1 و 2 من العدوى المزدوجة). يعتبر التفاعل مع Poll and Gag فقط نتيجة غير محددة ، وفي هذه الحالة يتم إجراء المتابعة بشكل مشابه لحالات النتائج غير المحددة لطخة مناعية كلاسيكية باستخدام محلول فيروس نقص المناعة البشرية.
خصوصيات التشخيص المصلي لعدوى فيروس العوز المناعي البشري لدى الأطفال المولودين من أمهات مصابات بفيروس نقص المناعة البشرية هو أن الأطفال المصابين وغير المصابين في الأشهر 6-12 الأولى من العمر لديهم أجسام مضادة لفيروس نقص المناعة البشرية من الأم ، والتي يمكن أن تختفي بعد ذلك. المعيار الذي يشير إلى وجود إصابة بفيروس نقص المناعة البشرية لدى الطفل هو اكتشاف الأجسام المضادة لفيروس نقص المناعة البشرية في سن 18 شهرًا أو أكثر. يعد عدم وجود أجسام مضادة لفيروس نقص المناعة البشرية لدى طفل يبلغ من العمر 18 شهرًا يولد لأم مصابة بفيروس نقص المناعة البشرية معيارًا ضد الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية.
وفقًا لتوصية منظمة الصحة العالمية ، يتم استخدام التخمير المناعي (لطخة غربية) في تشخيص الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية كطريقة خبيرة إضافية ، والتي يجب أن تؤكد نتائج ELISA. تُستخدم هذه الطريقة عادةً للتحقق مرة أخرى من نتيجة ELISA الإيجابية ، حيث تعتبر أكثر حساسية وتحديدًا ، على الرغم من أنها أكثر تعقيدًا وتكلفة.
يجمع التجلط المناعي بين المقايسة المناعية الإنزيمية (ELISA) والفصل الكهربي الأولي لبروتينات الفيروس في مادة هلامية ونقلها إلى غشاء النيتروسليلوز. يتكون الإجراء المناعي من عدة خطوات (الشكل 27). أولاً ، يتم تنقية فيروس نقص المناعة البشرية مسبقًا وتدمير مكوناته المكونة له ، ويتعرض لفيروس نقص المناعة البشرية للرحلان الكهربائي ، بينما يتم فصل جميع المستضدات التي يتكون منها الفيروس عن طريق الوزن الجزيئي. ثم ، عن طريق النشاف ، يتم نقل المستضدات من الجل إلى شريط من النيتروسليلوز أو مرشح نايلون ، والذي يحتوي الآن على طيف من البروتينات المميزة لفيروس نقص المناعة البشرية ، غير المرئية للعين. بعد ذلك ، يتم تطبيق مادة الاختبار (مصل ، بلازما المريض ، إلخ) على الشريط ، وإذا كانت هناك أجسام مضادة محددة في العينة ، فإنها ترتبط بشرائط بروتينات المستضد التي تتوافق معها بدقة. نتيجة للتلاعب اللاحق (مثل ELISA) ، يتم تصور نتيجة هذا التفاعل - وجعلها مرئية. إن وجود خطوط في مناطق معينة من الشريط يؤكد وجود الأجسام المضادة في المصل المدروس لمستضدات فيروس نقص المناعة البشرية المحددة بدقة.
يستخدم التجلط المناعي بشكل شائع لتأكيد تشخيص عدوى فيروس العوز المناعي البشري. تعتبر منظمة الصحة العالمية أن الأمصال إيجابية إذا تم الكشف عن الأجسام المضادة لأي اثنين من بروتينات غلاف فيروس نقص المناعة البشرية عن طريق التكتل المناعي. وفقًا لهذه التوصيات ، إذا كان هناك تفاعل مع بروتين واحد فقط من بروتينات الغلاف (