Diagnóstico molecular mediante método PCR. ¿Qué es el diagnóstico por PCR? ¿Qué enfermedades determina? Como funciona el procedimiento?

Análisis de PCR: ¿qué es? Este es un método eficaz de biología molecular, que se utiliza en combinación con estudios inmunológicos, morfológicos y bioquímicos tradicionales. Las enfermedades infecciosas evolucionan y se desarrollan, al igual que la propia humanidad. Cada año hay más y cada vez son más difíciles de diagnosticar. Los factores que provocan la aparición de enfermedades e influyen en su desarrollo también se adaptan gradualmente a las condiciones externas del entorno, cambiando con ellas. Esta fue la razón por la que comenzaron a aparecer en medicina nuevos métodos y tecnologías que ayudan a obtener resultados más precisos en el diagnóstico de una enfermedad en particular.

Este método de diagnóstico de laboratorio de enfermedades infecciosas se basa en la detección del agente causante de una infección que el médico sospecha en el material de investigación. La reacción en cadena de la polimerasa los identificará, identificando el material genético correspondiente (ARN o ADN) en las muestras tomadas al paciente.

La PCR fue inventada por el científico estadounidense Kary Mullis en 1983.

La mayoría de las infecciones, si se detectan a tiempo, son altamente tratables. Por eso el método PCR es tan eficaz, porque es capaz de detectar incluso virus o bacterias cuyas células se encuentran aisladas en el material. Además, dicho diagnóstico identifica el virus, establece la naturaleza de su aparición, la fuerza con la que afecta al cuerpo e incluso la cantidad de microbios en el cuerpo del paciente. El médico podrá utilizar toda la información obtenida mediante el método de reacción en cadena de la polimerasa para seleccionar los medicamentos adecuados y prescribir el tratamiento adecuado.

investigación por PCR

Según el principio mismo de funcionamiento, todo sucede de forma bastante sencilla. El material biológico extraído del paciente se coloca en un reactor especial. Luego se agregan allí enzimas específicas que pueden contactar el ADN del microbio existente en el material y sintetizar su copia.

La copia se basa en el principio de una reacción en cadena. Es decir, todo el proceso requerirá varias etapas. Primero, 1 molécula de ADN forma 2 moléculas nuevas, luego se forman 4 nuevas a partir de ellas, y así hasta cientos y miles de copias. Posteriormente se procederá al análisis y decodificación.

Los fragmentos de ADN microbiano pueden estar contenidos en diversos materiales biológicos:

en fluidos biológicos (saliva, líquido articular, líquido amniótico, líquido pleural, líquido cefalorraquídeo, jugo de próstata);
en sangre y suero, en plasma;
en el raspado de células epiteliales (raspado del canal cervical, de la uretra, tanto para mujeres como para hombres);
en la orina (para el análisis será necesaria la orina de la mañana, es decir, su primera porción);
en esputo;
en mocos y otras secreciones biológicas;
en biopatías de estómago y duodeno.

¿Qué enfermedades se pueden detectar mediante PCR?

Los médicos consideran que este tipo de diagnóstico es uno de los más precisos. Este estudio nos permite detectar casi todas las enfermedades virales que actualmente conoce la medicina. Un aspecto muy importante es que entre ellas se encuentran infecciones que viven en el cuerpo humano durante muchos años, sin manifestarse de ninguna manera. Simplemente crecen anticipando cuándo les resultará más cómodo manifestarse (disminución de la inmunidad, agotamiento del cuerpo, etc.). La detección de este tipo de infecciones latentes es especialmente importante en las áreas urológica y ginecológica.

A continuación se muestran algunas enfermedades para las que a menudo se realiza el análisis de la reacción en cadena de la polimerasa:

hepatitis B y C;
muchas enfermedades de transmisión sexual (diagnóstico de clamidia, ureaplasmosis, micoplasmosis, candidiasis genital, vaginosis bacteriana, tricomoniasis, mononucleosis infecciosa, infección por el virus del papiloma (VPH), SIDA, etc.);
infección por herpes (incluido herpes genital);
tuberculosis y helicobacteriosis.

El método PCR da buenos resultados porque la mayoría de estas enfermedades se caracterizan por el hecho de que sus síntomas (especialmente en una etapa temprana) no son particularmente notorios. Pero las consecuencias que tienen en el organismo son muy negativas y muchas veces muy peligrosas para la salud e incluso la vida.

Por ejemplo, las enfermedades de transmisión sexual pueden aumentar significativamente el riesgo de cáncer de cuello uterino en las mujeres, afectar negativamente al embarazo o provocar infertilidad. Además, la salud del feto depende de la salud de la madre. Por lo tanto, es muy importante, ante la más mínima sospecha de infecciones ocultas, donar sangre para el diagnóstico de manera oportuna a fin de prevenir la infección del feto por la penetración de patógenos. Para los hombres, las consecuencias no son menos negativas: disminución de la motilidad y viabilidad de los espermatozoides, desarrollo de infertilidad masculina y prostatitis, daño a la uretra, etc.

Este análisis también es muy relevante para la detección oportuna de hepatitis viral, tuberculosis y diversas infecciones intestinales. Cuando se requiere un tratamiento inmediato, es muy importante comprender qué patógeno ha afectado al cuerpo y con qué se debe tratar. La sangre del paciente o cualquier otro material biológico ayudará a realizar un diagnóstico completo y correcto y a prescribir un tratamiento que ayudará a restaurar rápidamente las funciones corporales y promover la recuperación.

El herpes también es extremadamente persistente y peligroso. De un modo inactivo, puede fácilmente convertirse en progresivo, afectando el sistema nervioso central e influyendo en la aparición y desarrollo de enfermedades tan terribles como la meningitis y la encefalitis.

Transcripción del análisis

Después de realizar el estudio, puede recibir un resultado positivo o negativo. Son los resultados positivos los que indicarán que tal o cual infección está presente en su cuerpo. Un resultado negativo significa que no se sospecha ninguna infección en el cuerpo del paciente. Es decir, no se encontró nada en el material biológico presentado para la investigación.

Cualquier indicador debe ser descifrado y anunciado por un médico. No se enoje ni tenga miedo de los malos resultados, porque la reacción reveló la enfermedad, lo que significa que después de exámenes adicionales el médico podrá prescribir un tratamiento completo. Lo principal es no automedicarse y no retrasar el proceso.

Preparándose para el análisis: ¿qué necesita saber?

La detección de diferentes enfermedades requerirá diferentes materiales biológicos. Antes de realizar la PCR, asegúrese de consultar con un especialista adecuado y prepararse cuidadosamente para el próximo procedimiento.

Para ello, deberá seguir estrictamente todas las recomendaciones e instrucciones de su médico. Recuerde que la sangre normalmente se extrae con el estómago vacío. Para tomar un frotis de la vagina o la uretra, debe abstenerse de tener relaciones sexuales durante 1 a 2 días, realizar toda la higiene genital necesaria por la noche y solo enjuagarse con agua tibia por la mañana. También es importante dejar de tomar medicamentos durante aproximadamente una semana, a menos que su médico se lo indique. Y durante 2-3 horas antes de realizar la prueba, no orine. Para las mujeres, vale la pena considerar que el momento óptimo para realizar el estudio es unos días antes o inmediatamente después de la menstruación.

Método PCR: principales ventajas y desventajas.

Este tipo de diagnóstico tiene muchas ventajas.

En primer lugar, los patógenos de enfermedades infecciosas se determinan mediante indicación directa, a diferencia de otras pruebas de laboratorio tradicionales.

En segundo lugar, este análisis es simplemente universal, porque para su implementación se dispone de casi cualquier material biológico, que a menudo no es aceptable para ningún otro método de investigación.

Un punto muy importante es que cuando se realiza este diagnóstico se aísla en el material en estudio un fragmento de ADN que será característico únicamente de un patógeno específico, es decir, un virus o bacteria muy específico. Esto indica cuán específica es esta reacción.

Otro argumento a favor de este diagnóstico será la alta velocidad de su ejecución. Si algún estudio cultural no requiere días, sino incluso semanas, para aislar y cultivar el patógeno en un cultivo celular, este método le permitirá obtener resultados en 4 a 5 horas.

La PCR permite detectar no solo una infección que ya se encuentra en el pico de la enfermedad, sino también enfermedades crónicas, cualquier virus o bacteria. Este diagnóstico es posible debido a la muy alta sensibilidad del método. Esto también debe incluir el hecho de que la infección se detectará incluso si sólo una célula de un virus o bacteria en particular está presente en el material biológico que se envió para el análisis.

Las reacciones a resultados falsos negativos son muy raras.

Es cierto que el método también tiene sus inconvenientes. Uno de ellos es la posibilidad de obtener un resultado falso positivo. Esto sucede a menudo porque la infección ya ha sido eliminada, pero sus células epiteliales aún no se han renovado, por lo que la reacción seguirá viendo sus restos muertos y clonándola. Por lo tanto, debe esperar hasta que las células infectadas muertas se eliminen por completo del cuerpo (de un mes a dos después del tratamiento) o utilizar otros métodos en una etapa temprana: siembra o cultivo. Posteriormente será posible realizar el control mediante PCR.

Otro punto débil del análisis es la variabilidad de todos los microorganismos. Esto significa que algunos genotipos de patógenos que ya han mutado en el cuerpo serán esquivos para el sistema de prueba y no se producirá ninguna reacción. Para ello se están realizando diversos desarrollos para mejorar este método.

La gente empezó a hablar por primera vez del análisis de PCR en 1983. Esta técnica fue desarrollada por Kary Mullis y miembros de su laboratorio. Desde entonces, la popularidad del estudio ha ido aumentando constantemente, porque Tiene un número significativo de ventajas sobre otros métodos.

Hoy en día, el diagnóstico por PCR es el punto de referencia o estándar para identificar infecciones y patógenos, especialmente aquellos que son asintomáticos. En primer lugar, se trata de diagnóstico preclínico.

Realización de análisis en una máquina de PCR

La esencia del análisis por PCR es que las secuencias de ácido nucleico (ADN o ARN) características de un determinado tipo de patógeno se clonan (aumentadas muchas veces) en un tubo de ensayo.

La abreviatura PCR significa reacción en cadena de la polimerasa.

La principal característica distintiva de este método es la amplificación, es decir. creando una gran cantidad de copias del gen requerido o su fragmento. Todo esto se produce fuera del cuerpo, es decir. in vitro.

Entonces, si se realizan 20 ciclos de PCR, se obtienen aproximadamente 1 millón de copias o más. Esto permite detectar una infección incluso cuando su cantidad en el material de origen es insignificante, cuando otros métodos de análisis son impotentes. Esto determina la alta sensibilidad de este método.

En palabras simples, se puede hacer la siguiente analogía: no notarás ni un pequeño grano de arena en el suelo, pero después de aumentar el número de granos de arena un millón de veces (PCR), ya podrás ver claramente un montón de arena. .

Las principales ventajas de realizar pruebas de infección mediante el método PCR son:

mayor sensibilidad y especificidad en comparación con otros métodos utilizados para detectar agentes infecciosos;
la capacidad de detectar microorganismos en diversos materiales biológicos (sangre, orina, secreciones vaginales, saliva, etc.);
la capacidad de identificar simultáneamente varios microorganismos causantes, si los hay. A modo de comparación, el uso de métodos bacteriológicos no brinda esa oportunidad, porque es necesario utilizar diferentes medios para cultivar diversos microbios patógenos;
la posibilidad de transportar material biológico, porque Para identificar un patógeno no es necesario mantenerlo vivo;
velocidad de análisis;
precisión del diagnóstico etiológico;
la posibilidad de determinación cuantitativa de patógenos, especialmente importante para los microbios oportunistas, que sólo después de alcanzar una determinada concentración son capaces de causar enfermedades;
la capacidad de controlar el curso del proceso infeccioso durante el tratamiento.

Análisis de PCR para infecciones.

Actualmente, la mayoría de las enfermedades infecciosas de transmisión sexual (y otras) se determinan mediante el método de reacción en cadena de la polimerasa. El diagnóstico se ha generalizado debido a su alta sensibilidad y especificidad.

El análisis de PCR para detectar clamidia es especialmente popular.

Esto se debe a que estos microorganismos viven intracelularmente, lo que genera ciertas dificultades en su detección.

El diagnóstico por PCR permite detectar incluso una cantidad mínima de clamidia que, por regla general, aún no conduce a la aparición de síntomas clínicos. Incluso la presencia de sólo 2 moléculas de ácidos nucleicos en el material de prueba permite identificar la infección causante.

Y esta es la clave para un tratamiento exitoso, que comienza en la etapa preclínica.

También se determinan las infecciones:

hepatitis viral;
tuberculosis;
encefalitis transmitida por garrapatas;
diversas enfermedades de transmisión sexual, etc.

El diagnóstico por PCR le permite resolver otros problemas importantes:

monitorear la terapia y evaluar su efectividad;
determinación de la "carga viral", a partir de la cual se selecciona una dosis individual del fármaco;
identificación de cepas de microorganismos farmacológicamente resistentes (insensibles a los medicamentos).

Preparándose para la prueba

No es necesario prepararse específicamente para la prueba, que se realizará mediante el método PCR. Sin embargo, es muy importante que el especialista recoja el material cumpliendo todas las condiciones de esterilidad necesarias.

Así, por ejemplo, se deben utilizar sistemas de vacío especiales para extraer sangre, tubos especiales para extraer secreciones genitales, etc.

En algunos casos, el material debe ser transportado al laboratorio. Para realizar esto correctamente, es necesario sellar herméticamente el recipiente con material biológico. Esto evitará la penetración de otros microorganismos que viven en el ambiente externo.

Los resultados del análisis de PCR pueden ser de dos opciones:

positivo – patógeno detectado;
negativo: el patógeno no ha sido identificado.

Debes saber que incluso en ausencia de síntomas clínicos se puede obtener un resultado positivo.

En este caso, es necesario centrarse en los datos de la reacción de la polimerasa, porque le permite identificar la enfermedad en la etapa preclínica.

A veces se puede obtener una respuesta cuestionable cuando el número de copias detectadas corresponde al límite superior de lo normal. Para aclarar la causa de la enfermedad, se debe repetir el análisis, prestando especial atención a las condiciones para la recolección de material biológico.

¿Qué tan preciso es el diagnóstico por PCR?

Las principales ventajas del diagnóstico por PCR se pueden formular en forma de varias tesis:

la posibilidad de obtener una gran cantidad de copias de microorganismos patógenos;
una gran cantidad de copias es la clave para una secuenciación (detección) exitosa.

Esto garantiza una alta precisión del análisis de PCR para la detección de patógenos intracelulares y microorganismos de crecimiento lento.

Por tanto, el método es especialmente informativo para identificar micobacterias tuberculosas y otros agentes infecciosos similares. Tiene la mayor precisión y no necesita volver a verificar los resultados obtenidos (excepto en casos ocasionales).

Para obtener los resultados más fiables, es necesario cumplir dos condiciones básicas que previenen la infección exógena (externa):

selección correcta de material;
Transporte correcto.

Contenido

Quienes estén interesados en nuevos métodos de diagnóstico deberían saber qué es el método PCR. Las capacidades técnicas modernas en el campo de la investigación de laboratorio brindan la oportunidad de detectar muchas enfermedades en las etapas iniciales. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se considera actualmente el método más nuevo y preciso.

análisis por PCR

Análisis de PCR: ¿qué es? Este método utiliza los principios de la biología molecular. Para estudiar el material se utilizan enzimas especiales que copian repetida y rápidamente fragmentos de ADN y ARN de patógenos. Existen diferentes tipos de análisis PCR dependiendo del material que se esté analizando (sangre, orina, heces, etc.). Después del procesamiento, el personal del laboratorio compara el resultado obtenido con la base de datos, identifica la concentración y el tipo de patógeno.

El análisis de PCR se coloca en un ciclador (dispositivo) especial que calienta y enfría los tubos con biomaterial. Los cambios de temperatura son necesarios para la replicación de los fragmentos. La precisión del resultado dependerá de la precisión del régimen de temperatura. El método de reacción en cadena de la polimerasa ayuda a identificar:

Mononucleosis infecciosa;
infección por citomegalovirus;
hepatitis viral G, C, B, A;
infecciones/enfermedades de transmisión sexual (ITS/ETS): gardnerelosis, tricomoniasis, ureaplasmosis;
infección por herpes;
virus oncogénicos;
listeriosis;
Infección por Helicobacter pylori;
encefalitis transmitida por garrapatas, borreliosis;
tuberculosis;
candidiasis.

Sangre

Por el momento, debido a la novedad de la tecnología, las pruebas de sangre por PCR todavía tienen un precio elevado. Para preparar el biomaterial no es necesario cumplir ciertos requisitos. Incluso los cambios en la composición provocados por la actividad física, el estrés o los cambios en la dieta no afectan los resultados del estudio. Un análisis de sangre por PCR solo puede estropearse si se toman agentes antibacterianos, por lo que antes de realizar la prueba es necesario hacer una pausa entre el tratamiento y la prueba.

El análisis de sangre por PCR es la opción más común para diagnosticar patologías infecciosas agudas crónicas con manifestaciones virales o atípicas. Los métodos de investigación serológica tienen ciertas dificultades en su implementación: la presencia de un patógeno está determinada por la presencia de anticuerpos en el cuerpo humano. El resultado podría ser falso negativo si el estado del paciente no permitiera tiempo para su desarrollo.

frotis

En el campo de la ginecología, el análisis de frotis por PCR se utiliza para estudiar la presencia de microorganismos infecciosos. El trabajo con el material se realiza según el mismo principio que con la sangre: ampliación múltiple de fragmentos de ADN del patógeno para identificarlo fácilmente. Esto también ayuda a detectar infecciones ocultas en una mujer. Se pueden tomar varios fluidos biológicos para su análisis: saliva, esputo, orina, sangre. En ginecología, para una determinación precisa, a menudo se utiliza un frotis de la mucosa vaginal del canal cervical.

Existen determinadas indicaciones para realizar la PCR. A menudo es necesario hacerlo para identificar un patógeno resistente a los antibióticos. En las mujeres, las principales indicaciones de diagnóstico mediante este método son:

embarazo que es difícil;
fase aguda de las ITS;
si existe la sospecha de que una ITS ha progresado a una etapa crónica;
Buscando las causas de la infertilidad.

kala

Para detectar una infección, un médico puede recetar una prueba de PCR en heces. Para obtener los resultados más confiables después de la prueba, es necesario cumplir con las siguientes reglas antes de recolectar el biomaterial:

dejar de tomar laxantes unos días antes: aceites, supositorios;
excluya los medicamentos que dan un color específico a las heces, por ejemplo, los que contienen hierro.

Orina

Si es necesario, su médico puede tomar orina para analizarla. La alta precisión abre la posibilidad de trabajar con cualquier fluido biológico del que se pueda extraer ADN viral. Para realizar una prueba de orina PCR, debe cumplir con las siguientes restricciones antes de recolectar el material:

suspender las relaciones sexuales al menos 1 día antes del procedimiento;
3 semanas antes de la prueba, se debe completar cualquier tratamiento antibacteriano, porque los medicamentos borrarán la imagen;
Debe realizar la prueba con el estómago vacío (los líquidos también están prohibidos);
Debes tomar la primera parte del material de la mañana.

resultados de la prueba de PCR

De lo anterior queda claro qué es el análisis por PCR y las claras ventajas de este método de investigación son visibles. Otra ventaja de este procedimiento de diagnóstico es la facilidad de descifrar los resultados. Teniendo en cuenta el tiempo que lleva un análisis de PCR (el proceso en sí dura unas 5 horas, pero el laboratorio produce datos en 1 o 2 días), este método de diagnóstico se convierte en la mejor opción para identificar muchas infecciones. Según los resultados, su médico puede decirle que la prueba:

Negativo: el material de prueba no contenía el patógeno deseado.
Positivo: se encontraron ARN y ADN del patógeno.

A veces se lleva a cabo una determinación cuantitativa de microorganismos. Esto es necesario para enfermedades causadas por patógenos oportunistas. La peculiaridad de estos virus es que aparecen sólo en cantidades excesivas y es extremadamente problemático encontrarlos mediante la investigación convencional. Este factor es importante a la hora de elegir tácticas terapéuticas para tratar eficazmente las infecciones virales, por ejemplo, la hepatitis y el VIH.

Por 12 infecciones

Para comprender completamente qué es el diagnóstico de infecciones por PCR y qué tan efectivo es, debe saber que puede aislar hasta 12 patógenos. El texto se realiza únicamente en condiciones de laboratorio. Para la investigación, se utilizan enzimas especiales que aumentan muchas veces la cantidad de fragmentos de ARN y ADN del virus. El análisis de PCR para 12 infecciones puede detectar:

Tuberculosis micobacteriana;
citomegalovirus;
hepatitis C, G, B, A;
herpes 1, 2 tipos;
virus de Epstein-Barr (mononucleosis infecciosa);
infecciones de transmisión sexual, por ejemplo, clamidia;
listeriosis;
infección por cándida;
Helicobacter pylori;
borreliosis, encefalitis transmitida por garrapatas.

Para la hepatitis C

Este método de diagnóstico ayuda a determinar la presencia del virus en la sangre. Esto les da a los médicos la oportunidad de hablar sobre su presencia o ausencia. Existen dos tipos de análisis de PCR para la hepatitis C: cualitativo y cuantitativo. La primera opción indica sólo su presencia y puede tener la frase "detectado"/"no detectado". Este tipo de prueba tiene una sensibilidad de 10-500 UI/ml. Esto sugiere que si el contenido del patógeno en el cuerpo es bajo, el análisis “no se detectará”.

El análisis cuantitativo es más preciso y mostrará la concentración de infección en la sangre. Este indicador se denomina “carga viral” y se mide en la cantidad de ARN viral por volumen específico de sangre. La decodificación en diferentes laboratorios puede diferir. Además de la medición de UI/ml, se utilizan unidades de “copia”. Puedes contar copias por UI usando la fórmula: 1 UI = 4 copias. Si el valor de decodificación de la presencia del virus excede 800.000 UI/ml (o 800*103), esto indica un alto contenido del patógeno.

Para la tuberculosis

La prueba debe realizarse por la mañana. Esto es importante para evitar que toda la masa de esputo que se formó durante la noche salga del estómago. El análisis por PCR para tuberculosis es tan importante como ELISA, Mantoux y la tomografía. La prueba ayuda a identificar la presencia de micobacterias, el estado de la orina, las inmunoglobulinas totales, la VSG y a determinar el estado de los pulmones en este momento. Para garantizar resultados precisos al analizar la PCR, se debe realizar cumpliendo las siguientes reglas:

La siembra se realiza 3 veces, pero la aspiración completa del contenido del estómago debe realizarse únicamente en un hospital.
Las micobacterias se detectan mediante cultivo de masas existentes en el estómago en menos del 50% de los diagnósticos. Incluso cuando se obtienen condiciones óptimas, se recomienda la ecografía.
Incluso si el resultado es negativo, no se puede excluir por completo la posibilidad de desarrollar tuberculosis con cambios en la VSG, inmunoglobulinas u otros indicadores.
El cultivo de materiales durante la PCR es menos susceptible a condiciones patológicas si se obtiene como parte de un examen broncoscópico, que excluye la sospecha de tuberculosis en un niño.

Para el VIH

Para muchas personas, este diagnóstico se considera una sentencia de muerte. Por esta razón, después de relaciones sexuales frecuentes, una persona se vuelve más atenta a las señales que su cuerpo da (y en ocasiones las inventa). La opción más confiable para obtener confirmación o refutación de esta enfermedad es una prueba de PCR para VIH. La prueba se puede utilizar para determinar los siguientes posibles problemas de salud:

Refutación/confirmación de la presencia de VIH durante el período seronegativo.
Determinación del genotipo de VIH-1, VIH-2.
Aclaración de la descripción del proceso patológico en caso de resultados dudosos de la inmunotransferencia.
Infección después de una transfusión de sangre.
Determinación del estado serológico respecto del VIH en niños nacidos de madres portadoras de la enfermedad.
Ayuda a establecer un seguimiento de la carga viral del organismo.

Para el VPH

El virus del papiloma puede detectarse en cualquier persona y puede permanecer latente durante mucho tiempo. El desarrollo es provocado por una inmunidad debilitada, estrés o arrebatos emocionales. Una prueba de PCR para el VPH ayuda a determinar la concentración del virus en la sangre. Por esta razón, se recomienda que las determinaciones se hagan de forma cuantitativa y no cualitativa. Estos datos ayudarán a predecir la probabilidad de una infección maligna.

El método para diagnosticar la presencia del VPH se basa en la propiedad principal de la PCR de aislar el ADN viral del material. Debido a la alta sensibilidad de la prueba, se detectarán incluso pequeñas cantidades de bacterias. La investigación cuantitativa brinda a los médicos la oportunidad de determinar el grado de peligrosidad de la enfermedad y hacer un pronóstico para el futuro. Este diagnóstico es obligatorio para todos los hombres y mujeres que han descubierto condilomas. El análisis cuantitativo de PCR ayudará a determinar qué causó el desarrollo del VPH: una disminución temporal de la inmunidad o una enfermedad crónica.

Para el herpes

Este tipo de diagnóstico en microbiología ayuda a realizar análisis de PCR para detectar herpes con alta precisión. La copia de fragmentos de ADN del virus sólo se producirá si el gen deseado está presente en el material. En este caso, los resultados de la prueba pueden indicar la presencia o ausencia del patógeno. Puede detectarse incluso en concentraciones bajas en la sangre.

Otra ventaja de la prueba de PCR es que puede detectar una infección viral por herpes inmediatamente después de la infección, antes de que aparezcan los síntomas clínicos. Se puede determinar el tipo de herpes (1 o 2), no se requiere ninguna preparación específica para realizar la prueba, pero los médicos recomiendan que antes de extraer sangre se rechace:

frito;
agudo;
alcohol;
gordo.

Durante el embarazo

Durante el embarazo, es muy importante realizar esta investigación para registrar el estado de la mujer. El análisis de PCR durante el embarazo está incluido en la lista de los métodos más eficaces para determinar la presencia de diversas enfermedades. La prueba es necesaria no solo para identificar patologías, sino también para determinar la probabilidad de infección del niño en el útero. Sólo gracias al diagnóstico por PCR fue posible identificar el grado de progresión y desarrollo de muchas infecciones dentro del útero.

Realización de pruebas PCR

Si se pregunta cómo se realiza un análisis de PCR, se debe considerar cada caso individual, teniendo en cuenta el tipo de biomaterial. Un raspado, frotis o extracción de sangre tiene sus propias características, por ejemplo:

el plasma se dona por la mañana;
la orina se extrae solo a primera hora de la mañana, en condiciones de laboratorio en un recipiente esterilizado;
un frotis o raspado será indicativo sólo después de abstenerse de tener relaciones sexuales durante al menos 3 días;
No se puede realizar un frotis durante la menstruación y 2 días después.

Dónde hacerse la prueba de PCR

Este tipo de investigación se refiere a métodos de diagnóstico modernos y de alta tecnología. Las pruebas mediante el método PCR deben realizarse en laboratorios que cuenten con todo el equipamiento necesario para obtener resultados completos. El personal cualificado y capacitado desempeña un papel igualmente importante. Dar preferencia a laboratorios grandes, serios y conocidos. Esto no sólo le ayudará a obtener resultados rápidamente, sino que también garantizará su fiabilidad.

Precio

Otra pregunta que suele interesar a los pacientes: ¿cuánto cuesta una prueba PCR? Debido a la novedad del método y a la necesidad de adquirir equipos costosos, el precio de la prueba es relativamente alto. El costo de la PCR depende del tipo de infección para la cual se realizará la prueba a la persona. El precio aproximado y el momento de las pruebas son los siguientes:

Las ITS se controlarán en 1 día, el precio es de 400 a 500 rublos.
El herpes, el VPH, el virus de Epstein-Barr y el citomeglovirus se detectan en 24 horas y el precio es de 300 a 500 rublos.
El análisis de hepatitis se realiza en 5 días, el precio de la opción cualitativa es de 500 rublos y de la opción cuantitativa, 2000 rublos.
Helicobacter pylori se detecta en 24 horas, el precio es de 400 rublos.
Antígenos, anticuerpos contra el VIH, precio: desde 380 rublos.
Análisis cualitativo del ARN del VIH, precio: desde 3500 rublos.
Análisis cuantitativo del ARN del VIH, precio – desde 11.000 rublos.

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¡Atención! La información presentada en el artículo es sólo para fines informativos. Los materiales del artículo no fomentan el autotratamiento. Sólo un médico calificado puede hacer un diagnóstico y dar recomendaciones de tratamiento basadas en las características individuales de un paciente en particular.

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La PCR (reacción en cadena de la polimerasa) es un logro de la biología molecular, uno de los principales métodos de diagnóstico de laboratorio clínico de finales del siglo XX y principios del XXI, que ha aportado enormes beneficios en diversos campos de la ciencia médica.

Por lo tanto, incluso si entre millones de células del cuerpo humano no se pierde el virus vivo en sí, sino solo una partícula de su ADN, entonces la PCR, si nada interfiere con él, probablemente hará frente a la tarea e informará de su presencia. de un “extraño” con resultado positivo. Ésta es la esencia de la PCR y su principal ventaja.

Ventajas y desventajas

El laboratorio que realiza el diagnóstico por PCR está sujeto a los más altos requisitos en cuanto a equipamiento, sistemas de prueba y cualificación del personal médico. Se trata de un laboratorio de alta tecnología que cuenta con un arsenal de reactivos altamente sensibles y específicos, por lo que no presenta desventajas particulares. A menos que dé un resultado positivo en ausencia de manifestaciones clínicas y, por tanto, ponga al médico en un dilema: ¿vale la pena iniciar el tratamiento o no?

El médico que observa al paciente comienza a dudar de la fiabilidad de los resultados de la prueba, ya que no ve ningún signo de la enfermedad. Pero aún así, dada la alta sensibilidad del sistema PCR, conviene recordar que detecta el patógeno incluso en la fase preclínica, y un resultado positivo en este caso es más una ventaja que una desventaja. En base a esto, el médico tratante debe decidir él mismo sobre la conveniencia de la terapia, teniendo en cuenta otros argumentos "a favor" y "en contra".

Las ventajas del diagnóstico mediante la reacción en cadena de la polimerasa son obvias:

Alta especificidad, alcanzando el 100%, debido a la presencia en la muestra seleccionada de partículas de ácido nucleico inherentes a un organismo particular, pero extrañas a los humanos;
Alto rendimiento, porque la PCR es una técnica automatizada de alta tecnología que brinda la oportunidad de realizar pruebas el día de la toma de muestras y así aliviar al paciente de preocupaciones innecesarias;
La PCR, trabajando en una muestra, es capaz de realizar varios estudios y detectar múltiples patógenos, si ella tiene tal tarea. Por ejemplo, en el diagnóstico de una infección por clamidia, donde la PCR es uno de los métodos principales, junto con la clamidia, también se puede detectar Neisseria (gonococo), el agente causante. Además, esto no afecta negativamente a la fiabilidad de los resultados;
pruebas de PCR revela microorganismos peligrosos durante el período de incubación, cuando aún no han tenido tiempo de causar un daño significativo al organismo, es decir, el diagnóstico precoz advierte del inminente desarrollo del proceso patológico, lo que permite prepararse para él y afrontarlo con total preparación.

Además, para evitar malentendidos que a veces surgen durante el diagnóstico, la PCR también se protege con el hecho de que sus resultados pueden registrarse (fotografía, computadora) con el fin de utilizarlos con fines expertos, si fuera necesario.

La norma para las respuestas de PCR es un resultado negativo., que indica la ausencia de fragmentos de ácidos nucleicos extraños, una respuesta positiva indicará la presencia de infección en el cuerpo, los valores digitales indican el estado del virus y su concentración en el momento de la prueba. Sin embargo, la interpretación completa del análisis la realiza un médico que ha recibido una formación especial en el tema "PCR". No tiene sentido intentar interpretar los resultados usted mismo, ya que, como probablemente sucede, puede malinterpretarlos y comenzar a preocuparse de antemano.

¿A qué le “teme” la PCR, qué puede hacer y cómo prepararse para ello?

Como ocurre con cualquier otra investigación, A veces los resultados de la prueba son falsos positivos o falsos negativos., donde la PCR no es una excepción. Esto puede suceder en los siguientes casos:

Violaciones del proceso tecnológico en una de las etapas de la reacción;
Incumplimiento de las normas de recogida de material, almacenamiento o transporte del mismo;
La presencia de impurezas extrañas en el material.

Esto sugiere que el diagnóstico de infecciones por PCR debe abordarse con cuidado, cautela y precisión, de lo contrario las muestras de material pueden cambiar su estructura estructural o colapsar por completo.

Etapas del diagnóstico por PCR. Los resultados falsos pueden deberse a violaciones en cualquier etapa del estudio.

El diagnóstico de infecciones por PCR pertenece a la categoría de "estándares de oro" entre otros métodos de laboratorio, por lo que puede usarse para buscar patógenos de muchas enfermedades que, a primera vista, no tienen nada en común entre sí:

Tuberculosis de diversas localizaciones, neumonía (incluida la atípica, causada por clamidia);
Infecciones infantiles (sarampión, rubéola, paperas, sarampión);
Difteria;
Salmonelosis;
Enfermedad infecciosa zoonótica: listeriosis (la enfermedad se caracteriza por una variedad de síntomas con daño a los ganglios linfáticos, el sistema nervioso central y los órganos internos);
Enfermedades causadas por el virus de Epstein-Barr (mononucleosis infecciosa, etc.);
Patología oncológica provocada por la infección por el virus del papiloma humano (VPH y sus tipos);
Borreliosis (enfermedad de Lyme, encefalitis transmitida por garrapatas);
Infección por Helicobacter pylori, cuyo agente causante es el microbio Helicobacter pylori que vive en el estómago humano. Se ha comprobado que Helicobacter provoca el desarrollo de cáncer de estómago o duodeno;
y casi todo.

El diagnóstico por PCR de las infecciones de transmisión sexual es de particular importancia, ya que las enfermedades causadas de esta manera a menudo continúan durante mucho tiempo sin manifestaciones clínicas, pero durante el embarazo comienzan a volverse más activas y, por lo tanto, amenazan la salud e incluso la vida de la mujer. niño. Se comportan de manera similar. Algunos de ellos (“antorcha”) también hacen referencia a las ITS, por lo que estas últimas requieren una consideración más detallada. El lector podrá familiarizarse con los métodos más populares en las siguientes secciones del artículo.

¿Cómo prepararse adecuadamente para obtener resultados confiables?

Observemos de inmediato que la preparación para la PCR es bastante sencilla y no requiere ningún esfuerzo especial por parte del paciente. Sólo necesitas completar tres tareas simples:

No tener relaciones sexuales 24 horas antes de realizar la prueba;
Para extraer y analizar sangre de una vena es necesario venir con el estómago vacío, por cierto, tampoco se puede beber;
La orina se debe donar por la noche (por la mañana, en un frasco esterilizado comprado el día anterior en la farmacia).

La PCR puede funcionar en cualquier entorno biológico.

El método PCR no es “sediento de sangre” y por lo tanto acepta cualquier medio biológico que contenga un agente infeccioso sospechoso. la elección de qué llevar a la investigación queda en manos del médico.

Así, en busca de un patógeno, además de un análisis de sangre (aunque este también es adecuado y en la mayoría de los casos se realiza en paralelo con otro material), se puede utilizar:

(secreción del tracto urogenital);
Raspado de las membranas mucosas de la cavidad bucal, conjuntiva, nasofaringe, tracto genital (para mujeres, tomado del cuello uterino y la vagina, para hombres, de la uretra);
Saliva;
Esperma;
Jugo de próstata;
Tejido placentario y líquido amniótico (líquido amniótico);
Sedimento de orina (tras centrifugación), por ejemplo, para detectar determinadas ITS y Mycobacterium tuberculosis;
Esputo y líquido pleural con el mismo fin;
Exudados;
Líquido cefalorraquídeo si se sospecha una infección del sistema nervioso central;
Material de biopsia (bioptat) extraído del hígado, duodeno, estómago, etc.

A lo anterior me gustaría agregar que en todos los casos habrá suficiente material para realizar la prueba, incluso en raspados y secreciones, ya que la prueba por PCR no requiere grandes volúmenes, bastan unos pocos microlitros para el análisis, que normalmente se toman. en un microtubo Eppendorf y enviado para su estudio.

Enfermedades y usos de la PCR

VIH y reacción en cadena de la polimerasa

Por lo general, durante un examen anónimo, en caso de resultados positivos de inmunotransferencia, el diagnóstico se repite nuevamente. Si se confirma el diagnóstico, al paciente se le prescriben pruebas adicionales:

Determinación, mediante reacciones inmunológicas, de los valores absolutos del número de linfocitos CD 4 (células inmunocompetentes - T auxiliares o auxiliares), a los que afecta primero la infección, después de lo cual pierden sus propiedades básicas y no pueden distinguir entre los "propios" y "extranjero". Confunden el ARN viral que circula en el plasma sanguíneo con células normales del cuerpo y no reaccionan ante ellas;
Detección de ARN viral mediante PCR y cálculo de la concentración de partículas virales para establecer el estadio, gravedad del proceso patológico y pronóstico en base a estos datos.. Por supuesto, la palabra "norma" a este respecto no existe, ya que la reacción siempre es positiva y descifrar los valores digitales es competencia del médico.

PCR y hepatitis

El método PCR permite detectar patógenos; la mayoría de las veces la prueba se utiliza para diagnosticar la hepatitis C, que es difícil de detectar con otros métodos.

El virus de la hepatitis C (que contiene ARN) se parece al VIH en su comportamiento en el cuerpo humano. Incrustado en el genoma de las células del hígado (hepatocitos), permanece allí esperando entre bastidores, lo que puede ocurrir en al menos 2 años, incluso en 20 años, por lo que los médicos lo apodaron "el asesino gentil". La hepatitis C conduce a la formación de un proceso maligno en el parénquima hepático, que se manifiesta en etapas posteriores. El sistema inmunológico no se da cuenta de todos estos eventos y confunde el virus con un hepatocito. Es cierto que los anticuerpos contra el virus se producen en algunas cantidades, pero no proporcionan una respuesta inmune decente. Para diagnosticar la hepatitis C, ELISA no es muy informativo, ya que indica que el virus ha dejado rastros, pero se desconoce si desapareció por sí solo. Con el VHC se conocen casos de autocuración, mientras que los anticuerpos contra el virus permanecen y siguen circulando de por vida (memoria inmunológica). La PCR se adelanta notablemente a la formación de anticuerpos y puede detectar una partícula viral en 1 a 1,5 semanas, mientras que los anticuerpos pueden aparecer en el intervalo de 2 meses a seis meses.

El diagnóstico por PCR en caso de sospecha de que el virus de la hepatitis C está rampante en el cuerpo humano es el método de investigación más óptimo, porque sólo él puede reconocer la presencia de un "enemigo gentil" en la sangre o en la biopsia hepática del paciente.

Sin embargo, a veces hay casos en los que los anticuerpos son positivos, pero el resultado de la PCR es negativo. Esto sucede a veces cuando la cantidad de virus es muy baja o cuando está en estado “latente” en el hígado sin ingresar al torrente sanguíneo. Para encontrar la verdad, al paciente se le realiza una segunda prueba, o incluso más de una.

Infección por virus del papiloma humano

Si no se produce la autocuración, también puede, sin manifestarse de ninguna manera, persistir durante mucho tiempo en el cuerpo del propietario, quien ni siquiera lo sospecha, ya que no se realizó PCR y no hubo síntomas de la enfermedad. Sin embargo, la presencia de infección por virus del papiloma, aunque latente, no es indiferente a la salud humana, donde ciertos tipos de virus que causan cáncer (tipos 16, 18) representan un peligro particular.

Más a menudo, la mitad femenina de la población padece VPH, ya que el virus prefiere la zona genital femenina, y especialmente el cuello uterino, donde algunos tipos de virus contribuyen al desarrollo de procesos displásicos y luego al cáncer de cuello uterino, si no se trata la displasia. y al virus se le da rienda suelta. Entonces, la reacción en cadena de la polimerasa detectará el ADN viral y luego indicará si el tipo "malo" o "bueno" (oncogénico o no oncogénico) se ha asentado en el cuerpo de la mujer.

Otras ITS e infecciones TORCH

Obviamente, la reacción en cadena de la polimerasa permite detectar cualquier estructura extraña formada por ácidos nucleicos, por lo que esta prueba es adecuada para identificar todas las ETS e infecciones TORCH, aunque no siempre se utiliza. ¿Por qué, digamos, realizar estudios tan costosos para detectar gonococos, si hay otros más accesibles y baratos?

Las infecciones por TORCH y las ITS están tan interrelacionadas que a veces es difícil determinar en qué grupo se debe clasificar un patógeno en particular. En general, puede resultar difícil comprenderlos, ya que se trata de grupos muy diversos de microorganismos que pueden transmitirse sexualmente siempre o sólo bajo determinadas condiciones (inmunodeficiencia), y pueden ser de interés sólo durante el embarazo, debido al posible impacto negativo en la salud. su curso y en el feto.

La PCR es el principal método para detectar infecciones ocultas

El desarrollo de las manifestaciones clínicas se basa en diferentes patógenos, que sólo pueden detectarse mediante PCR, que es su tarea principal, a veces junto con ELISA, y otras veces. como única prueba confirmatoria, especialmente si no hay síntomas de la enfermedad. Una situación tan difícil puede ser creada por una infección polimicrobiana que, además de los patógenos obvios, también incluye patógenos oportunistas.

El ureaplasma a menudo se considera junto con el micoplasma. Y esto no es sin razón. Estas especies, al igual que la clamidia, no son virus ni bacterias, viven dentro de las células y están clasificadas como ITS, aunque tampoco es infrecuente su presencia en un organismo sano. Entonces, para distinguir a un portador sano de una persona enferma, se necesitan métodos especiales, donde la PCR se considera la más confiable, ya que, debido a las características estructurales y el comportamiento de estos microorganismos, otros estudios son ineficaces.

En cuanto a (tipo 1, 2) y, que también pertenece a los virus del herpes (tipo 5), la situación aquí también es ambigua. La tasa de infección de la población mundial se acerca al 100%, por lo que en este caso es muy importante identificar el virus y su dosis, lo que juega un papel especialmente durante el embarazo, porque para un adulto, un virus que se ha arraigado en su cuerpo. A menudo no causa ningún problema y no da signos de enfermedad.

Por lo tanto, no se debe ignorar dicho examen prescrito por un médico, porque en algunos casos, la reacción en cadena de la polimerasa es un método obligatorio y necesario de diagnóstico de laboratorio que puede proteger no solo a una mujer, sino también a un feto de complicaciones graves.

En conclusión, me gustaría señalar que un método tan maravilloso como la PCR ha estado al servicio de la humanidad durante más de 30 años. Al mismo tiempo, los objetivos de la prueba no se limitan a la búsqueda de patógenos de enfermedades infecciosas. La reacción en cadena de la polimerasa, nacida de la biología molecular, está indisolublemente ligada a la genética, utilizado con éxito en medicina forense para la identificación personal, en medicina forense para establecer la paternidad, en medicina veterinaria, si la clínica animal tiene la oportunidad de adquirir equipos costosos, así como en otras áreas (industria, agricultura, etc.).

Video: PCR - esencia y aplicación.

Sin embargo, en ese momento esta idea quedó sin reivindicar. La reacción en cadena de la polimerasa fue redescubierta en 1983 por Kary Mullis. Su objetivo era crear un método que permitiera amplificar el ADN mediante múltiples duplicaciones sucesivas de la molécula de ADN original utilizando la enzima ADN polimerasa. Siete años después de la publicación de esta idea, en 1993, Mullis recibió el Premio Nobel por ella.

Al inicio del uso del método, después de cada ciclo de calentamiento-enfriamiento, era necesario agregar ADN polimerasa a la mezcla de reacción, ya que se inactivaba rápidamente a la alta temperatura requerida para separar las hebras de la hélice de ADN. El procedimiento fue muy ineficiente y requirió mucho tiempo y enzimas. En 1986 se mejoró significativamente. Se ha propuesto utilizar ADN polimerasas de bacterias termófilas. Estas enzimas resultaron ser termoestables y capaces de soportar muchos ciclos de reacción. Su uso permitió simplificar y automatizar la PCR. Una de las primeras ADN polimerasas termoestables se aisló de bacterias Termo acuático y nombrado Taq-polimerasa. La desventaja de esta polimerasa es que la probabilidad de introducir un nucleótido erróneo es bastante alta, ya que esta enzima no tiene mecanismos de corrección de errores (actividad exonucleasa 3"→5"). Polimerasas fuf Y Pwo, aislados de arqueas, tienen tal mecanismo; su uso reduce significativamente el número de mutaciones en el ADN, pero la velocidad de su trabajo (procesividad) es menor que la de Taq. Actualmente se utilizan mezclas Taq Y fuf para lograr una alta velocidad de polimerización y una alta precisión de copia.

En el momento de la invención del método, Mullis trabajaba para Cetus Corporation, que patentó el método de PCR. En 1992, Cetus vendió los derechos del método y la patente de uso. Taq-empresa de polimerasa Hoffmann-La Roche (en: Hoffmann-La Roche) por 300 millones de dólares. Sin embargo, resultó que Taq La polimerasa fue caracterizada por el bioquímico ruso Alexei Kaledin en 1980, y Promega intentó obligar a Roche a renunciar a los derechos exclusivos sobre esta enzima. La patente estadounidense para el método PCR expiró en marzo de 2005.

Realización de PCR

El método se basa en la copia selectiva repetida de una determinada sección de ADN utilizando enzimas en condiciones artificiales ( in vitro). En este caso, solo se copia la sección que cumple las condiciones especificadas, y solo si está presente en la muestra en estudio. A diferencia de la amplificación del ADN en organismos vivos (replicación), se amplifican secciones relativamente cortas de ADN mediante PCR. En un proceso de PCR convencional, la longitud de las secciones de ADN copiadas no supera los 3000 pares de bases (3 kpb). Usando una mezcla de varias polimerasas, usando aditivos y bajo ciertas condiciones, la longitud de un fragmento de PCR puede alcanzar entre 20 y 40 mil pares de nucleótidos. Esta longitud sigue siendo significativamente menor que la longitud del ADN cromosómico de una célula eucariota. Por ejemplo, el genoma humano consta de aproximadamente 3 mil millones de pares de bases.

Componentes de la reacción

Para realizar la PCR en el caso más sencillo se necesitan los siguientes componentes:

matriz de ADN, que contiene la sección de ADN que necesita ser amplificada.
dos cebadores, complementario a los extremos opuestos de diferentes hebras del fragmento de ADN deseado.
Térmicamente estable ADN polimerasa- una enzima que cataliza la reacción de polimerización del ADN. La polimerasa para su uso en PCR debe permanecer activa a altas temperaturas durante mucho tiempo, por lo que se utilizan enzimas aisladas de termófilos. Termo acuático(Taq polimerasa), Pyrococcus furioso(Pfu polimerasa), Pyrococcus woesei(Pwo polimerasa) y otros.
Trifosfatos de desoxinucleósidos(dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
Iones Mg 2+ necesarios para el funcionamiento de la polimerasa.
Solución tampón, proporcionando las condiciones de reacción necesarias: pH, fuerza iónica de la solución. Contiene sales, albúmina sérica bovina.

Para evitar la evaporación de la mezcla de reacción, agregue aceite de alto punto de ebullición, como vaselina, al tubo de ensayo. Si está utilizando un termociclador con tapa calentada, esto no es necesario.

La adición de pirofosfatasa puede aumentar el rendimiento de la reacción de PCR. Esta enzima cataliza la hidrólisis del pirofosfato, un subproducto de la adición de nucleótidos trifosfato a la cadena de ADN en crecimiento, a ortofosfato. El pirofosfato puede inhibir la reacción de PCR.

Imprimaciones

La especificidad de la PCR se basa en la formación de complejos complementarios entre el molde y los cebadores, oligonucleótidos sintéticos cortos de 18 a 30 bases de largo. Cada uno de los cebadores es complementario a una de las hebras del molde bicatenario y limita el comienzo y el final de la región amplificada.

Después de la hibridación del molde con el cebador (hibridación), este último sirve como cebador para la ADN polimerasa durante la síntesis de la cadena molde complementaria (ver).

La característica más importante de los cebadores es la temperatura de fusión (Tm) del complejo cebador-matriz. Tm es la temperatura a la que la mitad de los moldes de ADN forman un complejo con el cebador oligonucleotídico. La temperatura de fusión se puede determinar aproximadamente mediante la fórmula , donde n X es el número de nucleótidos X en el cebador. Si la longitud y la composición de nucleótidos del cebador o la temperatura de hibridación se seleccionan incorrectamente, es posible la formación de complejos parcialmente complementarios con otras regiones del ADN molde, lo que puede conducir a la aparición de productos inespecíficos. El límite superior de la temperatura de fusión está limitado por la temperatura óptima de acción de la polimerasa, cuya actividad disminuye a temperaturas superiores a 80 °C.

Al elegir imprimaciones, es recomendable seguir los siguientes criterios:

Amplificador

Arroz. 1: Ciclador para PCR

La PCR se lleva a cabo en un termociclador, un dispositivo que proporciona enfriamiento y calentamiento periódicos de los tubos de ensayo, generalmente con una precisión de al menos 0,1 °C. Los cicladores modernos le permiten configurar programas complejos, incluida la capacidad de "arranque en caliente", PCR Touchdown (ver más abajo) y almacenamiento posterior de moléculas amplificadas a 4 °C. Para la PCR en tiempo real se fabrican dispositivos equipados con un detector fluorescente. También existen dispositivos con tapa automática y compartimento para microplacas, lo que permite integrarlas en sistemas automatizados.

Progreso de la reacción.

Fotografía de un gel que contiene ADN marcador (1) y productos de reacción de PCR (2,3). Los números muestran la longitud de los fragmentos de ADN en pares de nucleótidos.

Normalmente, la PCR implica de 20 a 35 ciclos, cada uno de los cuales consta de tres etapas (Fig. 2).

Desnaturalización

La plantilla de ADN bicatenario se calienta a 94-96°C (o a 98°C si se utiliza una polimerasa particularmente termoestable) durante 0,5-2 minutos para separar las cadenas de ADN. Esta etapa se llama desnaturalización, ya que se destruyen los enlaces de hidrógeno entre las dos cadenas de ADN. A veces, antes del primer ciclo (antes de agregar la polimerasa), la mezcla de reacción se precalienta durante 2 a 5 minutos. para una desnaturalización completa de la plantilla y los cebadores. Esta técnica se llama arranque en caliente, le permite reducir la cantidad de productos de reacción inespecíficos.

Recocido

Una vez que las hebras se han separado, se reduce la temperatura para permitir que los cebadores se unan a la plantilla monocatenaria. Esta etapa se llama recocido. La temperatura de recocido depende de la composición de las imprimaciones y normalmente se selecciona entre 4 y 5 °C por debajo de su temperatura de fusión. Tiempo de etapa: 0,5-2 minutos. Una elección incorrecta de la temperatura de recocido conduce a una mala unión de los cebadores a la plantilla (a una temperatura demasiado alta) o a una unión en el lugar equivocado y a la aparición de productos inespecíficos (a una temperatura demasiado baja).

Alargamiento

Tipos de PCR

La PCR “nested” (PCR anidada) se utiliza para reducir la cantidad de subproductos de la reacción. Se utilizan dos pares de cebadores y se llevan a cabo dos reacciones secuenciales. El segundo par de cebadores amplifica una región de ADN dentro del producto de la primera reacción.
PCR “invertida” (PCR inversa): se utiliza si solo se conoce una pequeña región dentro de la secuencia deseada. Este método es particularmente útil cuando se trata de determinar secuencias vecinas después de que el ADN se haya insertado en el genoma. Para realizar la PCR invertida se realizan una serie de cortes de ADN con enzimas de restricción, seguido de la unión de fragmentos (ligación). Como resultado, los fragmentos conocidos terminan en ambos extremos de la región desconocida, después de lo cual se puede realizar la PCR como de costumbre.
La PCR de transcripción inversa (RT-PCR) se utiliza para amplificar, aislar o identificar una secuencia conocida de una biblioteca de ARN. Antes de la PCR convencional, se sintetiza una molécula de ADN monocatenario en un molde de ARNm utilizando reversasa y se obtiene un ADNc monocatenario, que se utiliza como molde para la PCR. Este método a menudo determina dónde y cuándo se expresan estos genes.
PCR asimétrica PCR asimétrica) - se lleva a cabo cuando es necesario amplificar predominantemente una de las cadenas de ADN de origen. Utilizado en algunas técnicas de secuenciación y análisis de hibridación. La PCR se lleva a cabo como de costumbre, excepto que uno de los cebadores se toma en gran exceso.
La PCR cuantitativa (Q-PCR) se utiliza para medir rápidamente la cantidad de ADN, ADNc o ARN específico en una muestra.
PCR cuantitativa en tiempo real: este método utiliza reactivos marcados con fluorescencia para medir con precisión la cantidad de producto de reacción a medida que se acumula.
Touchdown (Stepdown) PCR (Touchdown PCR): con este método, se reduce el efecto de la unión no específica de los cebadores en la formación del producto. Los primeros ciclos se llevan a cabo a una temperatura superior a la temperatura de recocido, luego la temperatura se reduce cada pocos ciclos. A una determinada temperatura, el sistema pasará a través de la banda de especificidad óptima del cebador para el ADN.
Método de colonias moleculares (PCR en gel, inglés. Polonia - Colonia PCR) - se polimeriza gel de acrilamida con todos los componentes de la PCR en la superficie y se lleva a cabo la PCR. En los puntos que contienen el ADN analizado se produce una amplificación con la formación de colonias moleculares.
PCR con amplificación rápida de los extremos del ADNc Amplificación rápida de extremos de ADNc, RACE-PCR )
PCR de fragmento largo PCR de largo alcance) - una modificación de la PCR para la amplificación de secciones extendidas de ADN (10 mil bases o más). Se utilizan dos polimerasas, una de las cuales es la Taq polimerasa con alta procesividad (es decir, capaz de sintetizar una larga cadena de ADN en un solo paso), y la segunda es la ADN polimerasa con actividad endonucleasa de 3"-5". La segunda polimerasa es necesaria para corregir los errores introducidos por la primera.
PCR RAPD Amplificación aleatoria de PCR de ADN polimórfico , PCR con amplificación aleatoria de ADN polimórfico: se utiliza cuando es necesario distinguir entre organismos que tienen una secuencia genética cercana, por ejemplo, diferentes variedades de plantas cultivadas, razas de perros o microorganismos estrechamente relacionados. Este método suele utilizar un cebador pequeño (20 - 25 pb). Este cebador será parcialmente complementario a secciones aleatorias del ADN de los organismos en estudio. Seleccionando las condiciones (longitud del cebador, su composición, temperatura, etc.), es posible lograr una diferencia satisfactoria en el patrón de PCR para dos organismos.

Si la secuencia de nucleótidos de la plantilla es parcialmente conocida o desconocida, puede utilizar cebadores degenerados, cuya secuencia contiene posiciones degeneradas en las que se puede ubicar cualquier base. Por ejemplo, la secuencia del cebador podría ser: ...ATH..., donde H es A, T o C.

Aplicación de la PCR

La PCR se utiliza en muchas áreas para pruebas y experimentos científicos.

forense

La PCR se utiliza para comparar las llamadas “huellas genéticas”. Se requiere una muestra de material genético de la escena del crimen: sangre, saliva, semen, cabello, etc. Esto se compara con el material genético del sospechoso. Una cantidad muy pequeña de ADN es suficiente, en teoría una copia. El ADN se descompone en fragmentos y luego se amplifica mediante PCR. Los fragmentos se separan mediante electroforesis de ADN. La imagen resultante de la disposición de las bandas de ADN se llama huella genética(Inglés) huella genética).

Estableciendo la paternidad

Arroz. 3: Resultados de electroforesis de fragmentos de ADN amplificados por PCR. (1) Padre. (2) Niño. (3) Madre. El niño heredó algunas características de la huella genética de ambos padres, lo que dio como resultado una huella nueva y única.

Aunque las huellas genéticas son únicas (excepto en el caso de gemelos idénticos), todavía se pueden establecer relaciones familiares tomando varias huellas dactilares (Figura 3). Se puede aplicar el mismo método, ligeramente modificado, para establecer relaciones evolutivas entre organismos.

Diagnóstico médico

La PCR permite acelerar y facilitar significativamente el diagnóstico de enfermedades hereditarias y virales. El gen de interés se amplifica mediante PCR utilizando cebadores apropiados y luego se secuencia para identificar mutaciones. Las infecciones virales se pueden detectar inmediatamente después de la infección, semanas o meses antes de que aparezcan los síntomas.

Medicina personalizada

Se sabe que la mayoría de los fármacos no actúan sobre todos los pacientes a los que están destinados, sino sólo entre el 30 y el 70% de ellos. Además, muchos medicamentos resultan tóxicos o alergénicos para algunos pacientes. Las razones de esto se deben en parte a diferencias individuales en la susceptibilidad y el metabolismo de los fármacos y sus derivados. Estas diferencias están determinadas a nivel genético. Por ejemplo, en un paciente, un determinado citocromo (una proteína del hígado responsable de metabolizar sustancias extrañas) puede ser más activo, en otro, menos. Para determinar qué tipo de citocromo tiene un paciente determinado, se propone realizar un análisis de PCR antes de utilizar el medicamento. Este análisis se llama genotipado preliminar. genotipado prospectivo).

Clonación de genes

La clonación de genes (que no debe confundirse con la clonación de organismos) es el proceso de aislar genes y, como resultado de manipulaciones de ingeniería genética, obtener una gran cantidad del producto de un gen determinado. La PCR se utiliza para amplificar un gen, que luego se inserta en vector- un fragmento de ADN que transfiere un gen extraño al mismo organismo u otro conveniente para el cultivo. Como vectores se utilizan, por ejemplo, plásmidos o ADN viral. La inserción de genes en un organismo extraño suele utilizarse para producir el producto de ese gen: ARN o, con mayor frecuencia, una proteína. De esta forma se obtienen muchas proteínas en cantidades industriales para su uso en agricultura, medicina, etc.

Arroz. 4: Clonación de genes mediante un plásmido. .
(1) ADN cromosómico del organismo A. (2) PCR. (3) Muchas copias del gen del organismo A. (4) Inserción del gen en un plásmido. (5) Plásmido con el gen del organismo A. (6) Introducción del plásmido en el organismo B. (7) Multiplicación del número de copias del gen del organismo A en el organismo B.

secuencia ADN

En el método de secuenciación que utiliza didesoxinucleótidos marcados con un marcador fluorescente o un isótopo radiactivo, la PCR es una parte integral, ya que es durante la polimerización que los derivados de nucleótidos marcados con un marcador fluorescente o radiactivo se insertan en la cadena de ADN. Esto detiene la reacción, permitiendo determinar las posiciones de nucleótidos específicos después de que las cadenas sintetizadas se separen en el gel.

mutagénesis

Actualmente, la PCR se ha convertido en el principal método para realizar la mutagénesis. El uso de la PCR ha permitido simplificar y acelerar el procedimiento de mutagénesis, además de hacerlo más fiable y reproducible.