ניתוח אימונובלוט. שיטות מודרניות לאבחון זיהום ב-HIV

אבחון בזמן של זיהום HIV הופך למדד חשוב ביותר, שכן טיפול מוקדם יותר יכול לקבוע במידה רבה את המשך התפתחות המחלה ולהאריך את חיי המטופל. בשנים האחרונות חלה התקדמות משמעותית בתחום גילוי המחלה הנוראה הזו: מערכות הבדיקה הישנות מוחלפות במתקדמות יותר, שיטות הבדיקה נעשות נגישות יותר ודיוקן עולה משמעותית.

במאמר זה, נדבר על שיטות מודרניות לאבחון זיהום ב-HIV, אשר מועילות לדעת לטיפול בזמן בבעיה זו ושמירה על איכות החיים התקינה של המטופל.

שיטות לאבחון HIV

ברוסיה, לאבחון זיהום HIV, מתבצע הליך סטנדרטי הכולל שתי רמות:

  • מערכת בדיקת ELISA (ניתוח סקר);
  • סופג חיסון (IB).

ניתן להשתמש גם בשיטות אבחון אחרות:

  • מבחנים אקספרס.

מערכות בדיקת ELISA

בשלב הראשון של האבחון, בדיקת סקר (ELISA) משמשת לאיתור זיהום ב-HIV, המבוססת על חלבוני HIV שנוצרים במעבדות הלוכדות נוגדנים ספציפיים המיוצרים בגוף בתגובה לזיהום. לאחר האינטראקציה שלהם עם הריאגנטים (אנזימים) של מערכת הבדיקה, צבע המחוון משתנה. יתר על כן, שינויי צבע אלה מעובדים בציוד מיוחד, הקובע את תוצאת הניתוח שבוצע.

בדיקות ELISA כאלה מסוגלות להראות תוצאות תוך מספר שבועות לאחר כניסת זיהום HIV. ניתוח זה אינו קובע את נוכחות הנגיף, אלא מזהה ייצור של נוגדנים אליו. לעיתים, בגוף האדם, ייצור הנוגדנים ל-HIV מתחיל לאחר שבועיים לאחר ההדבקה, אך אצל רוב האנשים הם מיוצרים במועד מאוחר יותר, לאחר 3-6 שבועות.

ישנם ארבעה דורות של בדיקות ELISA עם רגישויות שונות. בשנים האחרונות נעשה שימוש תכוף יותר במערכות בדיקה מדור III ו-IV, המבוססות על פפטידים סינתטיים או חלבונים רקומביננטיים ובעלות ספציפיות ודיוק גבוהים יותר. ניתן להשתמש בהם כדי לאבחן זיהום ב-HIV, לנטר את שכיחות ה-HIV ולהבטיח בטיחות בעת בדיקת דם שנתרם. הדיוק של מערכות בדיקת ELISA דורות III ו-IV הוא 93-99% (רגישות יותר הן הבדיקות שמיוצרות במערב אירופה - 99%).

לביצוע בדיקת ELISA נלקחים 5 מ"ל דם מהוריד המטופל. בין הארוחה האחרונה לניתוח צריך להיות לפחות 8 שעות (ככלל, זה מבוצע בבוקר על בטן ריקה). בדיקה כזו מומלץ לבצע לא לפני 3 שבועות לאחר ההדבקה לכאורה (לדוגמה, לאחר קיום יחסי מין לא מוגנים עם בן זוג חדש).

תוצאות בדיקת ELISA מתקבלות לאחר 2-10 ימים:

  • תוצאה שלילית: מעידה על היעדר זיהום ב-HIV ואינה דורשת הפניה למומחה;
  • תוצאה שלילית שגויה: ניתן להבחין בשלבים המוקדמים של הזיהום (עד 3 שבועות), בשלבים המאוחרים יותר של איידס עם דיכוי חיסוני חמור ועם הכנת דם לא נכונה;
  • תוצאה חיובית שגויה: ניתן להבחין בה במחלות מסוימות ובמקרה של הכנת דם לא נכונה;
  • תוצאה חיובית: מעידה על הידבקות ב-HIV, מחייבת IB והפניית המטופל למומחה במרכז לאיידס.

מדוע בדיקת ELISA יכולה לתת תוצאות חיוביות שגויות?

ניתן לראות תוצאות חיוביות שגויות של בדיקת ELISA ל-HIV עם עיבוד לא תקין של דם או בחולים עם מצבים ומחלות כאלה:

  • מיאלומה נפוצה;
  • מחלות זיהומיות שנגרמו על ידי נגיף אפשטיין-בר;
  • מדינה אחרי;
  • מחלות אוטואימוניות;
  • על רקע הריון;
  • מצב לאחר חיסון.

מהסיבות שתוארו לעיל, נוגדנים לא ספציפיים בעלי תגובה צולבת עשויים להיות נוכחים בדם, שייצורם לא עורר על ידי זיהום HIV.

בשנים האחרונות ירדה באופן משמעותי תדירות התוצאות החיוביות הכוזבות עקב שימוש במערכות בדיקות מדור III ו-IV, המכילות פפטיד וחלבונים רקומביננטיים רגישים יותר (הם מסונתזים באמצעות הנדסה גנטית חוץ גופית). לאחר השימוש בבדיקות ELISA כאלה, שכיחות התוצאות החיוביות השגויות ירדה משמעותית והיא כ-0.02-0.5%.

תוצאה חיובית כוזבת אינה אומרת שאדם נגוע ב-HIV. במקרים כאלה, ארגון הבריאות העולמי ממליץ על בדיקת ELISA נוספת (דור IV חובה).

הדם של המטופל נשלח למעבדת התייחסות או בוררות המסומנת "חזרה" ונבדק על מערכת בדיקת ELISA דור IV. אם התוצאה של הניתוח החדש שלילית, אז התוצאה הראשונה מזוהה כשגויה (חיובי שגוי) ו-IB לא מבוצע. אם התוצאה חיובית או מפוקפקת במהלך הבדיקה השנייה, המטופל נדרש לעבור IB תוך 4-6 שבועות כדי לאשר או להפריך זיהום ב-HIV.

סיכה חיסונית

אבחנה סופית של זיהום ב-HIV יכולה להיעשות רק לאחר קבלת תוצאה חיובית של ספיגת מערכת החיסון (IB). ליישומו, נעשה שימוש ברצועת ניטרוצלולוזה, עליה מורחים חלבונים ויראליים.

דגימת דם ל-IB מתבצעת מוריד. לאחר מכן הוא עובר טיפול מיוחד והחלבונים הכלולים בסרום שלו מופרדים בג'ל מיוחד לפי מטען ומשקלם המולקולרי (המניפולציה מתבצעת בציוד מיוחד בהשפעת שדה חשמלי). רצועת ניטרוצלולוזה מונחת על הג'ל בסרום הדם והספיגה ("ספיגה") מתבצעת בתא מיוחד. הרצועה עוברת עיבוד ואם החומרים המשמשים מכילים נוגדנים ל-HIV, הם נקשרים לרצועות האנטיגניות ב-IB ומופיעים כקווים.

IB נחשב חיובי אם:

  • על פי קריטריונים של CDC אמריקאי - יש שתיים או שלוש שורות gp41, p24, gp120 / gp160 על הרצועה;
  • לפי קריטריונים של ה-FDA האמריקאי - יש שני קווים p24, p31 וקו gp41 או gp120 / gp160 על הרצועה.

ב-99.9% מהמקרים, תוצאה חיובית של IB מצביעה על זיהום ב-HIV.

בהיעדר שורות - IB הוא שלילי.

כאשר מזהים קווים עם gp160, gp120 ו-gp41, IB מוטל בספק. ניתן לזהות תוצאה כזו כאשר:

  • מחלות אונקולוגיות;
  • הֵרָיוֹן;
  • עירויי דם תכופים.

במקרים כאלה, מומלץ לבצע מחקר שני באמצעות ערכה של חברה אחרת. אם לאחר IB נוסף, התוצאה נותרת בספק, אזי יש צורך במעקב במשך שישה חודשים (IB מתבצע כל 3 חודשים).

תגובת שרשרת פולימראז

בדיקת PCR יכולה לזהות את ה-RNA של הנגיף. הרגישות שלו די גבוהה והוא מאפשר לזהות זיהום ב-HIV כבר 10 ימים לאחר ההדבקה. במקרים מסוימים, PCR יכול לתת תוצאות חיוביות שגויות, מכיוון שהרגישות הגבוהה שלו יכולה להגיב גם לנוגדנים לזיהומים אחרים.

טכניקת אבחון זו יקרה, דורשת ציוד מיוחד ומומחים מוסמכים ביותר. סיבות אלו אינן מאפשרות לבצע אותה במהלך בדיקות המוניות של האוכלוסייה.

PCR משמש במקרים כאלה:

  • לגלות HIV בילודים שנולדו לאמהות נגועות ב-HIV;
  • לגלות HIV ב"תקופת החלון" או במקרה של ספק IB;
  • לשלוט בריכוז HIV בדם;
  • לחקר דם תורם.

רק על ידי בדיקת PCR, האבחנה של HIV אינה מתבצעת, אלא מתבצעת כשיטת אבחון נוספת ליישוב מחלוקות.


שיטות אקספרס

אחד החידושים באבחון HIV הפך לבדיקות מהירות, שניתן להעריך את תוצאותיהן תוך 10-15 דקות. התוצאות היעילות והמדויקות ביותר מתקבלות בבדיקות אימונוכרומטוגרפיות המבוססות על עקרון הזרימה הנמית. הם רצועות מיוחדות שעליהן מורחים דם או נוזלי בדיקה אחרים (רוק, שתן). בנוכחות נוגדנים ל-HIV, לאחר 10-15 דקות, מופיע פס צבעוני ובקרה בבדיקה - תוצאה חיובית. אם התוצאה שלילית, רק שורת הבקרה מופיעה.

כמו בבדיקות ELISA, יש לאשר את תוצאות הבדיקה המהירות על ידי ניתוח IB. רק אז ניתן לאבחן זיהום ב-HIV.

יש ערכות אקספרס לבדיקה ביתית. בדיקת OraSure Technologies1 (ארה"ב) מאושרת על ידי ה-FDA, זמינה ללא מרשם וניתן להשתמש בה כדי לזהות HIV. לאחר הבדיקה, במקרה של תוצאה חיובית, מומלץ למטופל לעבור בדיקה במרכז מומחה לאישור האבחנה.

שאר הבדיקות לשימוש ביתי טרם אושרו על ידי ה-FDA והתוצאות שלהן עשויות להיות מוטלות בספק רב.

למרות העובדה שבדיקות מהירות נחותות בדייקנות מבדיקות ELISA דור IV, הן נמצאות בשימוש נרחב לבדיקות נוספות של האוכלוסייה.

ניתן להיבדק להידבקות ב-HIV בכל מרפאה, בבית החולים האזורי המרכז או במרכזי איידס מיוחדים. בשטחה של רוסיה, הם מוחזקים בסודיות מוחלטת, או בעילום שם. כל מטופל יכול לצפות לקבל ייעוץ רפואי או פסיכולוגי לפני או אחרי הניתוח. עבור בדיקות HIV תצטרכו לשלם רק במוסדות רפואיים מסחריים, ובמרפאות ציבוריות ובבתי חולים הן מתבצעות ללא תשלום.

למידע על איך אתה יכול להידבק ב-HIV ואיזה מיתוסים קיימים לגבי האפשרויות להידבק, קרא

דם נלקח מוריד. לאחר מכן המחקר מתבצע על פי ההנחיות:

  • הדגימה מונחת בג'ל להפרדה אלקטרופורטית, וכתוצאה מכך נוצרים חלבונים ספציפיים הרגישים לנגיף;
  • נייר ניטרוצלולוזה מוחל על הג'ל המטופל;
  • הדגימה המוכנה ממוקמת במנגנון לספיגה.

כדי לזהות אנזימים ספציפיים, יש צורך להכין נייר כראוי למחקר מעבדה. לשם כך, מורחים עליו נוגדנים וצימוד רדיואקטיבי מסומן. תוצאת המחקר מוערכת ויזואלית, שרשראות האנזימים הבנויות נבדקות.

פענוח התוצאות

לאחר המניפולציות נשארו פסים על הנייר. הם ממוקמים במקום שבו התרחש הצימוד, כלומר, התרופה המיושמת הגיבה עם חלבון הנגיף. בדרך זו ניתן לזהות חלקים מהחלבון:

  • מהליבת HIV-1 - p17, p24, p55;
  • הגורם הסיבתי של HIV-2 - p16, p26, p56.

תוצאות הכתם המערבי נחשבות לחיוביות אם מתגלים 2 מתוך 3 חלבוני HIV-1 או HIV-2. מכיוון ש-Western blot (השם השני של המחקר) משמש לעתים קרובות כדי לאשר ELISA חיובי, התגובה נבדקת עבור חלבונים ספציפיים: gp120 / 160, gp41 או p24. הם חלק משלושת הגנים העיקריים של איידס - gag, pol ו-env. במהלך האבחון הראשוני, הבדיקה מתבצעת רק עבור חלבונים p25, gp110 / 120 ו-gp160, אם היא נתנה תוצאה חיובית, אז הבדיקה מתבצעת עבור p24. חלק זה של החלבון מאפשר לזהות את הנגיף בשלב מוקדם.

תוצאה חיובית היא סיבה לפנות לאבחון מורכב יותר. זה שקרי רק ב-3 מקרים:

  • בחולים עם רמות בילירובין גבוהות;
  • במגע עם אנטיגנים ויראליים;
  • בפתולוגיות של רקמת חיבור.


אם למטופל אין קווים התואמים לחלבוני איידס, התוצאה מוערכת כשלילית. המשמעות היא שהאדם אינו נגוע ב-HIV או נמצא ב"תקופת חלון". המשמעות האחרונה היא שהנגיף יכול לחדור לגוף, אך עדיין לא להתפתח בו. כדי לשפר את דיוק האבחון, נעשה שימוש במערכות בדיקה:

  • רקומביננטי-HIV;
  • אַנְטִיגֵן;
  • פפטומסך.

לאחר בדיקתם, התוצאה נספרת כשלילית אם לא נמצאו חלבונים gp120, gp160, Sp4 בדגימה.

ישנה אפשרות פרשנות נוספת - תוצאה ניטרלית או מפוקפקת. זה מתרחש אצל אלה שהיו במגע מיני עם בן זוג נגוע ב-HIV. בדמם נמצאים נוגדנים לחלבוני gp120 ו-gp160. כמו כן, תשובה מפוקפקת כאשר סופג ניתנת כאשר הזיהום הוא אסימפטומטי, כלומר, הוא במצב רדום.

חשוב להעמיד תוצאה מפוקפקת לבדיקה יסודית. לשם כך, השתמש במחקר של סרום הדם בדינמיקה, כלומר, בדיקות קבועות על ידי אימונובלוטינג ו-ELISA במשך שישה חודשים. כמו כן נקבעות בדיקות נוספות, שכן נוכחותם של נוגדנים עצמיים וקומפלקסים חיסוניים בדם עשויים לנבוע מ:

  • מחלות מדבקות;
  • נוכחות של גידולים סרטניים;
  • אלרגיות.
ערכת מגיב MPBA-Blot-HIV-1, HIV-2 מיועדת לאשר זיהוי של נוגדנים לחלבונים בודדים (אנטיגנים) מקבוצת HIV-1 ו/או HIV-1 O ו/או HIV-2 בסרום אנושי או פלזמה בשיטת immune blot.

תכונות ייחודיות:

  • סט הריאגנטים "MPBA - Blot - HIV-1, HIV-2" מכיל חלבונים נגיפיים lysate מטוהרים של HIV 1 ופפטיד - HIV-2 gp36 antigenic determinate;
  • מספק זיהוי של נוגדנים ל-HIV-1, HIV-1 קבוצת O, HIV 2 ברצועה אחת;
  • הליך פשוט להכנה וביצוע ניתוחים;
  • בקרת איכות פנימית של התגובה*
  • המהירות המרבית של הניתוח (3 שעות);
  • נפח קטן של דגימת הבדיקה - 20 μl;
  • אינו דורש ציוד נוסף למחקר;
  • איכות הערכה מובטחת על ידי שימוש בדוגמאות תקן רוסי ובינלאומי**

* בקרת איכות פנימית מובטחת על ידי נוכחותם של:

  • רצועות בקרה פנימיות, מספקות בקרה על החדרת דגימת סרום או פלזמה;
  • סרום שלילי בקרה (K-);
  • סרום שליטה חיובי (K+), המאפשר לזהות את הרצועות שזוהו על הרצועה;
  • שליטה בסרום חיובי חלש (K + cl), המספק שליטה על הרגישות של ערכת הריאגנטים.

**בקרת איכות:

המאפיינים של ערכת מגיב MPBA-Blot-HIV-1, HIV-2 נקבעו על ידי בדיקת דגימות ממדגם אקראי של תורמים, חולים שאובחנו עם זיהום ב-HIV, פאנלים מסחריים להמרת סרוק, פאנלים סטנדרטיים ודגימות עם "הפרעות פוטנציאליות ל- רכיבי נחישות".

ערכת הריאגנטים אינה נותנת תוצאות חיוביות כוזבות במחקר של סמים של הפאנל הסטנדרטי שאינם מכילים נוגדנים לאנטיגן HIV 1.2 ו-HIV-1 ("Standard AT (-) HIV", מס' FSR 2007/00953 מ-10/ 25/2007). ספציפיות - 100%.

הספציפיות האבחנתית נקבעה על ידי מחקר מדגם אקראי של 200 תורמים ממרכזי דם שונים ומרפאות עם היעדר מאושר ראשוני של זיהום HIV-1, HIV-2. הספציפיות במחקר של מדגם אקראי של תורמים הייתה 100%;

הספציפיות של ערכת הריאגנטים נקבעה במחקר של 250 דגימות, כולל דגימות סרום או פלזמה שהתקבלו מנשים בהריון, חולים מאושפזים, חולים עם הפטיטיס C ו-E ודגימות בעלות רכיבים "היכולים להפריע לקביעה". בעת שימוש בערכת MPBA-Blot-HIV-1, HIV-2, לא נמצאו תוצאות חיוביות כוזבות עבור דגימות אלו.

רגישות אבחון נקבעה באמצעות:
- Boston Biomedica, Inc. דגימות פלזמה של פאנל HIV-1 (WWRB 301) מאזורים שונים המכילים תת-סוגים שונים של HIV-1: קבוצה M (תת-סוגים A, B, C, D, E, F) וקבוצה O; הרגישות של ערכת הריאגנטים הייתה 100%;

הרגישות של ערכת הריאגנטים נקבעה במחקר של פאנלים בינלאומיים להמרת סירו. Boston Biomedica, Inc (SeraCare Life Sciences), קט. מס' PRB 903, PRB 904, PRB 909, PRB 912, PRB 916, PRB 917, PRB 918, PRB 919, PRB 921, PRB 923, PRB 924, PRB 927, PRB 928, PRB 9320, PRB 9320

ערכת הריאגנטים מזהה נוגדנים ל-HIV-1 בסרה של פאנל סטנדרטי המכיל נוגדנים ל-HIV-1 ("Standard AT (+) HIV-1", מס' FSR 2007/00953 מיום 25 באוקטובר 2007), מזהה נוגדנים ל-HIV-2 בסרה של הפאנל הסטנדרטי המכיל נוגדנים ל-HIV-2 ("Standard AT (+) HIV-2", מס' FSR 2007/00953 מיום 25/10/2007). רגישות - 100%.

תעודת רישום מס' FSR 2010/07958 מיום 13 ביולי 2011 (תוקפו אינו מוגבל)

מתחם:

  • אימונוסורבנט. רצועות קרום ניטרוצלולוזה לבנות עם חלבוני HIV-1 בודדים (gp160, gp120, p66, p55, p51, gp41, p31, p24, p17) נספגים עליהם בשיטת ההעברה האלקטרונית ומורחים על הרצועה עם פפטיד HIV-2 סינתטי, אנלוגי של חלבון gp36 ואנטי-IgG אנושי (שליטה פנימית) - 18 יח';
  • K- - סרום שלילי בקרה. סרום דם אנושי שאינו מכיל נוגדנים ל-HIV-1,2, HCV, אנטיגן HIV, HBsAg, מושבת על ידי חימום ב-560C; נוזל צהוב בהיר שקוף - 1 מבחנה (0.08 מ"ל). מכיל חומרים משמרים: תימרוסל ונתרן אזיד;
  • K+ - סרום חיובי לבקרה. סרום דם אנושי המכיל נוגדנים ל-HIV-1,2 (טיטר לא פחות מ-1:10000), שאינו מכיל HBsAg, אנטיגן HIV, נוגדנים ל-HCV, מושבתים בחימום ב-560C; נוזל שקוף צהוב בהיר - 1 מבחנה (0.08 מ"ל). מכיל חומרים משמרים: תימרוסל ונתרן אזיד;
  • K+sl - שליטה בסרום חיובי חלש. סרום דם אנושי המכיל נוגדנים ל-HIV-1,2 (טיטר לא יותר מ-1:200), שאינו מכיל HBsAg, אנטיגן HIV, נוגדנים ל-HCV, מושבתים בחימום ב-560C; נוזל צהוב בהיר שקוף - 1 מבחנה (0.08 מ"ל). מכיל חומרים משמרים: תימרוסל ונתרן אזיד;
  • RROKk (x10) - תמיסה לדילול דגימות וצימוד. תרכיז - חיץ טריס המכיל סרום עיזים רגיל שטופל מראש; נוזל אפור אטום - בקבוקון 1 (10 מ"ל). מכיל חומר משמר: תימרוסל;
  • PRk (x20) - תמיסת כביסה. תרכיז - Tris buffer המכיל Tween-20; נוזל צלול חסר צבע - בקבוקון אחד (70 מ"ל). מכיל חומר משמר: תימרוסל;
  • לְהַטוֹת. נוגדני עיזים ל-IgG אנושי, מצומדים עם פוספטאז אלקליין; נוזל צלול חסר צבע - 1 מבחנה (0.06 מ"ל);
  • מצע (תמיסת צביעה). תמיסה של 5-ברומו-4-פלואורו-אינדוליל-פוספט (BCIP) וניטרוזין טטרזוליום (NBT); נוזל צהוב בהיר שקוף - בקבוקון 1 (50 מ"ל);
  • אבקה לספיגה חיסונית. אבקת חלב רזה - אבקה לבנה אמורפית או צהובה בהירה - 5 חבילות x 1 גרם;
  • טבליה עם מכסה להגדרת תגובה - 2 חתיכות;
  • פינצטה מפלסטיק - 1 חתיכה.

אימונובלוטינג -(מהאנגלית "blot" - נקודה) - שיטה לזיהוי אנטיגנים (או נוגדנים) באמצעות סמים (או אנטיגנים) ידועים. זהו שילוב של אלקטרופורזה ג'ל עם ELISA. בתחילה, תאים חיידקיים או ויריון מושמדים באמצעות אולטרסאונד, ולאחר מכן כל האנטיגנים של הנגיף או תאי החיידק מופרדים על ידי אלקטרופורזה ומתקבל מגיב מסחרי על סרט ניטרוצלולוזה מיוחד. בעת הגדרת immunoblotting, סרום הבדיקה של המטופל מוחל על הסרט עם אנטיגנים ידועים. לאחר דגירה ושטיפה של נוגדנים לא קשורים, הם ממשיכים ל-ELISA - אנטי-סרום לאימונוגלובולינים אנושיים המסומנים באנזים ומצע כרומוגני שמשנה את צבעו בעת אינטראקציה עם האנזים מורחים על הסרט. בנוכחות אנטיגן-נוגדנים-אנטיסרום לקומפלקסים של אימונוגלובולינים-אנזים, מופיעים כתמים צבעוניים על הנשא. השיטה של ​​immunoblotting מאפשרת לך לזהות בנפרד נוגדנים לאנטיגנים שונים של הפתוגן (לדוגמה, בזיהום HIV, immunoblotting מזהה נוגדנים ל-gp120, gp24 ואנטיגנים אחרים של הנגיף).

בדיקת רדיואימוניה (RIA)

השיטה מבוססת על תגובת אנטיגן-נוגדן באמצעות אנטיגן או תווית נוגדן עם רדיונוקליד. 125I, 14C, 3H, 51Cr ורדיונוקלידים אחרים משמשים כתווית. הקומפלקסים החיסונים המתקבלים מבודדים מהמערכת והרדיואקטיביות שלהם נקבעת על מונים (קרינת β). עוצמת הקרינה עומדת ביחס ישר למספר מולקולות האנטיגן והנוגדנים הקשורים.

גרסת הפאזה המוצקה של RIA באמצעות נוגדנים מסומנים או אנטיגנים הנספגים בבארות של לוחות פוליסטירן נמצאת בשימוש נרחב.

RIA משמש לאיתור אנטיגנים של חיידקים, וירוסים, הורמונים שונים, אנזימים, חומרים רפואיים, אימונוגלובולינים, וכן חומרים אחרים הכלולים בחומר הבדיקה בריכוזים קלים של 10-12-10-15 גרם/ליטר.

שאלות בקרה

תגובת בקטריוליזה חיסונית: איזה סוג של תגובה היא; מהו אנטיגן, מהו נוגדן, מנגנון תגובה, שיטות הגדרה, יישום מעשי. תגובת המוליזה חיסונית: מרכיבים נחוצים, שיטת ההגדרה; בקרות, יישום מעשי. תגובה של המוליזה מקומית בג'ל (תגובת Yerne): עקרון התגובה, שיטת הניסוח, יישום מעשי. תגובת קיבוע משלים: עקרון התגובה; מה נוצר כאשר הסרום החיסוני יוצר אינטראקציה עם אנטיגן ספציפי; מה קורה להשלים אם הוא נוכח באינטראקציה הזו? מה גורלו של המשלים אם אין זיקה ספציפית בין אנטיגן לנוגדנים? באיזו תגובה ניתן להשתמש כדי לקבוע מה קרה למשלים; מדוע משתמשים בתגובה זו; מהי התוצאה החיובית הנראית לעין של RSK? למה? באיזו תכונה של משלים נעשה שימוש בשלב הראשון של CSC? בשלב השני? אם התוצאה הסופית של RSK היא המוליזה, האם זה אומר תוצאה חיובית או שלילית? הסבר את התוצאות: RSK+ + + +, RSK+ + +, RSK+ +, RSK+. שם את המרכיבים של מערכת RSK הראשונה ואת המרכיבים של מערכת RSK השנייה. מדוע צריך להשבית את סרום הבדיקה? כיצד מתבצע טיטרציה של המשלים? סרום המוליטי: מה הוא מכיל, איך הוא מתקבל, מהו טיטר וכיצד הוא נקבע? באילו בעלי חיים משתמשים כדי להשיג רכיבי RSC? הטכניקה של הגדרת RSC בקור. כאשר מביים איזו מהתגובות הבאות, יש צורך בהשתתפות של משלים: משקעים, צפצופים, צבירה, זיהוי של נוגדנים לא שלמים, בקטריוליזה חיסונית, המוליזה חיסונית, Jerne, CSC? תגובת אימונופלואורסצנציה (RIF) - מציינת את רצף האירועים בתגובת הקונס הישירה; המרכיבים הדרושים. מהו אנטיגן, מהו נוגדן, כיצד מסומנים נוגדנים, כיצד נלקחת בחשבון תוצאת התגובה, כיצד נראית תוצאה חיובית? יישום מעשי - מה ניתן לקבוע באמצעות תגובה זו? תגובה אימונופלואורסצנטית עקיפה - ציינו את רצף האירועים בתגובה זו, המרכיבים הדרושים, מהו האנטיגן, באיזה סרה חיסונית משתמשים; שימוש מעשי; יתרון של RIF עקיף על פני תגובה ישירה. Assay immunoassay אנזים (ELISA) - עקרון התגובה; מרכיבים נחוצים; לציין את רצף האירועים בעת הגדרת תגובה על מנת לזהות אנטיגן בחומר הבדיקה; מרכיבים נחוצים; מה קורה עם תוצאה חיובית, איך זה נראה? ציין את רצף הפעולות במהלך ELISA על מנת לזהות נוגדנים בסרום הבדיקה; מרכיבים נחוצים; מה קורה עם תוצאה חיובית? אימונובלוטינג - עקרון התגובה; שלבים עיקריים; מרכיבים נחוצים; כיצד נלקחת בחשבון התוצאה? יתרונות התגובה. Radioimmunoassay (RIA) - מהם השלבים העיקריים של התגובה; במה מסומנים נוגדנים או אנטיגנים, כיצד נלקחת בחשבון התוצאה? מיקרוסקופיה אימונואלקטרון - עקרון השיטה; שלבים עיקריים; מרכיבים נחוצים; במה מסומנים נוגדנים? כיצד נלקחת בחשבון תוצאת התגובה. תגובות אימוביליזציה - עקרון השיטה, טכניקת ההגדרה, רכיבים, התחשבות בתוצאות.

משימות לביצוע בתהליך האימון העצמי.

השלם את טבלת תגובות חסינות עבור התגובות המכוסות בנושא זה.

תגובות חיסוניות

עבודת התלמיד בשיעור מעשי

התחל לעבוד מיד עם הניסוח של השלב הראשון של ה-RSC, אך רשום אותו במחברת מאוחר יותר (ראה להלן).

1. התגובה של המוליזה חיסונית. צפו בתגובת הדגמה של המוליזה חיסונית, ציירו אותה כתרשים, הסבירו את התוצאה בצינורות הניסוי והבקרה.

2. תגובה מחייבת משלים

א) לפרק את ה-RSC לפי הטבלה;

ב) צייר במחברת סכמה להגדרת ה-RSC בצורה של טבלה;

ג) לשים את השלב השני של ה-RSK (השלב ​​הראשון מושם בתחילת השיעור);

ד) לפרק את תכשירי האבחון הדרושים ל-RSK;

ה) לקחת בחשבון את התוצאה. נסח מסקנה לגבי נוכחותם של נוגדנים ספציפיים בסרום הבדיקה.

3. תגובה אימונופלואורסצנטית. למד את הטבלה, שרטט תוכנית להגדרת התגובה במחברת שלך; ראה סרה אבחנתית; לקבוע מה הסרום מכיל, כיצד הוא מוכן, לאיזו תגובה (ישירה או עקיפה RIF) הוא משמש. תסתכל על תוצאת ההדגמה של ה-RIF במיקרוסקופ פלואורסצנטי.

4. בדיקת אנזים אימונו (ELISA). במחברת שלך, ערכו סכמת תגובה בשתי גרסאות: לזיהוי אנטיגן בחומר הבדיקה ולאיתור נוגדנים בסרום. סקור את ערכת המרכיבים לאבחון HIV והפטיטיס B. קבע מה מכיל כל מרכיב ולמה הוא משמש.

5. אימונובלוטינג. ערכו תרשים של התגובה במחברת שלכם; ראה את ההדגמה - תוצאת התגובה.

6. Radioimmunoassay (RIA). צייר את סכימת התגובה במחברת שלך.

7. מיקרוסקופיה אלקטרונית חיסונית (IEM). צפו בהדגמה - תוצאת התגובה, שרטו במחברת סכימת תגובה, ציינו את האנטיגן (וירוס) ונוגדנים מסומנים בחצים.

Immunoblotting היא שיטת זיהוי חלבון רגישה ביותר המבוססת על שילוב של אלקטרופורזה ו-ELISA או RIA. Immunoblotting משמש כשיטת אבחון לזיהום ב-HIV וכו'.

במובן כללי, אימונובלוטינג מובנת כניתוח של תערובת חלבונים המועברת לממברנת תמיכה מוצקה, שאיתה הם נקשרים על ידי קשרים קוולנטיים, ולאחר מכן זיהוי חיסוני.

ניתן לנתח תערובת של חלבונים המופקדים ישירות על מצע (ניתוח נקודות כתם) או לאחר שבירה ראשונית שלו על ידי מיקוד אלקטרו, אלקטרופורזה בדיסק או אלקטרופורזה דו מימדית (Western blotting).

אנטיגנים פתוגנים מופרדים על ידי אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד, ואז מועברים מהג'ל לנייר פעיל או לממברנת ניטרוצלולוזה ומפותחים על ידי ELISA.

חברות מייצרות רצועות כאלה עם "כתמים" של אנטיגנים. על רצועות אלו מורחים את הסרום של המטופל. . לאחר מכן, לאחר הדגירה, המטופל נשטף מנוגדנים לא קשורים של המטופל ומורח נסיוב נגד אימונוגלובולינים אנושיים המסומנים באנזים. . הקומפלקס שנוצר על הרצועה (אנטיגן + נוגדן של המטופל + נוגדן נגד Ig אנושי) מתגלה על ידי הוספת מצע כרומוגני שמשנה את צבעו בפעולת האנזים.

מתודולוגיה זו מיושמת גם על בחירת שיבוטים של חיידקים, פאגים או וירוסים המבטאים את התוצרים של הגנים המשובטים של המטרה.

העברת חלבונים לממברנה מתבצעת באופן פסיבי או באמצעות מנגנון העברה אלקטרו. יעילות העברת החלבון לממברנה מושפעת מגורמים רבים, כגון המשקל המולקולרי של החלבונים, נקבוביות הג'ל, זמן ההעברה והרכב תמיסת החוצץ (טרנס בופר) בשימוש.

בהתאם למשימות ולתנאים של הניסוי, נבחרים תנאי העברה המספקים את התוצאות הטובות ביותר. המצעים הנפוצים הם ניטרוצלולוזה, פוליווינילידן דיפלואוריד (PVDF), או קרומי ניילון בעלי מטען חיובי. ניטרוצלולוזה יכולה לקשור עד 80-100 מיקרוגרם חלבון לכל 1 סמ"ר.

חלבונים במשקל מולקולרי נמוך (עם משקל מולקולרי של פחות מ-20 kDa) עלולים ללכת לאיבוד כתוצאה מכביסות, מה שמאפשר לחקור מקדים את הפולימורפיזם של לוקוסים גנטיים מסוימים לפי אורכי שברי ה-DNA ההגבלה התואמים.

בנוסף, באמצעות ההכלאה הדרומית, קל לגלות האם לגן המטרה יש אתר הידרוליזה על ידי אנזים הגבלה מסוים בחלקו הפנימי, מה שמאפשר לבחור את האסטרטגיה האופטימלית לשיבוט אזור הגנום הנחקר.

על פי תכנית דומה, ניתן להעביר מולקולות RNA גם מג'ל אגרוז למסנן ניטרוצלולוזה. שיטה זו נקראה Northern blotting בניגוד ל-Southern blotting, שכן שם המשפחה Southern פירושו "דרומי" באנגלית.

ההעברה לפילטרים מג'ל החלבון נקראה בהתאם Western blotting. חלבונים גדולים (יותר מ-100 kDa) שדנטורטים בתמיסת סודיום דודקיל סולפט (SDS) עשויים להיות מועברים בצורה גרועה לממברנה אם אתנול קיים במאגר הטרנס. אלכוהול משפר משמעותית את העברת החלבונים מג'ל SDS-polyacrylamide, אך מצמצם את הנקבוביות בג'ל, מה שמוביל לשמירה של חלבונים גדולים.

ממברנת PVDF מותאמת לזיהוי חיסוני ומסוגלת לשמור חלבונים הקשורים ספציפית עד 160 מיקרוגרם/סמ"ר עם רמה נמוכה מאוד של קישור לא ספציפי.

אימונובלוטינג

מאפיין חשוב של קרום זה הוא האפשרות של שימוש חוזר בו. ממברנות ניילון Zeta-Probe קושרות ביעילות חלבוני SDS בהיעדר אלכוהול, וקשירה זו עמידה לטיפולים הבאים. חלבונים במשקל מולקולרי נמוך נשמרים גם ביעילות. עם יכולת קשירה גבוהה של כ-480 מיקרוגרם חלבון לכל 1 cm2, ממברנות Zeta-Probe מאפשרות זיהוי של כמויות עקבות של חלבון בתערובות בדיקה.

לאחר שהאנטיגן משותק על הממברנה, אתרי הקישור הנותרים נחסמים בתמיסות של ג'לטין, או אלבומין בסרום בקר, או חלב רזה.

לאחר מכן מודגרת הממברנה בתמיסה של נוגדנים רב שבטיים או חד שבטיים לאנטיגן הנבדק. לאחר שטיפת נוגדנים לא קשורים, הממברנה מודגרת בתמיסה של נוגדנים משניים, שהם צימוד של פוספטאז אלקליין (פוספטאז בסיסי, AP) או אנזימי חזרת פרוקסידאז (HRP) עם נוגדנים נגד מינים (נוגדנים לעזים לארנב, עכבר או אימונוגלובולינים אנושיים) או חלבונים A (חלבון Staphylococcus aureus) או G (חלבון Streptococcus sp.) בעלי זיקה גבוהה לאזור Fc של אימונוגלובולינים.

זיהוי של קומפלקסים חיסוניים שנוצרו מתבצע בשיטה כימית או כימילומינסצנטי. מצעים לתגובה כימית בעת שימוש בצמודים פוספטאז אלקליין הם 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) או tetrazolium blue (NBT), ובעת שימוש בצמודים של חזרת פרוקסידאז - 4-chloro-1-naphthol ומי חמצן.

כתוצאה מתגובות אנזימטיות נוצרת פס או כתם צבעוני על הממברנה במקום לוקליזציה של קומפלקס אנטיגן-נוגדנים.

הרגישות של שיטה זו היא 100 pg של חלבון בשימוש בצמודים של AP ו-100-500 pg בשימוש ב-HRP. זיהוי כימילומינסצנטי של קומפלקסים חיסוניים יכול לזהות פחות מ-5 אג' של אנטיגן. העיקרון של שיטה זו הוא שכאשר HRP מגיב עם מי חמצן ו-diacylhydrazineluminol מחזורי, אור נפלט באורך גל של 428 ננומטר, אותו ניתן לתעד על סרט רגיש לאור.

תגובת האימונובלוטינג (RI) פותחה על בסיס ELISA. זוהי השיטה הספציפית והרגישה ביותר לניתוח אימונוכימי. Immunoblotting (מתוך הכתם האנגלי - to get wet, spot) משלב ELISA עם אלקטרופורזה. הוא משמש לאיתור נוגדנים לא מורכבים ל-HIV, אלא נוגדנים לחלבונים המבניים הבודדים שלו (חלבונים-p24, גליקופרוטאינים-gp120, gp 41 וכו'). עיין בתגובות מומחים (מאשרות) לאבחון של זיהום ב-HIV.

התגובה מתבצעת במספר שלבים:

הנגיף מושמד למרכיבים - אנטיגנים (p24, gp120, gp 41 וכו'), אשר עוברים אלקטרופורזה בג'ל פוליאקרילאמיד, כלומר הפרדה של אנטיגנים לשברים לפי משקל מולקולרי.

2. הג'ל מכוסה בממברנת ניטרוצלולוזה ומשברי אנטיגן מועברים אליו באמצעות אלקטרופורזה. ניטרוצלולוזה מתנהג כמו נייר סופג. הממברנה נחתכת לרצועות (רצועות). חברות מייצרות רצועות כאלה עם "כתמים" של אנטיגנים.

Immunoblotting - שיטה עקיפה נוספת

רצועות עם אנטיגנים של HIV מוחלים עליהן טובלות בסרום של הנבדק ולאחר מכן נשטפות מחומר לא קשור.

4. הרצועות מודגרות בסרום אנטיגלובולין המסומן בפרוקסידאז ונשטפות.

מוסיפים מצע ומציינים את מספר השברים הצבעוניים (כתמים), התואמים את אזור הלוקליזציה של מתחם AG-AT.

נוכחות של פסים באזורים מסוימים של הרצועה מאשרת את נוכחותם של נוגדנים בסרום הנחקר לאנטיגנים של HIV מוגדרים בקפדנות. התוצאה של אימונובלוטינג נחשבת חיובית אם רצועות התואמות לשניים משלושת אנטיגנים של HIV - p24, gp41 ו-gp 120 נראות על גבי הממברנה (איור 37).

רישומים

רשימת ספרות משומשת

ספרות ראשית

מיקרוביולוגיה רפואית, וירולוגיה ואימונולוגיה: ספר לימוד לסטודנטים לרפואה. אוניברסיטאות מהדורה 2, מתוקן. ועוד — 702 עמ'. אד. א.א. וורוביוב. M. : MIA, 2012.

2. מיקרוביולוגיה, וירולוגיה ואימונולוגיה: מדריך ללימודי מעבדה: מדריך לימוד / (V.B. Sboychakov וחב'); ed. V.B.Sboychakova, M.M. Karapats. – M.: GEOTAR-Media, 2014.- 320 עמ': ill.

3. מיקרוביולוגיה רפואית, אימונולוגיה ווירולוגיה [משאב אלקטרוני]: ספר לימוד לדבש.

אוניברסיטאות - 760 p. - מצב גישה: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN9785299004250.html Korotyaev A.I., Babichev S.A. סנט פטרסבורג: Spetslit, 2010.

4. מיקרוביולוגיה רפואית, וירולוגיה ואימונולוגיה [משאב אלקטרוני]: ספר לימוד: ב-2 כרכים / V. 1. - 448 עמ'. - מצב גישה: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142241.html Zverev V.V., Boychenko M.N.

M. : Geotar Media, 2010. .

5. מיקרוביולוגיה רפואית, וירולוגיה ואימונולוגיה [משאב אלקטרוני]: ספר לימוד: ב-2 כרכים. כרך 2. - 480 עמ'. מצב גישה: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142242.html Zverev V.V., Boychenko M.N. מ. : Geotar Media, 2010.

ספרות נוספת

1. תגובות אימונודיאגנוסטיות: ספר לימוד / חובר על ידי: G.K. Davletshina, Z.G. Gabidullin, A.A. Akhtarieva, M.M.

Khusnarizanova, Yu.Z. Gabidullin, M.M. Alsynbaev - Ufa: Publishing House of GBOU VPO BSMU של משרד הבריאות של רוסיה, 2016. - 86p.

2. תכונות של כמה מאפיינים הקובעים את הפוטנציאל הפתוגני של וריאציות מעובדות במשותף של Enterobacter, Сitrobacter, Serratia, E. coli, Proteus bacteria: פרסום מדעי / Yu. Z. Gabidullin, R. S. Sufiyarov, I. I. Dolgushin - Ufa, 2015. 250 שניות.

דף הבית » אימונובלוט - מה זה? אימונובלוט באבחון מחלות זיהומיות

אימונובלוט - מה זה? אימונובלוט באבחון מחלות זיהומיות

מהו אימונובלוט? זוהי שיטה נפוצה לאבחון מעבדתי של זיהומים ויראליים אנושיים. זוהי אחת הדרכים המדויקות והאמינות ביותר לזהות נוכחות של HIV.

לצורך מהימנות, הוא אפילו גדול יותר ממבחן האימונוסורבנט המזוהה עם האנזים (elisa). תוצאות אימונובלוט נחשבות חותכות וחותכות. מידע כללי

אימונובלוט - מה זה? על מנת לזהות אדם כנשא HIV, עליך לעבור בדיקת מעבדה לבדיקת נוכחות נוגדנים בסרום הדם.

שיטת קטעי ה-Western blot נקראת גם Western blot (Western blot). הוא משמש לאיתור זיהומים ויראליים אנושיים, כשיטה נוספת של מומחה. זה הכרחי כדי לאשר את ה-ELISA - בדיקת מעבדה המאפשרת לקבוע נוכחות של נוגדנים ל-HIV בדם. אימונובלוט בדוק מחדש ELISA חיובי.

הוא נחשב לרגיש, המורכב והיקר ביותר.

יַעַד

מהו אימונובלוט? שיטה זו לבדיקת מעבדה של סרום דם לנוכחות נוגדנים לנגיף.

במהלך מחקרים מיוחדים על סך החלבונים הנגיפיים בג'ל ועל ממברנות ניטרוצלולוזה.

אימונובלוטינג (זיהוי של נוגדנים בסרום של חולים לאנטיגנים פתוגנים מסוימים)

נוהל הסעיף של Western blot נועד לקבוע זיהום ב-HIV בשלבים שונים. בשלב הראשון עובר הנגיף המטוהר מחלקיו המרכיבים לאלקטרופורזה והאנטיגנים הכלולים בו, לחלק במשקל המולקולרי.

נגיף הכשל החיסוני האנושי משתכפל בתאים חיים המוטבעים במידע הגנטי שלו. בשלב זה, האדם הופך לנשא של נגיף ה-HIV אם נדבקתם.

הספציפיות של מחלה זו היא שהיא אינה באה לידי ביטוי במשך זמן רב. הנגיף הורס לימפוציטים, ובכך, חסינותו של אדם יורדת והגוף אינו מסוגל להילחם בזיהומים.

אם HIV יטופל נכון ובזמן, החולה יחיה עד זקנה בשלה. חוסר טיפול מוביל בהכרח למוות. מרגע ההדבקה, אך ללא טיפול, התקופה המקסימלית היא לא יותר מעשר שנים.

מוזרויות

ניתוח Immunoblot הוא שיטה אמינה המאפשרת לך לקבוע את נוכחותם של נוגדנים לאנטיגנים של HIV מהסוג הראשון והשני.

אם אדם נדבק, לאחר שבועיים של נוגדנים, שניתן לזהות הרבה יותר מאוחר. תכונה של HIV היא שכמות הנוגדנים עולה במהירות ונשארת בדם החולה. גם אם הם קיימים, ייתכן שהמחלה לא תתבטא במשך שנתיים או יותר. שיטת ELISA לא תמיד מציינת במדויק את נוכחות המחלה, ומחייבת אישור של התוצאות מקטעי PCR ו-Western blot אם בדיקת האנזים החיסונית הראתה תוצאה חיובית.

אינדיקציות עבור

איזה סוג של "אימונובלוט" כבר התגלה, אבל מה מוצג במחקר?

הסיבה לבדיקת נגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV) אימונובלוט תהיה תוצאת ELISA חיובית. יש צורך לעבור בדיקת אימונוסורבנט המקושרת לאנזים בחולים שעומדים לעבור ניתוח. בנוסף, כדאי לבצע ניתוח של נשים שמתכננות הריון, וכן של נשים מופקרות. קטעי הכתם המערבי ניתנים לחולים עם זיהום ב-HIV אם תוצאות אליסה מוטלות בספק.

התסמינים המדאיגים הבאים עשויים להיות הסיבה לפנייה לרופא: ירידה מהירה במשקל; חולשה, אובדן תפקוד; הפרעות מעיים (שלשול), הנמשכות שלושה שבועות; התייבשות; חום; בלוטות לימפה נפוחות בגוף; התפתחות קנדידה, שחפת, דלקת ריאות, טוקסופלזמה, החמרה של הרפס.

החולה אינו צריך להתכונן לפני תרומת דם ורידי.

אין לאכול 8-10 שעות לפני הבדיקה. לא מומלץ לשתות אלכוהול ומשקאות קפה, תרגילים גופניים כבדים, לחוות התרגשות יום לפני תרומת הדם.

איפה לעשות את הניתוח?

היכן ניתן להיבדק ל-HIV?

ELISA, ניתוח אימונובלוט המבוצע במרפאות פרטיות עירוניות, נותן תוצאות תוך יום. אפשר גם אבחון מיידי. במוסדות ציבוריים, בדיקות רפואיות של אליסה וקטעי הכתם המערבי אינם כרוכים בתשלום, בהתאם לחקיקה של הפדרציה הרוסית.

בדיקת חובה לאיתור מחלות זיהומיות של נשים בהריון, וחולים הזקוקים לאשפוז או ניתוח כיצד מתבצע מחקר זה?

כיצד לבצע ELISA? Immunoblot חיובי/שלילי מאשר או מפריך את תוצאות אליסה. ההליך די פשוט. המומחה לוקח דם ורידי, עם הזמן זה לוקח פחות מחמש דקות.

לאחר הדגימה יש לחטא את מקום ההזרקה ולאטום עם פלסטר. הדגימה מתבצעת על בטן ריקה, ולכן לאחר ההליך לא יזיק לאכול חפיסת שוקולד מריר או משקה חם ומתוק.

כדי לקבל הפניה לאנליזה חינם במוסד רפואי ציבורי, יש לבקר אצל מטפל.

באופן כללי, האימונובלוט אינו שונה מבדיקות דם אחרות בדגימה. מתודולוגיית המחקר פשוטה. אם קיים נגיף בדמו של אדם, הגוף מתחיל לייצר נוגדנים כדי להרוס אותו. ישנם אנטיגנים חלבונים רבים לכל וירוס. זיהוי הנוגדנים הללו הוא הבסיס של שיטת חתך ה-Western blot. מחיר

כמה ניתוח? Immunoblot HIV מתייחס למחקר זול.

בממוצע, שיטות אימונואסאיי סקר נעות בין 500 ל 900 רובל. קטעי כתם מערביים הם בדיקת מחקר, שעלותה נעה בין שלושת לחמשת אלפים רובל. שיטות מורכבות יותר הן הרבה יותר יקרות. לדוגמה, עבור ניתוח תגובת שרשרת הפולימראז (PCR), תצטרך לשלם כ -12,000 רובל.

פרשנות של תוצאות

השיטות הנפוצות ביותר לאבחון זיהום ב-HIV הן בדיקת אנזים חימונית ואימונובלוט.

הם מיועדים לקביעת נוגדנים בסרום לנגיף הכשל החיסוני האנושי. הדבקה מאושרת בדרך כלל על ידי שתי בדיקות: סקר ומאשר. פרשנות התוצאות צריכה להיעשות על ידי רופא, הוא מאבחן ורושם טיפול. אם האימונובלוט חיובי, זה אומר שלגוף האדם יש וירוס.

תוצאה חיובית לא צריכה להיות סיבה לטיפול עצמי, שכן לכל חולה עשויה להיות תמונה משלו של המחלה.

ניתוח איכותי כולל מיון והסמכה. אם החולה אינו חולה בנגיף, התוצאה היא "שלילית". כאשר אישור זה נמצא, מתבצעות בדיקות מיון נוספות. ניתוח אימונובלוט המאשר או מפריך את ההקרנה. אם רצועות הבדיקה מופיעות בהחשכה של אזורים מסוימים (לוקליזציה של חלבון), האבחנה היא "HIV".

אם התוצאות מוטלות בספק, הבדיקות מבוצעות תוך שלושה חודשים.

כדי למנוע הידבקות בנגיף הכשל החיסוני האנושי, זה אפשרי אם אתה פועל לפי כללים מסוימים: הימנע ממגע מיני מזדמן, השתמש בקונדומים במהלך מגע, אל תשתמש בסמים.

אם המחלה מתגלה אצל אישה בהריון, חשוב לעקוב אחר המלצות הרופא המטפל, אל תשכח מבדיקות לנוכחות הנגיף.

מה זה Western Blotting?

זיהוי חלבונים בתערובות מורכבות או בתמציות של רקמות שונות היא אחת הבעיות הנפוצות. באמצעות כלי כזה כמו נוגדנים ספציפיים, ניתן לקבוע את החלבון הנבדק במינימום זמן ועלויות כספיות.

בשיטת ה-Western blotting, בשלב הראשון, תערובת חלבונים מופרדת על ידי אלקטרופורזה בנוכחות Sodium Dodecyl sulfate (SDS), ולאחר מכן מועברת לממברנת ניטרוצלולוזה על ידי electroblotting.

המהות של שיטה זו טמונה בעובדה שהג'ל לאחר אלקטרופורזה מונח על קרום ניטרוצלולוזה בין שכבות של נייר סינון. ה"סנדוויץ'" המורכב בצורה זו מונח בשדה חשמלי כך שמתחמי החלבון-SDS נעים על פני צלחת הג'ל ומקובעים (כתוצאה מספיגה לא ספציפית) על פני ממברנת הניטרוצלולוזה.

בקשירה של קומפלקס החלבון-SDS לממברנת הניטרוצלולוזה מעורבים בעיקר כוחות חשמליים, ואינטראקציה זו היא רב-נקודתית ומובילה ל"התפשטות" חלבונים על פני הממברנה. לפיכך, לאחר ההעברה האלקטרונית, אנו משיגים העתק של הג'ל על ניטרוצלולוזה עם חלבונים מסודרים באותו אופן כמו בג'ל פוליאקרילאמיד.

לאחר SDS - אלקטרופורזה, העברה אלקטרו וספיגה של חלבונים מהג'ל על גבי ממברנת ניטרוצלולוזה, המבנה השלישוני של החלבון משתנה מאוד, אם בדרך כלל נכון לדבר על קיומו של מבנה שלישוני לחלבון לאחר טיפול כה קשה. . לכן, לזיהוי אימונוכימי של החלבון הנחקר, משתמשים בדרך כלל רק בנוגדנים חד-שבטיים ספציפיים לאזורים הליניאריים של מולקולת החלבון.

51. בדיקת אנזים אימונו, אימונובליטינג. מנגנון, רכיבים, יישום.

נוגדנים ספציפיים לאפיטופים קונפורמטיביים (או אתרים הכוללים מגע בין תת-יחידות) בדרך כלל אינם מתאימים לשימוש בשיטת ה-Western blot.

לאחר העברת חלבון, הממברנה מודגרת ברצף עם נוגדנים ספציפיים לחלבון הנחקר, ולאחר מכן עם נוגדנים משניים ספציפיים לשברי Fc של הנוגדנים הראשוניים, מצומדים עם תווית אנזים (או תווית אחרת) (איור.

1 א'). במקרה שבו נוגדנים ראשוניים ספציפיים לאנטיגן הנחקר מצומדים ישירות עם התווית, אין צורך בנוגדנים משניים (איור 1 ב). הקומפלקסים החיסוניים הנוצרים במקום לוקליזציית החלבון הנחקרת "באים לידי ביטוי" בעזרת מצע כרומוגני (תלוי בסוג התווית).

הרגישות והספציפיות של השיטה תלויות מאוד באילו נוגדנים משתמשים במחקר.

הנוגדנים המשמשים חייבים להיות ספציפיים לרצף חומצות אמינו ייחודי הספציפי רק לחלבון הנבדק. אחרת, תיתכן אינטראקציה (במיוחד במקרה של תמציות חלבון גס) של נוגדנים עם מספר מולקולות חלבון, שבתורה תוביל להופעת כמה פסים צבעוניים על הממברנה.

זיהוי החלבון הנחקר במקרה זה הוא לעתים קרובות קשה או אפילו בלתי אפשרי.

הגורם החשוב השני שיש לזכור בבחירת נוגדנים הוא זיקה. ככל שהזיקה של הנוגדנים בהם נעשה שימוש גבוהה יותר, כך צלעות החלבון מצביעות בהירות וברורות יותר, כך רגישות השיטה גבוהה יותר. כאשר משתמשים בנוגדנים בעלי זיקה גבוהה, ניתן להגיע לרגישות של 1 ng ואף יותר.

כדי לדמיין את התוצאה של האינטראקציה של האנטיגן והנוגדנים הקשורים לממברנה, נעשה שימוש בנוגדנים משניים המצומדים עם סוכנים המסוגלים לתת אות מסוים בתנאים מסוימים.

בדרך כלל, נעשה שימוש באנזים (פרוקסידאז או פוספטאז) כחומר כזה, שתוצר התגובה שלו הוא בעל צבע ומשקע על הממברנה בצורה של משקעים בלתי מסיסים.

ניתן גם להשתמש בתוויות פלורסנט בשיטה זו.

אורז. 1. סכימה של צביעה אימונוכימית של החלבון הנחקר: A - באמצעות נוגדנים משניים המצומדים עם תווית אנזים; B - הנוגדן הראשוני מצומד ישירות עם תווית אנזים.

נוהל:

I. הכנת ג'ל וממברנה והעברת חלבון אלקטרו

ג'ל הפוליאקרילאמיד לאחר אלקטרופורזה הונח באמבטיה עם חיץ סופג (25 מ"מ טריס, pH 8.3, 192 מ"מ גליצין, 10% אתנול).

על החלק של הקסטה שיפנה לאנודה מניחים שני גיליונות של נייר סינון, חתוכים לצורת קלטת הסופג ומורטבים במאגר סופג. לאחר מכן, ממברנת ניטרוצלולוזה שהורטבה מראש באותו חיץ מונחת על נייר הסינון, ומוודאת שאין בועות אוויר בין הממברנה לנייר.

לאחר מכן, יש להניח את הג'ל בזהירות על הממברנה, שוב לשים לב במיוחד להיעדר בועות אוויר בין הג'ל לממברנה. את הסנדוויץ' משלימים שתי שכבות של נייר סינון רטוב, המונחות על פני הג'ל (איור 2). את הסנדוויץ' שנוצר מהדקים בקסטה ומניחים בין האלקטרודות כך שהממברנה פונה לאנודה.

אורז. 2. סכימה של העברה אלקטרו של חלבונים לממברנה.

II. העברה חשמלית

העברה אלקטרו של חלבונים לממברנת ניטרוצלולוזה מתבצעת במאגר המכיל 25 mM Tris, pH 8.3, 192 mM גליצין, 10% אתנול למשך 30-50 דקות במתח קבוע של 100 V.

זמן ההעברה האלקטרונית תלוי בגודל החלבונים המועברים, ככל שהחלבון גדול יותר, ההעברה האלקטרונית נמשכת זמן רב יותר. איכות ההובלה האלקטרונית וסידור רצועות החלבון הוערכה על ידי צביעה של קרום הניטרוצלולוזה ב-0.3% Ponceau S בחומצה אצטית של 1%. לפני הצביעה החיסונית, יש לשטוף את הממברנה מספר פעמים בתמיסת Tris מימית מעט בסיסית כדי להסיר צבע הקשור לחלבון.

III. צביעה אימונוכימית של חלבונים המקובעים על ממברנת ניטרוצלולוזה

כדי לחסום אתרי קשירת נוגדנים לא ספציפיים, הממברנה מודגרת תוך ערבוב מתמיד בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות ב-PBST (לחסימה טובה יותר, ניתן להשתמש בתמיסת PBST המכילה 10% אבקת חלב רזה).

לאחר החסימה, הממברנה מודגרת למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר תוך ערבוב מתמיד ב-PBST המכיל 1-10 מיקרוגרם/מ"ל של נוגדנים ספציפיים.

הריכוז האופטימלי של נוגדנים נבחר באופן אמפירי ותלוי בזיקה של האינטראקציה של נוגדנים עם האנטיגן.

בתום הדגירה, הממברנה נשטפה 5 פעמים עם PBST והועברה לתמיסה של נוגדנים משניים המצומדים עם פרוקסידאז חזרת. הדילול של המצומד מצוין בדרך כלל על ידי היצרן על האריזה, או נבחר באופן אמפירי על ידי החוקר. דגירה על הממברנה בתמיסה של נוגדנים משניים למשך שעה תוך ערבוב מתמיד.

לאחר כביסה יסודית (לפחות 5-6 החלפות חיץ), מועברת קרום ה-PBST לתמיסת מצע כרומוגני המכילה 3 מ"ג דיאמינובנזידין (DAB) ו-10 μl של מי חמצן 30% ב-10 מ"ל של 0.1 M Tris-HCl, pH 7.6 .

הדגירה מתבצעת תוך ערבוב למשך 5 עד 10 דקות. לאחר סיום הדגירה עם המצע, יש לשטוף את הממברנה ב-PBST, לייבש באמצעות ספיגה בנייר סינון, ולבצע מיד עותק אלקטרוני באמצעות סריקה בצבע. אם הממברנה מתייבשת לחלוטין, פסי החלבון הצבועים דוהים, והתמונה פחות בהירה וניגודית.

הערה: DAB הוא רעיל וגורם מסרטן פוטנציאלי. עבודה רק עם כפפות גומי!