BADANIE METABOLIZMU BIAŁEK
Aktywność lipazy trzustkowej
Wartość kliniczna i diagnostyczna definicji
Awans działalność lipaza trzustkowa odnotowane w surowicy krwi na zapalenie trzustki dowolnego pochodzenia, szczególnie ostre zapalenie trzustki, w którym aktywność enzymów wzrasta również w płynie puchlinowym. U pacjentów z zapaleniem trzustki wskazane jest jednoczesne badanie aktywności lipazy we krwi i moczu, ponieważ w tym ostatnim jest ona zwiększona częściej niż we krwi. Leki wywołujące skurcz zwieracza Oddiego (narkotyki, leki przeciwbólowe, sekretyna), heparyna (pobudzająca uwalnianie lipazy) aktywują ten enzym.
Niski poziom aktywności lipazy stwierdzono u chorych na gruźlicę, kiłę, nowotwory i różne choroby zakaźne, a w miarę postępu procesu patologicznego aktywność enzymu coraz bardziej maleje.
Białka są substancjami zawierającymi azot o dużej masie cząsteczkowej. Istnieją białka proste - białka składające się z 20 różnych aminokwasów i białka złożone - proteidy, składające się z białka i składnika protetycznego (niebiałkowego). Składniki protetyczne obejmują kwasy nukleinowe, hem, lipidy, kwas fosforowy itp. Złożone białka obejmują nukleoproteiny, chromoproteiny, lipoproteiny, fosfoproteiny.
Analizę biochemiczną zwykle rozpoczyna się od określenia zawartości białko całkowite w osoczu krwi (surowicy).
Zmiany poziomu białka całkowitego mogą być zarówno bezwzględne, jak i względne. Te ostatnie zwykle obserwuje się wraz ze wzrostem (zmniejszeniem) objętości krwi (osocza). Zatem hydremia prowadzi do względnej hipoproteinemii, a odwodnienie prowadzi do względnej hiperproteinemii. W związku z tym przy interpretacji wskaźników całkowitego białka w surowicy krwi (osoczu) należy wziąć pod uwagę zaburzenia metabolizmu wody.
Odwodnienie może ukryć całkowitą hipoproteinemię, ponieważ przy tej kombinacji stężenie białka w osoczu krwi nie zawsze odbiega od normy. Wynika z tego, że przyczyną hipo- i hiperproteinemii może być nie tylko brak równowagi między przyjmowaniem białka, biosyntezą, jego katabolizmem i usuwaniem, ale także zmiana objętości przestrzeni wewnątrznaczyniowej z powodu płynnej (wodnej) części krwi. Wiadomo, że patogeneza tych zmian jest różna.
Aby rozróżnić bezwzględne i względne zmiany zawartości białka w osoczu, wystarczy zbadać wskaźnik hematokrytu lub określić objętość osocza (krwi).
W zdecydowanej większości przewlekłych chorób narządów wewnętrznych, którym towarzyszą zmiany w metabolizmie białek, stwierdza się hipoproteinemię, która zwykle jest wtórna.
Absolutna hipoproteinemia wykrywany w zespołach patofizjologicznych, wyrażających się zmniejszoną biosyntezą, wzmożonym katabolizmem, nieprawidłowymi stratami i patologicznym rozmieszczeniem białek pomiędzy poszczególnymi sektorami organizmu. Przyczynami bezwzględnej hipoproteinemii są:
1. Niewystarczające spożycie białka z pożywienia na skutek postu, niedożywienia, zwężenia (zwężenia) przełyku (na skutek oparzenia, nowotworu), zaburzenia integralności i funkcji przewodu pokarmowego, przedłużających się procesów zapalnych w ścianie jelita i innych stany, którym towarzyszy pogorszenie trawienia i wchłaniania białka.Spadek poziomu białka całkowitego w osoczu (lub tendencja do rozwoju hipoproteinemii) obserwuje się także w zespole upośledzonego wchłaniania pokarmów białkowych i braku równowagi w jego składzie aminokwasowym .
2. Zahamowanie funkcji proteosyntetycznej wątroby, obserwowane w miąższowym zapaleniu wątroby, marskości wątroby, a także zatruciach spowodowanych długotrwałymi procesami ropnymi, nowotworami złośliwymi, tyreotoksykozą i toksycznym działaniem niektórych substancji chemicznych.
3. Zwiększony rozkład białek w organizmie, spowodowany koniecznością kompensowania wysokich kosztów energii, wiąże się z niedoborem zasobów tworzyw sztucznych. Odnotowuje się to w oparzeniach termicznych i chorobach oparzeniowych, nowotworach złośliwych.
4. Utrata białka z organizmu: z krwią podczas ostrych i przewlekłych krwawień, z moczem podczas zespołu nerczycowego (nerczyca, amyloidoza nerkowa).
5. Ruch do innych tkanek z gwałtownie zwiększoną przepuszczalnością ściany naczyń włosowatych: powstawanie rozległego obrzęku, przejście do trzeciej przestrzeni - z tworzeniem się wysięków, wysięków do jam surowiczych, do światła jelita (ze skrętem, zapaleniem otrzewnej).
6. Defektoproteinemia, ᴛ.ᴇ. stosunkowo rzadkie dziedziczne (uwarunkowane genetycznie) zaburzenia syntezy białek krwi.
7. Cechy stanu fizjologicznego organizmu . Stwierdzono także obniżoną zawartość białka w osoczu krwi w niektórych stanach fizjologicznych: np. u kobiet w ostatnich miesiącach ciąży i laktacji.
Względna hipoproteinemia. Wiadomo, że obfita perfuzja roztworu glukozy i innych płynów fizjologicznych prowadzi do zmniejszenia stężenia białka w wyniku wzrostu objętości płynnej części krwi.
Ponad połowę całkowitej ilości białek osocza (35-55 g/l) stanowi albumina. Albumina osocza ulega szybkiej odnowie: w ciągu 24 godzin syntetyzowane i rozkładane jest 10-16 g tego białka. Albumina ze względu na swoje znaczne stężenie, wysoką hydrofilowość i mały rozmiar cząsteczek pełni ważną funkcję w utrzymaniu ciśnienia koloidalnego. Bierze zatem udział w wymianie wody pomiędzy krwią a przestrzenią śródmiąższową. Gdy zawartość albumin jest niższa niż 30 g/l, ciśnienie onkotyczne spada tak bardzo, że woda przemieszcza się od wewnątrz do sektora zewnątrznaczyniowego.
Oznaczenie stężenia albumin w osoczu odgrywa istotną rolę w ocenie ciężkości chorób, którym towarzyszy hipoalbuminemia.
Równie ważną wartością diagnostyczną jest oznaczenie stężenia albumin w moczu.
Spadek poziomu albuminy obserwuje się w przewlekłych chorobach nerek - zespole nerczycowym, a także przy oparzeniach, utracie krwi, chorobach zakaźnych, procesach ropnych, nieswoistym zapaleniu płuc, gruźlicy płuc i innych narządów, ostrym zapaleniu wielostawowym i innych stanach zapalnych, nowotworach złośliwych (kacheksja nowotworowa), białaczka, anemia, niewydolność serca, zawał mięśnia sercowego, masowa utrata białka przez jelita.
Pojawienie się białka w moczu (białkomocz) obserwuje się w wielu chorobach nerek. Zwyczajowo rozróżnia się organiczne (spowodowane uszkodzeniem miąższu nerek - choroby zapalne, zespół nerczycowy, czasami wrodzone wady nefronów) i czynnościowe białkomocz nerek związany ze wzrostem przepuszczalności filtra nerkowego lub spowolnieniem przepływu krwi w kłębuszkach (pod wpływem hipotermii, stresu fizycznego i psychicznego).
Białkomocz przednerkowy wiąże się ze zwiększonym rozkładem białek tkankowych, wyraźną hemolizą; nerki - spowodowane patologią nerek (kłębuszkowe i kanalikowe); pozanerkowe - spowodowane patologią dróg moczowych i najczęściej wysiękiem zapalnym.
Rozróżnianie jest zwyczajem trzy stopnie białkomoczu: umiarkowany – przy dobowej utracie białka do 1 g, umiarkowany – od 1 do 3 g i ciężki – powyżej 3 g/dobę.
Głównymi przyczynami białkomoczu są:
1. zwiększona przepuszczalność filtra kłębuszkowego dla białek osocza (białkomocz kłębuszkowy);
2. upośledzona kanalikowa resorpcja przefiltrowanych białek (białkomocz kanalikowy);
3. paraproteinemia i/lub podwyższony poziom białka we krwi;
4. zmiany w hemodynamice nerek;
Strona 66 z 76
Wideo: Oznaczanie białka reaktywnego w surowicy krwi
Wskaźniki całkowitego białka osocza krwi i jego poszczególnych frakcji są istotne w diagnostyce wielu chorób.
Oznaczanie całkowitego białka surowicy. Można go wytwarzać wieloma metodami (nitrometryczną, grawimetryczną, nefelometryczną, refraktometryczną, spektrofotometryczną itp.). Spośród metod kolorymetrycznych metoda biuretowa jest najbardziej specyficzna, dość czuła, dokładna i praktycznie dostępna. Metodę tę przedstawia się jako ujednoliconą metodę oznaczania białka całkowitego w surowicy krwi. Opiera się ona na następującej zasadzie: białka reagują w środowisku zasadowym z siarczanem miedzi, tworząc związki zabarwione na fioletowo.
Technika oznaczania białka całkowitego jest następująca. Do 5 ml roztworu roboczego odczynnika biuretowego (4,5 g soli Rochelle rozpuszcza się w 40 ml 0,2 N NaOH, dodaje się 1,5 g C11SO4 · 5H2O i 0,5 g K1 i dodaje się do 100 ml 0,2 N NaOH) dodaje się 0,1 ml surowicy krwi. Po 30 minutach próbkę kolorymetryzuje się metodą FEC w kuwecie 10 mm z zielonym filtrem względem kontroli. Aby przygotować kontrolę, należy dodać 0,1 ml 0,9% NaCl do 5 ml odczynnika biuretowego. Obliczenia przeprowadza się zgodnie z harmonogramem kalibracji.
Normalne stężenie białka całkowitego u dorosłych waha się od 62 do 82 g/l. Dane według wieku dzieci przedstawiono w tabeli. 49.
Tab.g. 49. Zawartość frakcji białkowych jako procent całkowitej ilości białka (dane średnie) według wieku (wg Yu. E. Veltishchev, 1979)
Najczęstszymi przyczynami rozwoju hipoproteinemii są niewystarczające spożycie białek do organizmu z pożywienia (głód białka), znaczna utrata białka i zahamowanie procesów biosyntezy białek krwi.
Niedostateczne spożycie białek w organizmie obserwuje się w przypadku zaburzeń przewodu żołądkowo-jelitowego (zwężenie przełyku, skurcz odźwiernika i zwężenie odźwiernika, nowotwory, procesy zapalne przewodu żołądkowo-jelitowego itp.), niskiej zawartości białka w diecie lub niezbilansowanej aminowości skład kwasowy itp.
Choroby nerek towarzyszące białkomoczowi, ostrym i przewlekłym krwawieniom, rozległym wysiękom i wysiękom do jam surowiczych, oparzeniom itp. prowadzą do utraty białka przez organizm.
Hipoproteinemia, związana ze zmniejszeniem biosyntezy białek w wątrobie, występuje w przewlekłym zapaleniu wątroby, zatruciu, marskości wątroby, długotrwałych procesach ropnych, nowotworach itp.
Hiperproteinemia jest zjawiskiem stosunkowo rzadkim. Obserwowany przy egzykozie, moczówce prostej, niedrożności jelit, uogólnionym zapaleniu otrzewnej, szpiczaku (uporczywym do 120 g/l).
Metody oznaczania frakcji białkowych w surowicy krwi. Badanie zależności ilościowych pomiędzy poszczególnymi frakcjami białek ma istotne znaczenie diagnostyczne, gdyż pozwala na różnicowanie niektórych typów hipo- i hiperproteinemii, a także szeregu chorób, którym nie towarzyszą zmiany zawartości białka całkowitego.
Do frakcjonowania białek osocza stosuje się wysalanie solami obojętnymi, frakcjonowanie elektroforetyczne, metody immunologiczne i sedymentacyjne, wytrącanie alkoholem etylowym w niskiej temperaturze, chromatografię i filtrację żelową. Najczęściej stosowane są metody elektroforetyczne, polegające na różnym tempie ruchu białek w polu elektrycznym w zależności od ich ładunku elektrycznego oraz innych właściwości fizycznych i chemicznych.
Powszechne stały się metody elektroforezy na papierze i żelach - agarze, skrobi i innych, zwłaszcza na żelu poliakryloamidowym, za pomocą których można otrzymać około 30 frakcji białkowych. Coraz częściej zaczęto stosować elektroforezę na błonach z octanu celulozy. Jednakże w klinicznych laboratoriach diagnostycznych stosuje się głównie metodę elektroforezy na papierze (V. G. Kolb, V. S. Kamyshnikov, 1976). Metoda ta opiera się na zasadzie: pod wpływem stałego pola elektrycznego białka surowicy posiadające ładunek elektryczny poruszają się po bibule zwilżonej roztworem buforowym z prędkością zależną od wielkości ładunku i masy cząsteczkowej. Białka surowicy dzielą się na pięć frakcji: albuminy i globuliny a1, a2, b, y.
Normalny stosunek albuminy do globuliny (stosunek albuminy do globuliny) wynosi około 2:1. Udział procentowy poszczególnych frakcji białkowych u dorosłych i dzieci w zależności od wieku przedstawiono w tabeli. 49. Całkowita ilość białek i frakcji białkowych we krwi zmienia się w różnych chorobach u dzieci.
U dorosłych i starszych dzieci wyróżnia się następujące typy elektroferogramów: I) ostry proces zapalny – 2) podostry przewlekły stan zapalny – 3) zespół objawów nerczycowych – 4) nowotwory złośliwe – 5) zapalenie wątroby – 6) marskość wątroby – 7) żółtaczka obturacyjna - 8) - i plazmocytomy p-globuliny.
W pierwszym typie następuje spadek poziomu albumin i wzrost a1, a2-globulin, a w późniejszych stadiach i γ-globulin, w drugim umiarkowany spadek frakcji albumin i wyraźny wzrost a2-globulin. , frakcji γ-globulin; w trzecim znaczny spadek albumin, wzrost a-globulin przy umiarkowanym spadku γ-globulin; w czwartym - spadek albumin i znaczny wzrost wszystkich frakcji globulin; w piąty - umiarkowany spadek albumin i wzrost γ- i (3-globulin); w szóstym - spadek albumin przy silnym wzroście frakcji γ-globulin, których podstawa jest rozszerzona - w siódmym - a spadek albuminy i umiarkowany wzrost CC2-, P- i γ-globulin; w ósmym - całkowite białko gwałtownie wzrasta, albuminy i większość globulin są zmniejszone, w zależności od rodzaju, γ- lub γ-glo są bardziej zwiększone - kręgle.
U niemowląt występuje fizjologiczny niedobór biosyntezy γ-globulin. Dlatego podczas chorób zakaźnych ich b- i a2-globuliny zwiększają się znacznie bardziej niż u starszych dzieci i dorosłych. Stały wzrost poziomu γ-globulin u małych dzieci może wskazywać na stan septyczny.
Białko jest główną substancją organiczną zawierającą azot. Jeden gram azotu zawarty jest w 6,25 gramach białka (stosunek azotu), tj. białko zawiera około 16% azotu. Dzięki temu badając metabolizm azotu w organizmie, można ocenić stan metabolizmu białek. Intensywność syntezy białek można ocenić na podstawie ilości azotu wprowadzanego do organizmu, rozkład białek można ocenić na podstawie ilości azotu wydalanego z moczem i potem (ilość azotu traconego wraz z potem jest w normalnych warunkach nieznaczna, zatem azot potu zazwyczaj nie jest brane pod uwagę). Możesz porównać syntezę i rozkład białek, wyznaczając bilans azotowy.
Bilans azotowy to stosunek ilości azotu przyjętego do organizmu i usuniętego z niego. Wyróżnia się następujące rodzaje bilansu azotowego: dodatni, ujemny i bilans azotowy. Dodatni bilans azotowy: pobranie azotu do organizmu przewyższa jego usunięcie z organizmu (zatrzymanie azotu w organizmie). Oznacza to, że synteza białek przewyższa ich rozpad. Zwykle ten typ bilansu azotowego występuje podczas wzrostu ciała, podczas ciąży, rekonwalescencji i przyrostu masy mięśniowej podczas uprawiania sportu. Ujemny bilans azotowy – spożycie azotu jest mniejsze niż jego wydalanie z organizmu. Oznacza to, że synteza białka jest mniejsza niż jego rozkład. Ten typ bilansu azotowego występuje w następujących sytuacjach:
1) głód białka (niedostateczna ilość białka dostaje się do organizmu lub z pożywieniem dostarczane są niekompletne białka. Niekompletne białko nie zawiera jednego lub więcej niezbędnych aminokwasów);
2) upośledzone wchłanianie aminokwasów;
3) starzenie się;
4) choroby lub stany, którym towarzyszy ciężki rozpad tkanek (guzy, wyniszczenie);
5) zmniejszona synteza białek z powodu fermentopatii.
Bilans azotowy – pobór i wydalanie azotu są takie same. Wskazuje na tę samą intensywność syntezy i rozkładu białek (Raguzin A.V., Setko N.P., Shirshov O.V., Fateeva T.A. 2001)
WNIOSEK
Wiewiórki(białka) to złożone wielkocząsteczkowe związki zawierające azot, składające się z aminokwasów. Zestaw i sekwencja aminokwasów w białku charakteryzuje zarówno jego specyficzność biochemiczną, jak i wartość odżywczą. Spośród kilkudziesięciu obecnie znanych aminokwasów 20 znajduje się w produktach spożywczych.
Aminokwasy tworzące białka dzielą się na wymienne i niezbędne. Aminokwasy muszą być dostarczane z żywnością w wymaganych ilościach i w określonych proporcjach. Aminokwasy nieistotne mogą ulegać wzajemnym przemianom w organizmie lub powstawać z niezbędnych w wyniku różnych przemian biochemicznych (reakcje transaminacji, synteza ze związków niebiałkowych z wykorzystaniem amoniaku jako źródła azotu). Do niezbędnych aminokwasów należą arginina, walina, histydyna, izoleucyna, leucyna, lizyna, metionina, tryptofan, fenyloalanina, treonina (arginina i histydyna są uważane za niezbędne dla dzieci poniżej 3 roku życia). Niezbędne aminokwasy: alanina, asparagina, kwas asparaginowy, glicyna, kwas glutaminowy, glutamina, seryna, cystyna, tyrozyna, prolina.
Białka w organizmie człowieka pełnią funkcje życiowe: plastyczne, energetyczne, katalityczne, regulacyjne, ochronne, transportowe, receptorowe.
Zgodnie z fizjologicznymi normami żywieniowymi obowiązującymi w naszym kraju, całkowita ilość białka w diecie dzieci powinna być dwukrotnie większa od ilości zapewniającej bilans azotowy lub bilans azotowy, a dla dorosłych – 1,5 ilości. Dla przedszkolaków - 53-69 g, dla uczniów - 77-98 g, dla dorosłych: dla kobiet - 58-87 g i dla mężczyzn - 65-117 g (w zależności od aktywności zawodowej).
BIBLIOGRAFIA
1. Raguzin A.V., Setko N.P., Shirshov O.V., Fateeva T.A. Fizjologiczne i higieniczne aspekty metabolizmu, metabolizmu energetycznego i racjonalnego odżywiania: Podręcznik do samodzielnej pracy studentów wydziału medycznego i profilaktycznego - Orenburg: Centrum Wydawnicze OSAU, 2001. - 40 s.
2. Fizjologia człowieka / Pod redakcją G.I. Kositsky – M.: „Medycyna”, 1985. – 560 s.
3. Biochemia: podręcznik. dla uczelni / V.P. Komow, V.P. Szwedowa. – M.: Drop, 2004. – 640 s.
4. Przewodnik po zajęciach praktycznych z higieny żywności: podręcznik. podręcznik dla uniwersytetów / Setko N.P., Setko A.G., Fateeva T.A., Volodina E.A., Trishina S.P., Chistyakova E.S.; pod generałem wyd. N.P. Setko. – Orenburg: OrGMA, 2011. – 652 s.
Oznaczanie białka całkowitego w surowicy, osoczu, krwi i innych płynach biologicznych.
Wszystkie znane metody oznaczania stężenia białka całkowitego w surowicy krwi dzielą się na następujące główne grupy:
1.Azotometryczny, polegający na oznaczaniu ilości azotu białkowego – metoda Kjeldahla i jej modyfikacje.
2. Metody oznaczania gęstości surowicy są niedokładne, ponieważ gęstość zależy nie tylko od zawartości białka.
3. Ważenie - białka surowicy krwi wytrąca się, suszy do stałej masy i waży na wadze analitycznej. Metody są pracochłonne i wymagają dużych ilości surowicy.
4. Refraktometryczne - nie idealne, bo część załamania zależy od innych składników serum.
5.Kolorymetryczna – najczęściej stosowana jest metoda biuretowa, która jest ujednolicona.
6. Inne metody - nefelometryczne, polarymetryczne, spektrofotometryczne - nie są powszechnie stosowane.
Krajowy przemysł uruchomił produkcję zestawów do badania stężenia białka całkowitego w surowicy krwi metodą biuretową. Na tej samej zasadzie mierzy się poziom białka całkowitego w płynach biologicznych za pomocą odczynników dostarczanych przez różne firmy.
Oznaczanie białka całkowitego w surowicy krwi metodą biuretową.
Odczynniki.
1,0,9% roztwór chlorku sodu /0,9 g chlorku sodu na 100 ml wody destylowanej/.
2,0,2N roztwór wodorotlenku sodu niezawierający dwutlenku węgla /20 ml 1N wodorotlenku sodu dopełnić przegotowaną wodą destylowaną do 100 ml/.
3. Odczynnik biuretowy: 4,5 g soli Rochelle rozpuszcza się w 40 ml 0,2 N roztworu wodorotlenku sodu, następnie dodaje się 1,5 g siarczanu miedzi i 0,5 g wodorotlenku sodu. Przechowywać w ciemnym szklanym pojemniku, roztwór jest stabilny.
4,0,5% roztwór jodku potasu w 0,2N roztworze wodorotlenku sodu.
5. Roztwór roboczy odczynnika biuretowego: 20 ml odczynnika biuretowego miesza się z 80 ml roztworu jodku potasu. Rozwiązanie stojakowe.
6. Wzorcowy roztwór albuminy z surowicy ludzkiej lub bydlęcej: 10% roztwór albuminy w 0,9% roztworze chlorku sodu /1 ml roztworu zawiera 0,1 g białka - 100 g/l/.
Zasada metody.
Białka reagują w środowisku zasadowym z siarczanem miedzi, tworząc związki zabarwione na fioletowo (reakcja biuretowa).
Procedura oznaczania: dodać 0,1 ml surowicy do 5 ml roztworu roboczego odczynnika biuretowego i wymieszać, unikając tworzenia się piany. Po 30 minutach \i nie później niż po godzinie\ mierzy się FEC w kuwecie o grubości warstwy 1 cm przy długości fali 540-560 nm \filtr światła zielonego\ w stosunku do kontroli.
Kontrola: Do 5 ml roztworu roboczego odczynnika biuretowego dodaje się 0,1 ml 0,9% roztworu chlorku sodu i potraktowano doświadczalnie.
Obliczenia przeprowadza się zgodnie z harmonogramem kalibracji.
Normalne wartości białka całkowitego wynoszą 65-85 g/l.
Budowa wykresu kalibracyjnego.
Odczynnik: mianowany roztwór albuminy 10% w 0,9% roztworze chlorku sodu, którego 1 ml zawiera 0,1 g białka. Do przygotowania odczynnika można użyć liofilizowanej albuminy z zestawu „Bilirubin-standard” firmy Lachem. Instrukcje zestawu wskazują zawartość albuminy w mg. Na tej podstawie obliczamy, ile należy dodać 0,9% chlorku sodu do danej albuminy, aby w 1 ml roztworu otrzymać 0,1 g białka.
Na przykład: Instrukcje zestawu wskazują, że liofilizowana albumina zawiera 160 mg albuminy. Obliczenia: standardowy 10% roztwór zawiera 10 g lub 10 000 mg na 100 ml
w standardzie 160 mg w X
X = 1,6 ml, tj. do butelki zawierającej albuminę dodaj 1,6 ml 0,9% chlorku sodu i sprawdź, że 1 ml tego roztworu zawiera 0,1 g białka.
Po przygotowaniu roztworu wzorcowego przygotowujemy z niego serię rozcieńczeń roboczych według tabeli:
Obliczanie stężenia białka w g/l.
1 ml 10% roztworu wzorcowego zawiera 0,1 g białka
W 1 ml roztworu znajduje się 0,04 g białka
X w 1000 ml
Z każdego roztworu roboczego o odpowiednim stężeniu pobrać 0,1 ml do 3-4 probówek, tj. każde oznaczenie przeprowadza się w 3-4 równoleżnikach i do każdej probówki dodaje się 5 ml odczynnika biuretowego. Po 30-60 minutach przeprowadzić kolorymetryczną analizę FEC w porównaniu z kontrolą. Dla każdego stężenia otrzymujemy 3-4 odczyty gęstości optycznej. Znajdujemy z nich średnią arytmetyczną, po wcześniejszym odrzuceniu znacznie odbiegających odczytów.
Budujemy wykres kalibracyjny: na osi odciętych nanosimy stężenie białka w g/l, tj. 40-60-80-100g\l; a wzdłuż osi rzędnych znajdują się odczyty gęstości optycznej uzyskane przy średniej arytmetycznej FEC.
Krzywa kalibracji powinna wyglądać jak linia pierwotna poprowadzona przez 3 punkty. Krzywą tę bada się na surowicach dawców \co najmniej 3-4 oznaczeń\. Podczas uzyskiwania normalnych odczytów białka, tj. w normalnych granicach; W pracy wykorzystano skonstruowaną krzywą kalibracyjną.
Notatka.
1. Krzywą kalibracyjną należy wyznaczać przynajmniej raz w roku, a także każdorazowo po naprawie i na nowo otrzymanym kolorymetrze fotoelektrycznym.
2. Liniowa zależność pomiędzy gęstością optyczną i stężeniem jest zachowana aż do D=0,5. Jeśli serwatka zawiera większą ilość białka, wówczas serwatkę rozcieńcza się chlorkiem sodu o połowę.
Oznaczanie mocznika we krwi i moczu.
Mocznik jest głównym zawierającym azot produktem katabolizmu białek.
W miarę rozkładu białek gromadzi się amoniak – substancja toksyczna. Głównym sposobem neutralizacji amoniaku jest synteza mocznika w wątrobie. Stężenie mocznika we krwi zależy od szybkości jego powstawania w wątrobie i usuwania z organizmu przez nerki z moczem.
U większości pacjentów szybkość tworzenia mocznika odzwierciedla szybkość wykorzystania i rozkładu białek komórkowych.
W ciężkiej patologii wątroby zdolność hepatocytów do syntezy mocznika jest upośledzona, gromadzi się amoniak i zmniejsza się zawartość mocznika we krwi.
Usuwanie powstałego mocznika następuje z moczem i zależy od funkcji wydalniczej nerek.
Oznaczanie mocznika przeprowadza się następującymi metodami:
1. Chemiczna metoda reakcji barwnej z monooksymem diacetylu.
2. Metoda enzymatyczna (ureaza)
3. Metoda „suchej chemii”.
Oznaczanie mocznika w reakcji z monooksymem diacetylu.
Odczynniki.
1. Monooksym diacetylu i tiosemikarbazyd lub odczynnik w tabletkach.
2. Roztwór wzorcowy lub wzorcowy zawierający 100 mg mocznika w 100 ml lub 1 mg w 1 ml.
Przygotowanie roztworów.
Roztwór odczynnika: rozpuścić 1 tabletkę podczas ogrzewania w kolbie miarowej o pojemności 50 ml w 30 ml wody destylowanej. Po schłodzeniu doprowadź objętość do kreski. Roztwór jest stabilny przez kilka tygodni.
Roztwór kwasu siarkowego: dodać 150 ml wody destylowanej i 25 ml 96% kwasu siarkowego o czystości analitycznej do kolby miarowej o pojemności 250 ml. Po ochłodzeniu podgrzej i doprowadź objętość do kreski. Rozwiązanie jest stabilne.
Przed reakcją przygotowuje się roztwór roboczy odczynnika i kwasu siarkowego w stosunku 1:1 (patrz diagram definicji).
Zasada metody.
Mocznik tworzy czerwony kompleks z monooksymem diacetylu w obecności tiosemikarbazydu i soli żelaza w środowisku silnie kwaśnym; intensywność zabarwienia jest proporcjonalna do stężenia mocznika.
Postęp determinacji.
Odczynniki Doświadczenie Kontroli Standard
1.serum 0,02 - -
2. rozwiązanie robocze
roztwór odczynnika 2,0 2,0 2,0
b\roztwór siarki
kwasy 2,0 2,0 2,0
3. rozmiar standardowy
mocznik - - 0,02
Namoczyć przez 10 minut we wrzącej łaźni wodnej. Studzimy 2-3 minuty pod bieżącą zimną wodą. Kolorymetr najpóźniej po 15 minutach: filtr zielony \przy długości fali 490-540\, kuweta 1 cm, przeciwna kontrola.
Obliczenie: Zanim
X= -------- * C st w mmol\l, gdzie
Do - gęstość optyczna eksperymentu;
Dst - gęstość optyczna wzorcowego roztworu lub wzorca mocznika;
Cst to stężenie mocznika w roztworze wzorcowym;
X to stężenie mocznika w próbce surowicy.
Aby przeliczyć mg% na mmol\l, stosuje się współczynnik 0,1665.
Prawidłowe wartości mocznika w surowicy krwi wynoszą 2,5–8,3 mmol/l.
Notatki
1. Powyższą procedurę oznaczania można modyfikować zwiększając objętości wszystkich odmierzonych roztworów 2-3 razy, w zależności od objętości kuwet.
3. Przeliczenie wartości mocznika na azot mocznikowy można wykonać poprzez pomnożenie przez współczynnik 0,466.
4. Tiosemikarbazyd jest odczynnikiem toksycznym. Pracując z nim, należy przestrzegać zasad pracy z substancjami toksycznymi.
Metody badania metabolizmu białek: Elektroforetyczne – polegające na rozdzielaniu białek w stałym polu elektrycznym, w zależności od wielkości cząsteczki białka. Ultrawirowanie polega na różnym tempie sedymentacji poszczególnych białek w zależności od ich masy cząsteczkowej. Chromatografia: - Chromatografia jonowymienna opiera się na różnej zdolności poszczególnych białek do wymiany z jonami żywic jonowymiennych, - Chromatografia na sitach molekularnych (filtracja żelowa) - na Sephadexie - rozdzielanie białek w zależności od wielkości cząsteczki, - Powinowactwo chromatografia - białka dzieli się na poszczególne w zależności od powinowactwa do powinowactwa (wypełniacz kolumny).
Wysalanie polega na usunięciu powłoki wodnej z dodatkiem soli metali alkalicznych i ziem alkalicznych o różnym stężeniu oraz jonu amonowego. Jest to stara metoda rozdzielania białek. Zastosowanie reakcji barwnych - np. biuret dla białka całkowitego, ksantoproteina dla aminokwasów cyklicznych, intensywność barwy mierzy się kolorymetrycznie. Metody immunologiczne - stosowane do ilościowego oznaczania poszczególnych białek. Podczas interakcji z określoną surowicą odpornościową tworzy się mętny roztwór, intensywność zmętnienia mierzy się kolorymetrycznie.
Przygotowanie pacjentów: Pobieranie krwi odbywa się rano w godzinach 8.00 – 10.00. W nagłych przypadkach krew pobierana jest o dowolnej porze dnia. Krew pobiera się na czczo, po 8-12 godzinach postu. Powstrzymaj się od picia napojów alkoholowych przez co najmniej 24 godziny. Wyklucza się stres fizyczny i pobudzenie emocjonalne, dla których badanemu pozwala się odpocząć przez 15 minut.
Odbiór i przechowywanie materiału biologicznego: Do badań nie nadaje się surowica lub osocze żółtaczki, hemolizowana, chylowa. Aby uzyskać osocze, krew żylną pobiera się do czystej, suchej probówki z antykoagulantem. Sole EDTA, heparyna, heparinian litu, szczawian sodu, cytryniany zaniżają wyniki. Wirowanie przeprowadza się w zwykły sposób nie później niż 3 godziny od pobrania materiału.
Aby uzyskać surowicę krwi, pobiera się krew żylną do czystej, suchej probówki. Wirowanie przeprowadza się w zwykły sposób nie później niż 3 godziny od pobrania materiału. Do badania moczu należy użyć porcji porannej. Badanie przeprowadza się nie później niż 2 godziny po pobraniu próbki.
Warunki przechowywania materiału biologicznego: Materiał biologiczny przechowywany jest w dobrze zamkniętych pojemnikach. Krew pełna nie nadaje się do przechowywania, nawet w obecności konserwantów. Osocze i surowicę można przechowywać 1 dzień w temperaturze pokojowej, 7 dni w temperaturze 4-8 C, od 3 do 6 miesięcy w temperaturze –20 C. W zamkniętych pojemnikach białko jest stabilne w moczu przez 2 dni w temperaturze pokojowej do 17 dni w lodówce (4-8°C).
Uwagi: poziom białka całkowitego może zależeć od wieku (niższy u dzieci i osób starszych), płci (wyższy u mężczyzn) i diety. Zwiększenie stężenia białek we krwi spowodowane jest następującymi czynnikami: długotrwałym przebywaniem w pozycji pionowej, stresem, spożywaniem alkoholu, niektórymi lekami (cefotaksym, furosemid, fenobarbital, prednizolon, progesteron). Do obniżenia poziomu białek we krwi przyczyniają się: urazy, palenie tytoniu, ciąża, post, przerwa w piciu alkoholu, niedożywienie, otyłość, niektóre leki (dekstran, ibuprofen, doustne środki antykoncepcyjne).
Zadanie domowe Pustovalova L.M. Podstawy biochemii dla uczelni medycznych s. 23
