Agliutinacija – tai fiziologiniame tirpale suspenduotų mikrobų arba mikrobų ląstelių dalių sulipimo reiškinys, kai susidaro dribsniai arba smulkūs grūdeliai, kurie nusėda. Yra specifinės ir nespecifinės agliutinacijos. Specifinė agliutinacija vyksta dalyvaujant trims komponentams: agliutinogenui (ląstelių suspensijai), agliutininams (yra imuniniame serume, gautame po šios rūšies mikrobų patekimo į gyvūno ar žmogaus organizmą) ir druskos (), kurių izotoniniame tirpale. reakcija dažniausiai dedama.
Reakcijos aprašymas: mėgintuvėliuose ruošiami serumo skiedimai santykiu 1:50; 1:100; 1:200; 1:400; 1:800; 1:1000 ir daugiau. Į kiekvieną mėgintuvėlį įpilama tiek pat mikrobų suspensijos. Išankstinė reakcijos apskaita atliekama praėjus 2 valandoms po to, kai mėgintuvėliai įdedami į t° 37°; galutinis – kitą dieną po mėgintuvėlių laikymo kambario temperatūroje. Reakcijos rezultatai vertinami plika akimi, naudojant padidinamąjį stiklą arba agliutinoskopą – prietaisą, kuriame per judantį okuliarą sklindančioje šviesoje tiriama mikrobų suspensija ir susidarę gumuliukai ar dribsniai. Teigiamas reakcijos rezultatas paprastai pastebimas didžiausiu serumo praskiedimu, kuriame įvyko ryški agliutinacija. Diagnostinė vertė turi teigiamą reakciją į paciento serumą, praskiedus 1:200 ir daugiau (po to padidėja titras).
Esant pagreitintai agliutinacijos reakcijai (pagal Noble), 0,1 ml penkių milijardų mikrobų suspensijos sumaišoma su tokiu pat kiekiu tiriamojo serumo, praskiedus santykiu 1:10; 1:20; 1:40 ir 1:80 ir 3-5 minutes, įpylus 0,8 ml 0,85% tirpalo, atsižvelgiama į reakciją. Norint nustatyti mikrobo tipą, agliutinacijos reakcija atliekama su agliutinuojančių serumų rinkiniu, kurių kiekvienas gaunamas imunizuojant gyvūną tam tikro tipo mikrobais.
Esant apytiksliai agliutinacijos reakcijai, ant stiklelio užlašinamas lašas tiriamo mikrobo suspensijos ir lašelis specifinio agliutinuojančio serumo santykiu 1:10; 1:20.Abu lašai sumaišomi ir rezultatas pastebimas po kelių minučių.
Kraujo agliutinacija yra raudonųjų kraujo kūnelių, bakterijų ir kitų ląstelių, turinčių antigenus, agliutinacija ir nusėdimas.
Procesas vyksta veikiant agliutininams, kurie yra specifinės medžiagos. Šių medžiagų vaidmuo yra lektinai arba antikūnai.
Galimos agliutinacijos rūšys nustatant kraujo grupę
Agliutinacija yra specifinė ir nespecifinė. Pirmuoju atveju reakcija vyksta dalyvaujant trims komponentams:
- antigenai;
- antikūnai;
- elektrolitų (naudojamas izotoninis tirpalas).
Nustatant kraujo grupę naudojami visi įmanomi agliutinacijos tipai, tačiau tai nėra vienintelis atvejis.
Kokiam tikslui jis naudojamas?
Kraujo agliutinacijos testas naudojamas infekcinės ligos sukėlėjui nustatyti. Tuo pačiu metu jis nusėda ir jį lengva aptikti nuosėdose. Šis procesas naudojamas, kaip minėta aukščiau, ir apie tai bus kalbama toliau.
Kokios yra savybės?
Raudonuosiuose kraujo kūneliuose yra A ir B tipo antigenų, kurie atitinkamai jungiasi su ά ir β antikūnais. Kraujo grupės ir agliutinacijos reakcijos:
- 1, 0 (ά, β) - eritrocitų paviršiuje nėra antigenų;
- 2, A (β) - yra antigenas A ir antikūnas β;
- 3, B (ά) – yra antigeno B ir antikūno ά;
- 4, AB (00) - yra du antigenai, antikūnų nėra.
Verta paminėti, kad antigenai jau yra pastebėti embrione. Kalbant apie antikūnus, jie atsiranda po gimimo, pirmąjį gyvenimo mėnesį.
Žmonių suderinamumas priklauso nuo kraujo grupės. Tai yra priežastis, dėl kurios motinos kūnas atmetė vaisius. Kitaip tariant, ji turi antikūnų prieš negimusio vaiko kraujo antigenus. Tokiu atveju atsiranda nesuderinamumas. Be to, perpilant reikia atsižvelgti į kraujo grupę.
Paruošimas
Kraujo grupės ir agliutinacijos reakcijos yra suderinamos sąvokos, kurios dažnai naudojamos medicinoje.
Prieš atliekant testą, svarbu laikytis tam tikrų nurodymų. Būtina laikinai atsisakyti tam tikrų maisto produktų ir vaistų vartojimo. Tai padės gauti tikslesnius rezultatus. Rekomendacijos, kurių reikia laikytis, nustato gydytojas. Faktas yra tas, kad skirtingose laboratorijose gali būti ne tokie patys gautų verčių diapazonai, tai yra, jie šiek tiek skiriasi.
Testo sąlygos
Kad kraujo grupė būtų nustatyta tiksliai, svarbu pasirinkti tinkamą įrangą. Jie apima:
- ir pipete;
- stiklo strypai;
- standartiniai izohemagliutinuojantys serumai;
- sausos molio plokštės, kurios suskirstytos į 4 sektorius.
Testo sąlygoms keliami reikalavimai:
- dienos šviesa;
- temperatūra kambaryje viršija +16 ˚С;
- kraujo ir serumo tūrių naudojimas santykiu 1:10;
- Patikimi rezultatai gaunami per 5 minutes.
Aukščiau pateikiamos pagrindinės sąlygos ir įrankiai. Kraujo agliutinacija gali būti atliekama keliais būdais, ir kiekvienas iš jų kelia individualius reikalavimus.
Metodai
Galimi kraujo grupės nustatymo metodai naudojant agliutinaciją:
- standartinis metodas;
- kryžminė reakcija;
- tsoliklonų naudojimas;
- greitasis metodas naudojant "Erythrotest-Groupcard" rinkinį.
Standartinis metodas
Kraujo agliutinacija pasireiškia naudojant paciento raudonuosius kraujo kūnelius. Taip pat naudojami standartiniai serumai, kuriuose yra žinomų antigenų.
Ant plokščios plokštelės užlašinamas 1 lašas keturių serumų. Tada stiklinėmis lazdelėmis į jį įvedamas tiriamo paciento kraujas. Šiuo atveju patogu naudoti akių lašintuvus. Santykis turi būti 1:10. Serumas ir kraujas švelniai sumaišomi. Per penkias minutes galite įvertinti.
Testo rezultatų iššifravimas paprastu būdu
Po nurodyto laiko serumo lašeliuose stebimas nušvitimas. Vienuose matosi, kad įvyko eritrocitų agliutinacija (maži dribsniai), kitose jos nėra.
Yra šios parinktys:
- nėra reakcijos visuose serumo mėginiuose – 1 grupė;
- koaguliacija įvyko visur, išskyrus 2 mėginius – 2 grupę;
- jokios reakcijos tik 3 mėginyje – 3 grupė;
- agliutinacija įvyko visur - 4 grupė.
Taigi, svarbiausia tinkamai paskirstyti serumą. Tada iššifruoti rezultatą nebus sunku. Jei kraujo agliutinacija silpna, rekomenduojama pakartotinai tirti. Esant mažiems dribsniams, jie tiriami mikroskopu.
kryžminė reakcija
Kartais paprastu būdu neįmanoma tiksliai nustatyti kraujo grupės. Agliutinacija šiuo atveju atliekama naudojant kryžminės reakcijos metodą. Skirtingai nei pirmojoje testo versijoje, čia svarbūs standartiniai eritrocitai. Paciento kraujas paimamas į mėgintuvėlį, centrifuguojamas, o vėliau serumas pipete išpumpuojamas tolesniam tyrimui.
Jis dedamas ant lėkštės po 2 lašus, tada įpilama standartinių A ir B grupių raudonųjų kraujo kūnelių.Turinys išmaišomas purtant indą.
Kryžminės reakcijos metodo rezultatai
Po penkių minučių mėginiai yra paruošti peržiūrai. Galimos šios parinktys:
- surišimas įvyko abiejuose lašuose – 1 grupėje;
- dribsnių nepastebėta nė viename mėginyje – 4 grupė;
- procesas matomas viename mėginyje – 2 arba 3 grupėse (priklausomai nuo to, kur tiksliai krešėjo kraujas).
Zoliklono metodas
Norint nustatyti kraujo grupę, agliutinacija tokiu būdu atliekama naudojant sintetinius serumo pakaitalus. Jie vadinami tsoliklonais. Juose yra dirbtinių ά ir β-agliutinų pakaitalų, žinomų kaip eritrotestai (atitinkamai rožinės ir mėlynos spalvos). Reakcija vyksta tarp jų ir paciento raudonųjų kraujo kūnelių.
Šis metodas yra tiksliausias ir patikimiausias. Iš esmės tai nereikalauja pakartotinio tyrimo. Rezultatų vertinimas atliekamas taip pat, kaip ir standartinio metodo atveju. Ypatumas yra tas, kad tai būtinai turi patvirtinti reakcija su konkrečiu sintetiniu pakaitalu (anti-AB). Be to, įpylus natrio chlorido tirpalo, jame nesimato lipnumo.
Greitasis metodas su „Erythrotest-Groupcards“ rinkiniu
Atsižvelgiant į galimus analizės metodus nustatant kraujo grupę, verta paminėti, kad šis metodas turi savo ypatybes. Jie slypi tame, kad rezultatą galima įvertinti ne tik laboratorijoje, bet ir lauke. Tyrimui naudojamas specialus rinkinys. Jame yra šulinio kortelė, kurios apačioje jau yra džiovintų reagentų. Be anti-AB, anti-A ir anti-B, Rh faktoriui nustatyti naudojamas anti-D.
Šis metodas nereikalauja specialaus paruošimo, leidžiama naudoti kraują, paimtą iš piršto, konservantų buvimas jame leidžiamas. Pirmiausia į kiekvieną šulinį reikia įpilti lašelį vandens, kad ištirptų ingredientai. Po to įpilamas kraujas, šiek tiek pamaišomas. Rezultatas bus gautas po trijų minučių.
Klaidinga agliutinacija
Kartais po testo gauti duomenys nėra teisingi. Šis reiškinys priklauso nuo tam tikrų veiksnių.
Yra trys klaidingų teigiamų rezultatų tipai:
Pseudoagliutinacija. Tikrasis ryšys nevyksta, eritrocitai tiesiog susilanksto monetų stulpelių pavidalu. Jei įlašinsite porą lašų fiziologinio tirpalo, jie suyra. Panašus reiškinys atpažįstamas ir mikroskopu.
Šalta kraujo agliutinacija. Tokia reakcija stebima, jei tyrimo sąlygos buvo nepalankios. Kai temperatūra žemesnė nei +16 ˚C, gali susidaryti klijavimas.
Panagliutinacija. Jei kraujyje yra infekcija, tyrimo rezultatai gali būti klaidingi. Šis reiškinys galimas ir sergant vėžiu, sergant sepsiu.
Agliutinacija yra labai svarbi medicinoje. Tai leidžia ne tik nustatyti kraujo grupę, bet ir nustatyti ligų sukėlėją, taip pat infekcijų buvimą. Svarbiausia yra laikytis gydytojo rekomendacijų ruošiantis šiai procedūrai. Kalbant apie medicinos personalą, jų užduotis yra sudaryti palankias sąlygas ir laikytis visų taisyklių. Tik taip galima pasiekti tikslių rezultatų atliekant kraujo agliutinaciją.
Agliutinacijos reakcija yra pagrįsta specifine antikūnų (agliutininų) sąveika su ištisomis mikrobų ar kitomis ląstelėmis. Dėl šios sąveikos susidaro dalelės-aglomeratai, kurie nusėda (agliutinuoja). Agliutinacijos reakcijoje gali dalyvauti bakterijos, pirmuonys, grybai, mielės, riketsijos, eritrocitai ir kitos ląstelės, gyvos ir žuvusios. Reakcija vyksta dviem etapais:
- pirmasis yra specifinis antigeno ir antikūno derinys,
- antrasis yra nespecifinis, t.y., susidaro matomas agliutinatas.
Agliutinato nusodinimas vyksta esant elektrolitams, pvz., natrio chloridui. Agliutinate esantys mikroorganizmai išlieka gyvi, bet praranda judrumą.
Agliutinacijos reakcija plačiai naudojama serologinei infekcinių ligų diagnostikai ir izoliuotų mikrobų antigeninei struktūrai nustatyti. Norėdami nustatyti iš paciento ar nešiotojo kūno išskirto patogeno antigeninę struktūrą, naudokite specifinis imuninis serumas gaunamas imunizuojant gyvūnus (triušį, asilą, aviną) tam tikrais mikroorganizmais. Mikrobo identifikavimas atliekamas agliutinacijos reakcijos metu ant stiklo su adsorbuotais arba monoreceptoriniais serumais arba mėgintuvėliuose su specifiniais agliutinuojančiais serumais. Adsorbuotuose serumuose yra antikūnų tik prieš tam tikram mikrobui būdingus antigenus, o monoreceptoriniuose serumuose yra antikūnų tik vienam specifiniam patogeno antigenui. Rūšių serumuose yra antikūnų prieš visus konkretaus mikrobo antigenus.
Išskirtos mikroorganizmo kultūros priklausomybė šiai rūšiai nustatoma agliutinuojant su žinomu serumu iki antikūnų titro, nurodyto serumo ampulės etiketėje. Serumo antikūnų titras laikomas paskutiniu jo skiedimu, kuriame vis dar stebima mikrobų kultūros, naudotos gyvūnui imunizuoti, agliutinacija. Adsorbuoti ir monoreceptoriniai serumai paprastai naudojami neskiesti agliutinacijos reakcijoje ant stiklo.
Nustatant antikūnų buvimą paciento kraujo serume, jis skiedžiamas izotoniniu natrio chlorido tirpalu, praskiedus nuo 1:50 iki 1:800 ar daugiau. Į kiekvieną praskiedimą pridedama gyvų arba nužudytų mikrobų suspensija. Preparatai, kurių sudėtyje yra mikrobų, nužudytų karščiu arba formalinu, vadinami diagnostikos. Kaitinant mikroorganizmų kultūras gautose diagnostikose yra tik somatinių antigenų. Kai naudojamas tik formalinas, mikrobuose išsaugomi ir žvynelių antigenai.
Esant antikūnams paciento kraujyje, reakcijoje paimta diagnostika sulimpa ir į du mėgintuvėlius susidaro nuosėdos (agliutinatas). Šiuo atveju agliutinacijos reakcijos rezultatai laikomi teigiamais. Kontroliniame mėgintuvėlyje, į kurį įpilama izotoninio natrio chlorido tirpalo ir diagnostikos, mikrobų suspensija turi būti vienalytė (neigiama agliutinacijos reakcija).
Kai kurių ligų, pavyzdžiui, leptospirozės, agliutinacijos reakcijos rezultatai apskaitomi tik mikroskopiškai tamsiame mikroskopo regėjimo lauke (mikroagliutinacija). Norint nustatyti serologinę ligos diagnozę, atsižvelgiama į diagnostinę ligą. Paprastai jis atitinka serumo praskiedimą 1:100 arba 1:200.
Antikūnų paciento kraujo serume, naudojant agliutinacijos reakciją, galima nustatyti sergant vidurių šiltine ir paratifu (Vidal reakcija), brucelioze (Wright reakcija), tuliaremija ir kt.
Castellani reakcija. Sergant kai kuriomis infekcinėmis ligomis arba imunizuojant mikroorganizmais, kurių sudėtyje yra grupinių antigenų, kraujo serume, be specifinių šio tipo antikūnų, atsiranda ir grupinių antikūnų. Tokiu atveju susidaręs serumas agliutinuos giminingų bakterijų rūšis.
Castellani pasiūlė grupinių antikūnų adsorbcijos iš imuninių serumų metodą, pagrįstą jų pašalinimu su giminingų rūšių mikroorganizmais, turinčiais grupinių antigenų, bet neturinčių specifinių. Tokių mikroorganizmų kultūra, dedama į serumą, adsorbuoja nespecifinės grupės antikūnus, o centrifuguojant pašalinus antigeno-antikūno kompleksą serume lieka tik specifiniai imunoglobulinai. Serumai, apdoroti Castellani metodu, gali būti naudojami agliutinacijos reakcijoje kaip labai specifiniai.
IN remiantis hemagliutinacijos reakcija slypi eritrocitų agliutinacijos reiškinys, kuris atsiranda įvairių veiksnių įtakoje. Atskirkite tiesioginę ir netiesioginę hemagliutinaciją.
At tiesioginės hemagliutinacijos reakcijos eritrocitai sulimpa, kai ant jų adsorbuojami tam tikri antigenai, pavyzdžiui, virusai.
Serologiniuose tyrimuose naudojama tiesioginė hemagliutinacijos slopinimo reakcija, kai iš paciento išskirtas virusas neutralizuojamas specifiniu imuniniu serumu, o vėliau sujungiamas su raudonaisiais kraujo kūneliais. Hemagliutinacijos nebuvimas rodo viruso ir naudojamo imuninio serumo atitikimą.
Netiesioginė hemagliutinacijos reakcija(pasyvi hemagliutinacija) stebima tais atvejais, kai į eritrocitus, iš anksto apdorotus (įjautrintus) įvairiais antigenais, pridedama imuninio serumo arba paciento serumo, turinčio atitinkamus antikūnus. Vyksta specifinis eritrocitų jungimasis, jų pasyvi hemagliutinacija.
Netiesioginės, arba pasyviosios, hemagliutinacijos reakcija yra pranašesnė už kitus serologinius metodus jautrumu ir specifiškumu, ji naudojama bakterijų, riketsijų ir pirmuonių sukeltų infekcijų diagnostikai.
Netiesioginės hemagliutinacijos reakcijos nustatymo metodas susideda iš kelių etapų. Pirmiausia eritrocitai nuplaunami izotoniniu natrio chlorido tirpalu, po to, jei reikia (naudojant baltyminio pobūdžio antigenus), apdorojami 1:20 000 tanino tirpalu ir įjautrinami tirpiais antigenais. Išplovus buferiniu izotoniniu natrio chlorido tirpalu, eritrocitų antigenas yra paruoštas naudoti. Tiriamasis serumas skiedžiamas izotoniniu natrio chlorido tirpalu mėgintuvėliuose arba specialiose plastikinėse plokštelėse su skylutėmis, po to į kiekvieną serumo skiedimą pridedama eritrocitų diagnostinė medžiaga. Į netiesioginės hemagliutinacijos reakcijos rezultatus atsižvelgiama pagal vamzdelio apačioje susidariusių eritrocitų nuosėdų pobūdį. Teigiamas laikomas reakcijos rezultatas, kai eritrocitai tolygiai padengia visą mėgintuvėlio dugną. Esant neigiamai reakcijai, eritrocitai mažo disko arba „mygtuko“ pavidalu yra mėgintuvėlio dugno centre.
Agliutinacijos reakcija (RA) – tai mikrobų ar kitų ląstelių agliutinacija ir nusodinimas, veikiant antikūnams, esant elektrolitui (izotoniniam natrio chlorido tirpalui). Susidariusios nuosėdos vadinamos agliutinatu. Reakcijai jums reikia:
1. Antikūnai (agliutininai) – yra paciento serume arba imuniniame serume.
2. Antigenas – gyvų ar žuvusių mikroorganizmų, eritrocitų ar kitų ląstelių suspensija.
3. Izotoninis tirpalas.
Agliutinacijos reakcija serodiagnostikai plačiai naudojama sergant vidurių šiltine, paratifu (Vidal reakcija), brucelioze (Wright reakcija) ir kt. Šiuo atveju paciento serumas yra antikūnas, o žinomas mikrobas – antigenas.
Kai nustatomi mikrobai ar kitos ląstelės, jų suspensija veikia kaip antigenas, o žinomas imuninis serumas – kaip antikūnas. Ši reakcija plačiai naudojama diagnozuojant žarnyno infekcijas, kokliušo ir kt.
Ingredientų paruošimas: 1) serumo gavimas, žr. p. 200; 2) antigeno paruošimas. Gyvų mikrobų suspensija turi būti vienalytė ir atitikti (1 ml) apie 30 vienetų. drumstumas pagal GISK optinį standartą. Jo paruošimui paprastai naudojama 24 valandų kultūra, užauginta ant pasvirusios agaro. Kultūra nuplaunama 3-4 ml izotoninio tirpalo, perkeliama į sterilų mėgintuvėlį, nustatomas jo tankis ir, jei reikia, praskiedžiamas.
Užmuštų mikrobų suspensijos – diagnostikos – naudojimas palengvina darbą ir daro jį saugų. Paprastai jie naudoja gamykloje paruoštas diagnostikos priemones.
Reakcijos nustatymas. Yra du šios reakcijos vykdymo būdai: agliutinacijos reakcija ant stiklo (kartais vadinama apytiksle) ir išplėstinė agliutinacijos reakcija (mėgintuvėliuose).
Agliutinacijos reakcija ant stiklo. 2 lašai specifinio (adsorbuoto) serumo ir lašelis izotoninio tirpalo užlašinami ant neriebaus stiklelio. Neadsorbuoti serumai iš anksto praskiedžiami santykiu 1:5 – 1:25. Lašai užlašinami ant stiklo taip, kad tarp jų būtų atstumas. Vaškiniu pieštuku ant stiklo jie pažymi, kur kuris lašas yra. Kultūra atsargiai trinama kilpa arba pipete ant stiklinės, po to įlašinama į lašą izotoninio tirpalo ir vieną iš serumo lašų, kiekvieną maišant, kol susidaro vienalytė suspensija. Serumo lašas be kultūros yra serumo kontrolė.
Dėmesio! Serumo kultūros negalima perkelti į lašelį izotoninio fiziologinio tirpalo, kuris yra antigeno kontrolė.
Reakcija vyksta kambario temperatūroje 1-3 min. Kontrolės serumas turi išlikti skaidrus, o antigeno kontrolėje turi būti vienodos miglos. Jei laše, kuriame kultūra sumaišoma su serumu, skaidraus skysčio fone atsiranda agliutinato dribsnių, reakcijos rezultatas laikomas teigiamu. Jei reakcijos rezultatas yra neigiamas, lašas bus vienodas, kaip ir antigeno kontrolėje.
Reakcija yra aiškiau matoma žiūrint į tamsų foną skleidžiamoje šviesoje. Studijuodami jį galite naudoti padidinamąjį stiklą.
Pailgėjusi agliutinacijos reakcija. Paruošiami nuoseklūs, dažniausiai dvigubi serumo skiedimai. Paciento serumas dažniausiai skiedžiamas nuo 1:50 iki 1:1600, imuninis – iki titro arba iki pusės titro. Agliutinuojančio serumo titras yra didžiausias jo praskiedimas, kuriame jis agliutinuoja homologines ląsteles.
Serumo praskiedimas: 1) sudėkite į stovą reikiamą skaičių vienodo skersmens, aukščio ir dugno konfigūracijos mėgintuvėlių;
2) ant kiekvieno mėgintuvėlio nurodykite serumo praskiedimo laipsnį, be to, ant 1 mėgintuvėlio parašykite patirties numerį arba antigeno pavadinimą. Ant kontrolinių mėgintuvėlių užrašykite „KS“ – serumo kontrolė ir „KA“ – antigeno kontrolė;
3) į visus mėgintuvėlius įpilkite 1 ml izotoninio tirpalo;
4) atskirame mėgintuvėlyje paruoškite pradinį (darbinį) serumo skiedimą. Pavyzdžiui, norint paruošti darbinį skiedimą santykiu 1:50, į mėgintuvėlį supilama 4,9 ml izotoninio tirpalo ir 0,1 ml serumo. Ant mėgintuvėlio turi būti nurodytas jo praskiedimo laipsnis. Pradinis serumo praskiedimas įpilamas į pirmuosius du mėgintuvėlius ir į serumo kontrolinį mėgintuvėlį;
5) paruoškite serijinius dvigubus serumo skiedimus.
Apytikslė jo veisimo schema pateikta lentelėje. 16.
16 lentelė. Serumo praskiedimo schema, skirta panaudotam RA
Pastaba. Rodyklės rodo skysčio perkėlimą iš vamzdelio į vamzdelį; iš 5 mėgintuvėlio ir serumo kontrolinio mėgintuvėlio į dezinfekavimo tirpalą pilama 1,0 ml.
Dėmesio! Visuose mėgintuvėliuose turi būti toks pat skysčio tūris.
Atskiedus serumą, į visus mėgintuvėlius, išskyrus serumo kontrolę, įlašinami 1-2 lašai antigeno (diagnosticum arba šviežiai paruoštos bakterijų suspensijos). Mėgintuvėliuose turėtų atsirasti nedidelis vienodas drumstumas. Serumo kontrolė išlieka skaidri.
Mėgintuvėliai kruopščiai sukratomi ir dedami į termostatą (37°C). Preliminari reakcijos rezultatų apskaita atliekama po 2 valandų, o galutinė – po 18-20 valandų (laikant kambario temperatūroje).
Rezultatų apskaita, kaip visada, prasideda nuo kontrolės. Kontrolinis serumas turi likti skaidrus, o antigeno kontrolinė medžiaga tolygiai drumsta. Mėgintuvėliai apžiūrimi praleidžiamoje šviesoje (labai patogu tamsiame fone) plika akimi, naudojant padidinamąjį stiklą arba agliutinoskopą.
Agliutinoskopas- įtaisas, sudarytas iš tuščiavidurio metalinio vamzdžio, sumontuoto ant stovo. Viršuje yra okuliaras su reguliavimo varžtu. Po vamzdeliu pritvirtintas besisukantis veidrodis. Mėgintuvėlis su tiriamu skysčiu įkišamas iš šono į mėgintuvėlio angą tokiu atstumu, kad jame esantis skystis būtų po okuliaru. Nustatant apšvietimą veidrodžiu ir fokusuojant okuliarą, nustatomas agliutinato buvimas ir pobūdis.
Esant teigiamam reakcijos rezultatui, mėgintuvėliuose matomi agliutinato grūdeliai arba dribsniai. Agliutinatas palaipsniui nusėda į dugną „skėčio“ pavidalu, o virš nuosėdų esantis skystis tampa skaidrus (palyginkite su tolygiai drumstu antigeno kontrole).
Norint ištirti nuosėdų dydį ir pobūdį, mėgintuvėlių turinys šiek tiek pakratomas. Yra smulkiagrūdė ir dribsnių agliutinacija. Smulkiagrūdis (O-agliutinacija) gaunamas dirbant su O-serumu *. Dribsniai (H) – judrių mikroorganizmų sąveikoje su žiuželiniais H serumais.
* (O serume yra antikūnų prieš O (somatinį) antigeną, H serume – prieš žvynelius.)
Flokulentinė agliutinacija vyksta greičiau, o susidariusios nuosėdos yra labai birios ir lengvai skyla.
Reakcijos intensyvumas išreiškiamas taip:
Visos ląstelės nusistovėjo, skystis mėgintuvėlyje yra visiškai skaidrus. Reakcijos rezultatas yra labai teigiamas.
Nuosėdų mažiau, nėra visiško skysčio nušvitimo. Reakcijos rezultatas yra teigiamas.
Nuosėdų dar mažiau, skystis drumstas. Reakcijos rezultatas yra šiek tiek teigiamas.
Nedidelės nuosėdos, drumstas skystis. Abejotinas atsakymas.
Nėra nuosėdų, skystis tolygiai drumstas, kaip ir antigeno kontrolėje. Neigiamas reakcijos rezultatas.
Galimos agliutinacijos reakcijos formulavimo klaidos. 1. Savaiminė (spontaninė) agliutinacija. Kai kurios ląstelės, ypač R formos mikrobai, neduoda vienalytės (homogeniškos) suspensijos, greitai nusėda. Norėdami to išvengti, naudokite S formos kultūrą, kuri savaime neagliutinuojasi.
2. Sveikų žmonių serume yra antikūnų prieš tam tikrus mikroorganizmus (vadinamieji „normalūs antikūnai“). Jų titras žemas. Todėl teigiamas reakcijos rezultatas praskiedus 1:100 ir daugiau rodo jos specifiškumą.
3. Grupinė reakcija su mikrobais, panašiais į antigeninę struktūrą. Pavyzdžiui, ligonio, sergančio vidurių šiltine, serumas taip pat gali agliutinuoti paratifo A ir B bakterijas.Priešingai nei specifinė grupinė reakcija, pasireiškia mažesniais titrais. Adsorbuoti serumai nesukelia grupinės reakcijos.
4. Reikia atsižvelgti į tai, kad specifiniai antikūnai po ligos ir net po skiepų gali išlikti ilgą laiką. Jie vadinami „anamnestiniais“. Norint juos atskirti nuo „infekcinių“ antikūnų, susidarančių dabartinės ligos metu, reakcija įdedama į dinamiką, tai yra tiriamas paciento serumas, vėl paimamas po 5-7 dienų. Antikūnų titro padidėjimas rodo ligos buvimą – „anamnestinių“ antikūnų titras nedidėja, o gali net sumažėti.
Kontroliniai klausimai
1. Kas yra imuninės reakcijos, kokios jų pagrindinės savybės?
2. Kokie komponentai dalyvauja serologinėse reakcijose? Kodėl reakcijos vadinamos serologinėmis, iš kiek fazių jos susideda?
3. Kas yra agliutinacijos reakcija? Jo naudojimas ir metodai. Kas yra diagnostika?
4. Koks antigenas naudojamas tiriant paciento serumą? Koks serumas nustato nežinomo mikrobo tipą?
5. Kas yra O ir H agliutinacija? Kokiais atvejais susidaro flokuliuojančios nuosėdos, o kada smulkiagrūdžiai?
Pratimas
1. Nustatykite išsamų agliutinacijos testą, kad nustatytumėte antikūnų titrą paciento serume ir atsižvelgtumėte į jo rezultatą.
2. Uždėkite agliutinacijos reakciją ant stiklo, kad nustatytumėte izoliuoto mikroorganizmo tipą.
Jei ant porcelianinės lėkštės sudrėkintu paviršiumi užlašinamas lašas serumo, kuriame yra tam tikro agliutinino, ir įlašinamas lašelis kraujo (santykiu 10:1), kurio eritrocituose yra to paties pavadinimo agliutinogeno, tada įvyks agliutinacijos reakcija – eritrocitų agliutinacija. Agliutinacijos reakcija gali būti specifinė (tikroji) ir nespecifinė.
Specifinės agliutinacijos reakcijos apima:
1. Izohemagliutinacija, kurios metu eritrocitų agliutinacija vyksta dėl to paties pavadinimo agliutinino ir agliutinogeno sąveikos. Jis yra stabilus ir turi lemiamą reikšmę nustatant kraujo grupę;
2. Šalta agliutinacija – tai tikra eritrocitų agliutinacija, pasireiškianti esant žemesnei nei +15 °C temperatūrai, dėl šalto agliutinino buvimo serume.
Nespecifinės agliutinacijos reakcijos apima:
1. Klaidinga agliutinacija (pseudoagliutinacija), kai eritrocitai sulimpa į „monetų stulpelius“. Ši reakcija yra fiziologinė ir nepriklauso nuo eritrocitų agliutinacijos savybių. Be to, ilgai stebint, džiūvimas prasideda nuo lašo periferijos ir atsiranda ribinė pseudoagliutinacija. Klaidinga agliutinacija nesunkiai atskiriama nuo tikrosios agliutinacijos įpylus lašelį izotoninio natrio chlorido tirpalo, o pamaišius agliutinacija išnyksta.
2. Panagliutinacija – tai reiškinys, kai kambario temperatūroje kraujo serumas agliutinuojasi su visais eritrocitais, o eritrocitai su visais serumais, net ir su ketvirtos grupės serumu. Šis reiškinys pasireiškia daugeliui pacientų, kuriems pasikeičia kraujo serumo baltymų sudėtis, būtent, kai vyrauja globulinai arba atsiranda makroglobulinų, kurie stebimi esant lėtiniams uždegiminiams procesams (kepenų, inkstų ligos), disproteinemijai, piktybiniams navikams. navikai, hematologinės ligos. Dažniau šios reakcijos viršutinė riba yra +30°C temperatūra (gyvame organizme tokios temperatūros nėra). Panagliutinacija susilpnėja, kai plokštelė 5-6 minutes kaitinama termostate +37°C temperatūroje, o esant +45°C išnyksta panagliutinacijos galimybė.
3. Tomsono fenomenas. Jis atsiranda, kai kraujas yra užkrėstas, tokiu atveju eritrocitus agliutinuoja visi standartiniai serumai. Taip yra dėl bakterijų proteolitinių fermentų, kurie turi savybę aktyvuoti eritrocitų T-antigeną, o su anti-T-agliutininais įvyksta agliutinacija, o jų yra visų žmonių serume. Tokiu atveju agliutinacijos reakcija pašalinama kaitinant plokštę termostate +37°C temperatūroje 5-6 minutes.