הרעיון של שיטות מורכבות של צביעה. שיטות לצביעה של תכשירים מיקרוביולוגיים. צביעת גראם

צביעת ממרח מתבצעת בשיטות פשוטות או מורכבות. פשוטים מורכבים בצביעה של התכשיר עם צבע אחד; שיטות מורכבות (לפי Gram, Ziel-Nielsen וכו') כוללות שימוש רציף במספר צבעים ובעלות ערך אבחון דיפרנציאלי. היחס בין מיקרואורגניזמים לצבעים נחשב למאפיינים טינקטוריים. קיימים שיטות מיוחדותכתמים המשמשים לזיהוי דגלים, דופן תא, נוקלואיד ותכלילים ציטופלזמיים שונים.

בשיטות פשוטותהמריחה מוכתמת בכל צבע אחד באמצעות צבעי אנילין (בסיסי או חומצי). אם היון הצבוע (כרומופור) הוא קטיון, אז לצבע יש תכונות בסיסיות; אם הכרומופור הוא אניון, אז לצבע יש תכונות חומציות. צבעי חומצה - אריתרוזין, חומצי פוקסין, אאוזין. הצבעים העיקריים הם סגול ג'נטיאן, סגול קריסטל, כחול מתילן, מגנטה בסיסית. בעיקר לצביעה של מיקרואורגניזמים, משתמשים בצבעים בסיסיים, הקשורים בצורה אינטנסיבית יותר על ידי הרכיבים החומציים של התא. מצבעים יבשים, הנמכרים בצורה של אבקות, מכינים צבעים רוויים. תמיסות אלכוהול, ומתוכם - הידרו-אלכוהוליים, המשמשים לצביעה תאים מיקרוביאליים. מיקרואורגניזמים מוכתמים על ידי יציקת הצבע על פני המריחה זמן מסויים. צביעה עם פוקסין בסיסי מתבצעת במשך 2 דקות, עם מתילן כחול - 5-7 דקות. לאחר מכן שוטפים את המריחה במים עד שזרמי המים הזורמים הופכים חסרי צבע, מיובשים על ידי ספיגה עדינה בנייר סינון ומבצעים מיקרוסקופ במערכת טבילה. אם המריחה מוכתמת ונשטפת כהלכה, אזי שדה הראייה שקוף לחלוטין, והתאים מוכתמים בצורה אינטנסיבית.

שיטות מורכבותכתמים משמשים לחקר מבנה התא והתמיינות של מיקרואורגניזמים. מריחות מוכתמות עוברות מיקרוסקופ במערכת טבילה. יש למרוח ברצף על התכשיר צבעים מסוימים הנבדלים ביניהם תרכובת כימיתוצבע, חומרי גיהוץ, אלכוהול, חומצות וכו'.

בשיטות צביעה פשוטות משתמשים בצבע אחד בלבד.

לשם כך, בבקטריולוגיה, ככלל, משתמשים בפוקסין מימי או במתילן כחול. שיטות פשוטותכתמים משמשים למיקרוסקופיה אינדיקטיבית, ראשונית - קביעת נוכחות חיידקים בחומר הפתולוגי, קביעת צורתם ומיקומם במריחה.

בשיטות צביעה מורכבות, משתמשים במספר צבעים ברצף מסוים. שיטות כאלה משמשות לזיהוי מיקרואורגניזמים ספציפיים בחומר הפתולוגי, כמו גם לקביעת תכונות המבנה האולטרה שלהם.

1. כתם גראם משמש לקביעת סוג מבנה דופן התא. זוהי השיטה העיקרית בבקטריולוגיה. בהתאם לכתם גראם, כל החיידקים מחולקים לגרם חיובי וגרם שלילי.
2. הכתם Ziehl-Neelsen משמש לזיהוי חיידקים מהירי חומצה (כלומר מיקובקטריות) וכן לגילוי נבגים.
3. כתם Neisser משמש לזיהוי תכלילים ציטופלזמיים של וולוטין ולזיהוי קורינבקטריות (במיוחד פתוגנים לדיפתריה) לפי נוכחותם.
4. כתם Buri-Gins משמש לזיהוי מקפסולות.
5. כתם מורוזוב משמש לזיהוי דגלים. שיטת צביעה זו משמשת גם לזיהוי טרפונמות. בנוסף, הכתם של מורוזוב משמש בווירולוגיה - לגילוי נגיפי אבעבועות שחורות ואבעבועות רוח בשלפוחית ​​אבעבועות שחורות.
6. כתם זדרדובסקי משמש לזיהוי ריקטסיה וכלמידיה.
7. כתם רומנובסקי-גימסה משמש גם יחד עם כתם זדרדובסקי לגילוי ריקטסיה וכלמידיה; בנוסף, שיטת צביעה זו משמשת לאיתור ספירושטים (עם זיהוים לסוג בהתאם לצבע הכתם), וכן לזיהוי פרוטוזואה.

טכניקה לצביעה של חיידקים בחתכים היסטולוגיים לפי Gram-Weigert

1. קטעים דה-פראפין מובאים למים.
2. מוכתם למשך 20 דקות בתמיסה של 1% של פאררוסאנילין או פוקסין בסיסי ב-1% חומצה אצטית(תמיסת צבע מחוממת לרתיחה, מקררת ומסוננת).
3. נשטף ב-3 החלפות של מים מזוקקים.
4. צובעים למשך 5 דקות בסגול קריסטל 1% במים מזוקקים.
5. יש לשטוף במהירות בתמיסת נתרן כלורי 1%.
6. מטופל במשך 30 שניות בתערובת: 1 חלק של יוד + 2 חלקים של אשלגן יודיד + 100 חלקים של מים מזוקקים.
7. להרטיב בנייר סינון.
8. להבדיל על ידי החלת על הקטע תערובת של נפחים שווים של אנילין וקסילן (1 - 2 מ"ל); התמיסות מנוקזות עד שענני הצבע מפסיקים להתרחק מהחתך.
9. בצע באמצעות 3 שינויים של קסילן.
10. סיים במזור או כל שרף מומס בקסילן.

תוצאה: חיידקים גראם חיוביים הם כחול-שחור, פיברין סגול, הגרעינים אדומים.

צביעת חיידקים לפי Ziehl-Neelsen

השיטה משמשת לצביעה של נבגים וחיידקים מהירי חומצה (Mycobacterium tuberculosis). עמידות לחומצה קשורה בנוכחות של דופן תאחומצות מיאקוליות. שיטת Ziehl-Nielsen מבוססת על שימוש בצבעי חימום מרוכזים.

טכניקת צביעה:

1. מורחים נייר סינון לבן על מריחה קבועה ויוצקים פוקסין קרבולי של Ziel. התרופה מחוממת 2-3 פעמים בלהבה עד להופעת אדים.	קרבול פוקסין - צבע בסיסי; חימום-מורדנט.
2. התרופה נשטפת במים, הנייר מושלך.
3. התרופה מוחלשת בתמיסת חומצה גופרתית 5%.	חומצה גופרתית היא גורם מסיר צבע.
4. נשטף במים
5. מסיימים עם הכחול של לפלר למשך 3-5 דקות	כחול לפלר - צבע נוסף
6. לשטוף במים, לייבש, להסתכל מתחת לטבילה	חיידקים ונבגים יצירי חומצה הם אדומים אודם, בעוד שאר המיקרופלורה כחולה.

צביעה לפי Aujeszky

שיטה לצביעה של נבגי חיידקים המורכבת מטיפול בתכשיר בתמיסה חמה של 0.5%. של חומצה הידרוכלוריתלאחר מכן קיבוע וצביעה בשיטת Ziehl-Nelsen; נבגים הופכים לאדום אודם, צורות וגטטיביות הופכות לכחולות.



שיטת המחקר בקטריוסקופית כוללת חקר מיקרואורגניזמים במצב חי או קבוע ומוכתם. כדי לחקור מיקרואורגניזמים במצב חי, משתמשים בשיטת הטיפה המרוסקת ובשיטת הטיפה התלויה.

המיקרוסקופיה הנפוצה ביותר של חיידקים ב קבוע וצבעונימַצָב. להכנת תכשיר קבוע ומוכתם, טיפת מים או פיתרון איזוטונינתרן כלוריד, לתוכו מוצג חומר הבדיקה עם לולאה ומופץ באופן שישיג מריחה דקה ואחידה בקוטר של כ- 1-1.5 ס"מ. אם נבדק חומר נוזלי, הוא מיושם ישירות המגלשה עם לולאה ומריחה מוכנים. המריחות מיובשות באוויר.

ל התחייבותשימוש בשיטות פיזיקליות וכימיות. כדי לתקן את המריחה בשיטה הפיזית, מעבירים את שקף הזכוכית לאט 3 פעמים דרך להבת המבער. מריחות דם, טביעות מריחות של איברים ורקמות קבועים בשיטה כימית על ידי טבעתם למשך 5-20 דקות במתיל או אתיל אלכוהול, תערובת ניקיפורוב ונוזלים מתקנים אחרים.

ל הַכתָמָהחיידקים שיטות פשוטות ומורכבות. בשיטה הפשוטה, מריחה קבועה מוכתמת בכתם בודד, למשל, תמיסה מימיתפוקסין (1-2 דקות) או מתילן כחול (3-5 דקות), נשטף במים, מיובש ומיקרוסקופ. שיטות צביעה מורכבות כוללות שימוש במספר צבעים. זה מאפשר לך לזהות מבני תאים מסוימים ולהבדיל בין סוגים מסוימים של מיקרואורגניזמים מאחרים.

צביעת גראם:

1. תמיסה קרבולית-אלכוהולית של סיגלית ג'נטיאן מונחת על מריחה קבועה דרך רצועת נייר סינון. לאחר 2-3 דקות, הנייר מוסר, והצבע מרוקן.

2. תמיסה של לוגול מוחלת למשך 1-2 דקות.

3. שינוי צבע התרופה אלכוהול אתילילמשך 30-60 שניות עד שזרמי הצבע הסגול מפסיקים לצאת החוצה.

4. שטפו את התכשיר במים.

5. צובעים את המריחה בתמיסה מימית של פוקסין למשך 1-2 דקות, שוטפים במים, מייבשים ומבצעים מיקרוסקופ.

חיידקים גראם חיוביים מכתימים סגול, חיידקים גראם שליליים מכתימים באדום.

מבנה של תא חיידקי

רכיבים מבניים של תא חיידקי מחולקים ל-2 סוגים:

- מבנים בסיסיים(דופן התא, קרום ציטופלזמה עם נגזרותיו, ציטופלזמה עם ריבוזומים ותכלילים שונים, נוקלואיד);

- מבנים זמניים(קפסולה, קרום רירי, דגלים, villi, אנדוספורים, שנוצרים רק בשלבים מסוימים של מחזור החיים של החיידק).

מבנים בסיסיים.

דופן תאממוקם עם בחוץמהממברנה הציטופלזמית. הממברנה הציטופלזמית אינה חלק מדופן התא. תפקידי דופן התא:

הגנה על חיידקים מפני הלם אוסמוטי וגורמים מזיקים אחרים;

קביעת צורת החיידקים;

השתתפות במטבוליזם של חיידקים.

דופן התא מחלחל בנקבוביות שדרכן מועברים אקזוטוקסינים חיידקיים. עובי דופן התא הוא 10-100 ננומטר. המרכיב העיקרי של דופן תא החיידק הוא פפטידוגליקןאוֹ Murein,המורכב משאריות מתחלפות של N-acetyl-N-glucosamine וחומצה N-acetylmuramic מחוברות בקשרים גליקוזידיים.

בשנת 1884 הציע H. Gram שיטה לצביעה של חיידקים בסגול ג'נטיאן, יוד, אלכוהול אתילי ומגנטה. כל החיידקים, בהתאם לכתם הגראם, מחולקים ל-2 קבוצות: חיידקים גרם חיוביים וגרם שליליים. דופן תא של חיידקים גראם חיובייםדבק בחוזקה בממברנה הציטופלסמית, עוביו הוא 20-100 ננומטר. הוא מכיל חומצות טייכואיות (פולימרים של גליצרול או ריביטול), כמו גם כמויות קטנות של פוליסכרידים, חלבונים וליפידים. דופן התא של חיידקים שליליים גרםרב שכבתי, עוביו הוא 14-17 ננומטר. השכבה הפנימית (פפטידוגליקן) יוצרת רשת רציפה דקה. השכבה החיצונית מורכבת מפוספוליפידים, ליפופרוטאין וחלבונים. חלבוני הממברנה החיצונית קשורים היטב לשכבה הפפטידוגליקנית.

בתנאים מסוימים, מחיידקים נשללת היכולת לסנתז באופן מלא או חלקי מרכיבים של דופן התא, וכתוצאה מכך נוצרים פרוטופלסטים, ספרופלסטים וצורות L של חיידקים. ספירופלסטיםהם חיידקים עם דופן התא שנהרס חלקית. הם נראים בחיידקים שליליים גרם. פרוטופלסטיםהם צורות נטולות לחלוטין מדופן התא. הם מיוצרים על ידי חיידקים חיוביים לגרם. צורות L.חיידקים הם מוטנטים חיידקיים שאיבדו באופן חלקי או מלא את היכולת לסנתז דופן התא פפטידוגליקן (חיידקים עם דופן תא פגומה). הם קיבלו את שמם משמו של מכון ליסטר באנגליה, שם הם נפתחו בשנת 1935.

ממברנה ציטופלסמית (CPM) ונגזרותיו.הממברנה הציטופלזמית (plasmolemma) היא מבנה ליפופרוטאין חדיר למחצה של תא חיידקי המפריד בין הציטופלזמה לדופן התא. זה מהווה 8-15% מהמסה היבשה של התא. הרסו מוביל למוות תאים. מיקרוסקופיית אלקטרונים חשפה את מבנה התלת שכבות שלה. הממברנה הציטופלסמית היא קומפלקס של חלבונים (50-75%) וליפידים (15-20%). עיקר השומנים מיוצג על ידי פוספוליפידים. בנוסף, נמצאה כמות קטנה של פחמימות בממברנה.

CPM של חיידקים מבצע את הפונקציות הבאות:

תפקוד מחסום ("מסננת" מולקולרית);

אֵנֶרְגִיָה;

העברה סלקטיבית של מולקולות ויונים אורגניים ואורגניים שונים בעזרת נשאים מיוחדים - טרנסלוקאזים או מארים;

שכפול וחלוקה שלאחר מכן של הכרומוזום.

בתהליך צמיחת התאים, הממברנה הציטופלסמית יוצרת מספר פליגציות (פולשנות), המכונה מזוזומים.

ציטופלזמה -זהו תוכן של תא חיידקי, מוגבל על ידי הממברנה הציטופלסמית. זה מורכב מציטוזול ואלמנטים מבניים.

ציטוזול- חלק הומוגני, כולל רכיבי RNA מסיסים, אנזימים, מוצרים מטבוליים.

אלמנטים מבניים- אלו הם ריבוזומים, ממברנות תוך ציטופלזמיות, תכלילים ונוקלואיד.

ריבוזומים- אברונים המבצעים סינתזת חלבון. הם מורכבים מחלבון ו-RNA. הם גרגירים בקוטר של 15-20 ננומטר. תא חיידקי אחד מכיל 5,000 עד 50,000 ריבוזומים. ריבוזומים הם האתר של סינתזת חלבון.

בציטופלזמה של פרוקריוטות, נמצאים תכלילים שונים, המייצגים את חומרי העתודה של התא. מהפוליסכרידים בתאים מושקעים גליקוגן, עמילן וחומר דמוי עמילן - גרנולוזה. פוליפוספטים כלולים בגרגירים הנקראים וולוטין, או מטאכרומטי, דגנים.

נוקלואידהוא הגרעין של פרוקריוטים. הוא מורכב מגדיל DNA דו-גדילי אחד, סגור בטבעת, הנחשב ככרומוזום חיידקי. לנוקלואיד אין מעטפת גרעינית.

בנוסף לנוקלואיד תא חיידקיהתגלו אלמנטים גנטיים חוץ-כרומוזומליים פלסמידים, שהן מולקולות DNA מעגליות קטנות המסוגלות לשכפול אוטונומי. תפקידם של הפלסמידים הוא שהם מקודדים תכונות נוספות המעניקות לתא יתרונות בתנאי קיום מסוימים. הפלסמידים הנפוצים ביותר הקובעים את סימני העמידות לאנטיביוטיקה של חיידקים (R-plasmids), סינתזה של enterotoxins (Ent-plasmids) או המוליזינים (Hly-plasmids).

ל מבנים זמנייםכוללים קפסולה, flagella, pili, אנדוספורות של חיידקים.

קפסולה -זוהי שכבה רירית מעל דופן התא של חיידק. החומר של הקפסולות מורכב מגדילים של פוליסכרידים. הקפסולה מסונתזת משטח חיצוניממברנה ציטופלזמית ומשתחררת על פני דופן התא באזורים ספציפיים.

פונקציות הקפסולה:

מיקומם של אנטיגנים קפסולריים הקובעים את הארסיות, הספציפיות האנטיגנית והאימונוגניות של חיידקים;

הגנה על תאים מפני נזק מכני, התייבשות, חומרים רעילים, זיהום על ידי פאגים, פעולת גורמי הגנה של המאקרואורגניזם;

היכולת של תאים להיצמד למצע.

פלאגלה -אלו הם איברי התנועה של חיידקים. פלג'לה אינם מבנים חיוניים ועשויים להיות נוכחים בחיידקים או לא, בהתאם לתנאי הגידול. מספר הדגלים ומיקומם בחיידקים שונים אינם זהים. בהתאם לכך, נבדלות הקבוצות הבאות של חיידקים מסומנים:

- מונוטרי- חיידקים עם דגל קוטבי אחד;

- אמפיטרי- חיידקים עם שתי דגלים קוטביים או שיש להם צרור דגלים בשני הקצוות;

- לופוטריקוס- חיידקים שיש להם צרור של דגלים בקצה אחד של התא;

- פריטריך- חיידקים עם דגלים רבים הממוקמים בצידי התא או על כל פני השטח שלו.

ההרכב הכימי של הפלגלה מיוצג על ידי חלבון flagellin.

מבני פני השטח של תא חיידקים כוללים גם villiו שתה. מבנים אלו מעורבים בספיחת תאים על המצע (villi, pili מצוי) ובהעברת חומר גנטי (מין פילי). הם נוצרים על ידי חלבון הידרופובי ספציפי פילין.

בחיידקים מסוימים, בתנאים מסוימים, נוצרות צורות רדומות המבטיחות את הישרדות התאים לאורך זמן ב תנאים שליליים - אנדוספורים. הם עמידים בפני גורמים סביבתיים שליליים.

מיקום הנבגים בתא:

מרכזי (סוכן סיבתי של אנתרקס);

תת-טרמינל - קרוב יותר לקצה (הגורם הסיבתי של בוטוליזם);

טרמינל - בקצה המקל (הגורם הגורם לטטנוס).